专利名称：骨诱导蛋白和多肽的细胞内传递的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及骨诱导蛋白和传递这类蛋白入细胞的方法。更具体地说，本发明涉及骨诱导蛋白，例如LIM矿化蛋白(LMP)、骨形态发生蛋白(BMP)、Smad蛋白、这类骨诱导蛋白和蛋白转导域(PTD)的共轭物、PTD和含有编码骨诱导蛋白的核苷酸序列的PTD和核酸的共轭物；并涉及这些共轭物转导进入细胞。此外，本发明涉及使用PTD/骨诱导蛋白共轭物来促进骨发育和椎间盘的再生。
背景技术：
组织再生是疾病、创伤和外科手术后的愈合过程的一个重要组成部分。在例如疾病或创伤产生骨缺陷，或是当进行例如植入自体移植物或异体移植物、骨桥或骨融合等的外科手术来矫正骨缺陷时，骨再生是复原的中心目标。然而，该目标并非总能实现或容易实现，人们为了取得更新、更有效的方法来促进组织修复和再生已投入了许多研究。
通过建立骨桥来排除关节运动是一种治疗变性脊柱萎缩和关节异常的常规矫形策略。进行该手术的多达45％的患者中出现脊柱融合失败，留下持续疼痛、重复手术、医疗费用和总体治疗性衰竭。
细胞外和细胞内骨诱导蛋白促进骨发育和骨修复并构成治疗用途的潜在靶点。这类蛋白包括BMP和LMP。已显示BMP能在体内刺激骨发育；而LMP特别是LMP-1和LMP-3则对于骨诱导具有更上游效应，如以下事实证明抑制LMP-1表达阻断了通常由糖皮质激素或BMP-6刺激的结节形成。因为它们被认为是“细胞外”蛋白，并通过与细胞表面受体相互作用二起作用，需要高剂量的BMP来在人体内取得一致效果。由于BMP的制造成本通常高，这意味着治疗的费用是过高的。因此，虽然证明BMP具有效力而且是一种可行的骨诱导治疗手段，建立一种更为有成本效益且若是可能更有疗效的替代性疗法是有益的。
LMP向细胞内环境的传递提供了一项吸引人的治疗方案。它可以通过以具有编码LMP的核苷酸序列的质粒转染细胞的途径，或以载有编码LMP的核苷酸序列的病毒载体感染靶细胞来实现。但是这些技术各自都有局限性。质粒转染一般需要分离供转染的细胞，然而转染后移植。病毒传递一般需要位于靶细胞表面上的合适的受体，以便于病毒进入细胞。
骨诱导蛋白和多肽的应用有着巨大潜力，特别是通过细胞内机制的作用对这类蛋白质和多肽的应用。需要的是将有效的胞内骨诱导蛋白和多肽传递至细胞内的方法。
发明概要本发明提供了一种生产细胞渗透性骨诱导多肽的方法，包含以下步骤将编码一种细胞渗透性多肽的表达式构建物导入合适的宿主细胞，并置入一种骨诱导多肽，从而骨诱导多肽表达为具有细胞渗透性多肽的融合蛋白的一部分。表达构建物一般含有一个定位的启动子，引导编码融合产物的多核苷酸序列的转录过程。
表达构建物还可包含一个纯化标记。细胞通过性多肽可选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1和果蝇属Antp多肽。骨诱导多肽可以选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ IDNO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-betal和Smad。
本发明提供的骨诱导多肽选自SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，或它们的组合。
本发明也提供在哺乳动物中诱导骨形成的方法，该方法包括施用有效量的含有蛋白转导域和至少一个骨诱导多肽的融合多肽。融合多肽可作为一种植入物施用或施用于至少一个多能祖细胞，所述祖细胞可植入哺乳动物以促进骨诱导。
本发明也提供一种编码融合蛋白的多核苷酸，包括一蛋白质转导域和至少一个骨诱导多肽，所述蛋白质转导域可选自各种蛋白转导、膜转位和其它由以下物质代表的类似多肽HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1，和果蝇属Antp多肽。骨诱导多肽可选自含有以下物质的组LMP-1，LMP-3，SEQ IDNO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-betal和Smad。
本发明还提供诱导哺乳动物中蛋白聚糖合成的方法。该方法包括施用有效量的融合多肽，该融合多肽包含蛋白转导域和至少一个骨诱导多肽。融合多肽作为一种植入物施用，并且可施于至少一个多能祖细胞。
本发明提供一分离的融合多肽，该多肽包含可操作地连接于骨诱导多肽的膜转位肽。该膜转位肽可选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1，果蝇属Antp多肽；骨诱导多肽可选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-betal和Smad。
本发明提供一种诱导祖细胞中成骨细胞分化的方法，该方法包括对祖细胞施用有效量的融合多肽，该多肽含有蛋白转导域和至少一个骨诱导多肽。该蛋白转导域可以选自以以下物质为代表的组HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1，果蝇属Antp多肽；骨诱导多肽可选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-betal和Smad。
图1显示用LMP-1(感染复数为25的AdLMP-1)处理环隙细胞后6天，培养基中的BMP蛋白质水平。BMP-2和BMP-7的蛋白质水平显著提高，但是BMP-4和BMP-6蛋白质水平与在未经处理的对照细胞的培养基中的蛋白质水平相比无显著升高。每个结果表示为与未经处理细胞的数据的值成比例。报告了7个样本的均值和平均标准误(*p＜0.05 **p＜0.01对NT)图2显示用LMP-1(感染复数为25的AdLMP-1)处理环隙细胞后的BMP mRNA水平的随时间变化过程。BMP-2mRNA水平在AdLMP-1处理后12小时即显著上调，并在AdLMP-1处理后3天达到一个平台。BMP-7mRNA水平在AdLMP-1处理后3天显著上升。每个结果表示为在相同时间点来自未经处理的细胞的值的比值。报通了6个样本的均值和平均标准误(相应时间点**p＜0.01对NT)图3显示用LMP-1(AdLMP-1)处理后用实时聚合酶链式反应(realtime PCR)测定环隙细胞中的聚集蛋白聚糖mRNA水平。在感染复数为25用AdLMP-1处理后6天聚集蛋白聚糖的mRNA水平与未经处理的细胞相比显著升高。在用AdLacZ处理后的细胞内，聚集蛋白聚糖的mRNA水平相对未经处理的细胞未有改变。每个结果表示为来自未经处理的细胞的值的比值。报道了9个样本的均值和平均标准误AdLMP-1MOI25，AdLacZMOI25(**p＜0.01对NT)图4是一个图表，综述了通过PTD/LMP-1融合蛋白对Harlan无胸腺大鼠进行LMP-1施用的参数和结果。
图5是一个图表，概述了通过PTD/LMP-1融合蛋白对新西兰白兔施用LMP-1的参数和结果。
图6是一个图表，概述了通过PTD/多肽融合蛋白对Harlan无胸腺大鼠(和新西兰白兔，见图表中标注)施用骨诱导多肽的参数和结果。
发明详述发明者发现，含有转导多肽和骨诱导多肽的融合蛋白可用于有效促进体内的骨发育和椎间盘再生。因此，本发明提供了用来胞间传递的骨诱导多肽、编码这类骨诱导多肽和蛋白质转导序列的多核苷酸，以及利用这类融合蛋白促进体内的骨发育和椎间盘再生的方法。
过去的工作已证明了LMP剪接变体1和3(LMP-1和LMP-3)具有骨诱导性，而LMP-2并不显示出这种骨诱导潜能。与人类LMP-1(Hlmp-1)氨基酸序列中的94-133氨基酸相应的一条40氨基酸序列常见于LMP-1和LMP-3。发明者于是推测蛋白质的该独特区域可能自身具有骨诱导性潜能。该序列中具有重叠片段经设计和应用，用来检验发明者的假设。他们的结果表明来源于LMP-1和LMP-3的肽具有骨诱导潜力。体内使用时，这些多肽显示出诱导骨形成能力的能力。图6显示了在作为本发明的融合蛋白的一部分、以本发明的方法导入细胞时肽显示了骨诱导性的功能性。
发明者将表达LMP-1的细胞的植入胸脊或腰脊中，用于在无胸腺大鼠中产生实体脊柱融合(solid spine fusion)。这里公开的结果证明LMP-1和LMP-3肽，例如来自SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ IDNO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8的LMP-1和LMP-3肽，也提供LMP-1已显现的骨诱导益处。
骨形态发生蛋白(BMP)一般需要很高剂量以在人体中取得一致效果。LMP-1通过本发明所述的PTD融合蛋白进行的细胞内传递提供了一种更为合算的治疗选择。此外，迄今结果表明LMP-1和LMP相关的骨诱导多肽在细胞内作用，诱导多种因子的级联从而活化天然骨诱导途径。
蛋白转导多肽方便了核酸序列或治疗性蛋白质的摄取和后续表达。字面上，蛋白转导多肽也可作以下叫法，通常这些叫法可互换细胞渗透性肽、蛋白转导域、膜运输序列和膜转位肽。其功能在于通过细胞膜向细胞内以不依赖感受器的方式传递一类可附着肽、多肽或蛋白。利用一种蛋白转导域的融合蛋白可以包含一种或多种可操作地连接于蛋白转导域的肽、多肽或蛋白质。本发明中，这类融合蛋白可包含一个蛋白转导域和至少一个骨诱导肽、多肽、蛋白或它们的组合。这些多肽可用于转导外胚层、间质、或造血来源的自身的、异体的或异种的细胞或组织，并将它们灌注或移植入受体以诱导或帮助新组织的形成。在本发明的方法中，此类多肽有助于摄取可以诱导例如多能祖(干)细胞等细胞的蛋白，例如BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12、BMP-13、聚集蛋白聚糖、胶原I型、胶原II型、多功能蛋白聚糖、光蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖和核心蛋白聚糖等。在此处公开的实验设计和结果中揭示了本发明的有效量的多肽，但也可由本领域技术人员依据此处公开的有效量自行决定。
作为LMP蛋白类的一员，人LIM矿化蛋白-1(hLMP-1)是一种可以增强体内或体外骨矿化效力的细胞间调节蛋白。人HLMP-1这样命名是因为其具有一种特征性结构基序，该基序由通过一个氨基酸间隔连接的两个特殊的锌指构成。LMP剪接变体和其应用在美国专利号6,300,127、6,444,803和6,521,750中有公布。LMP-1、LMP2和LMP3序列也在以上专利中公布。1997年7月22日，在称为pCMV2/RLMP(具有插入物10-4克隆/RLMP的载体pRC/CMV2)载体中10-4/RLMP(LIM矿化蛋白cDNA)的样品存放于美国模式培养物保藏所(ATCC)，(12301 Parklawn Drive，Rockville，Md.20852)，登录号为209153。1998年3月19日，具有插入物HLPM-is人LIM矿化蛋白cDNA)的载体pHis-A的样品存放于ATCC，登录号为209698。
血清型5的腺病毒(Ad5)应用于传递LMP至多种细胞和组织中，包括外周血和骨髓来源的细胞。(Boden，等，“LMP-I的腺病毒传递诱导一致的脊柱融合”(″Adenoviral Delivery of LMP-1Induces Consistent Spine Fusion″)第47属年会，Orthopaedic Research Society，San Francisco，Calif.(2001))。然而，Ad5病毒利用特异性受体(即柯萨奇腺病毒受体或称CAR)，该受体在这类细胞中不存在或数量有限。蛋白质转导穿过细胞膜以利于细胞内传递蛋白质而无受体介导的机制，提供了一种可以替代治疗多种细胞或组织类型的备选手段。
LMP和其它骨诱导蛋白的作用证明它们对于多种组织中具有治疗潜能，例如脑、脊髓、周围神经、骨、软骨、椎间盘、结缔组织、腱和韧带。通过包含以下物质的传递系统，可将LMP传递至各种组织胶原、胶原陶瓷混合物、脱矿物的骨基质，以及天然或合成多聚物，如弹力蛋白、纤维蛋白、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、聚己内酯、聚富马酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚酯、聚醚、聚羟基(polyhydroxyls)和结构植入物。这类基质可以为可注射的、可成型的、固体植入物、结构植入物，或它们的组合。
本发明发明者发现，PTD可以用于传递功能性骨诱导蛋白至细胞中，和用于有效诱导骨形成能力和蛋白聚糖合成。这类细胞渗透性肽输入(CPPI)提供一种传递骨诱导蛋白进入各种细胞类型的方法。一个来源于HIV-1 TAT蛋白的11氨基酸肽链，成功地用于传递骨诱导性蛋白进入细胞。使用pTAT-HA载体能使TAT肽在细菌细胞中超量表达。以能产生具有TAT肽序列以及所需基因产品的融合蛋白方法，可将重组人类基因插入这个载体。此外，PTD/骨诱导多肽可联合聚组氨酸标记(polyHis tag)进行表达，从而益于分离和纯化融合蛋白。PTAT-HA载体和TAT融合蛋白的纯化方案已为Nagahara等人所公布(Nature Medicine.第四卷，1449-1452页，1998年12月)。
在多种PTD中发现的肽序列能以柯萨奇腺病毒受体CAR非依赖性方式便于进入细胞，从而提高对靶细胞的转导效率，并随后降低达到理想效果的核酸或蛋白质的所需量。因此，通过PTD融合蛋白可以获得一种能用于减小治疗费用的治疗工具。
在本发明的一个实施方式中，公开了一种蛋白转导域和一种骨诱导蛋白的融合蛋白。骨诱导蛋白包括，但不局限于LIM矿化蛋白(LMP)、骨形态发生蛋白(BMP)和Smad蛋白。这里使用的“骨诱导蛋白”“骨诱导多肽”和“骨诱导肽”可互换使用来指具骨诱导功能性的不同长度的肽/多肽或是全长蛋白。
具有PTD和LIM矿化蛋白的融合蛋白作为本发明的一个实施方式。融合蛋白可包含一种PTD和一种或多种LIM矿化蛋白或多肽。有用的LIM矿化蛋白包括例如美国专利6,300,127、6,444,803和6,521,750中公开的LMP；申请号为Ser.09/959,578(申请日2000年4月28日)的待授权美国专利中公开的LMP等。优选LMP为RLMP，HLMP-1，HLMP-1s，HLMP-2，HLMP-3或由以上物质衍生的肽链；所述肽链可包括SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，或如SEQ ID NO8中的多肽。
编码LMP的核酸序列优选在标准条件下与以下全长的以以下序列互补的核苷酸分子杂交tcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg；或在高度严格条件下以下全长的以以下序列互补的核苷酸分子杂交gcccccgccc gctgacagcg ccccgcaa；或两者。
所述“标准杂交条件”随探针大小、核酸试剂的背景和浓度、以及杂交类型(原位杂交、Southern印迹或DNA-RNA杂交体杂交(即Northern印迹))的不同而不同。“标准杂交条件”的判定属于本领域的技术水平之内。方法包括，例如美国专利号5,580,775(Fremeau等人)中公布的方法，Southern，J.Mol.Biol.，98503(1975)，Alwine等人，Meth.Enzymol.，68220(1979)，和Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Press，7.19-7.50(1989)。
标准杂交条件的一种设备涉及将印迹置于50％甲酰胺、5X SSPE(150nMNaCl，10mM NaH2PO4[pH 7.4]，1mM EDTA[pH 8.0])、15X Denhardt溶液(每100ml水配20mg Ficoll、20mg聚乙烯吡咯烷酮和20mg BSA)，10％硫酸葡聚糖脂，1％SDS和100μg/ml鲑精DNA中，42℃下预杂交2小时。加入32P标记的cDNA探针，并继续进一步杂交14小时。而后，印迹用2X SSPE、0.1％SDS22℃下洗涤2次，每次20分钟；接着于65℃在0.1X SSPE，0.1％SDS中洗涤1小时。干燥印迹并利用增感屏将印迹暴露于X射线胶片下5天。
在“高度严格条件”下，如果该两个序列基本相同，探针将杂交至其靶序列。在仅仅基本相同序列的条件下杂交而非相同同序列的条件下不杂交的情况可用本领域技术所知晓的技术来判定。
这里使用的“蛋白质”一词包括模拟物，“氨基酸”一词包括L-型、D-型和经修饰的氨基酸。这些替代物可由本领域技术人员施用分子间已知的结构相似性来制得。氨基酸序列也包括任何肽或蛋白质序列，所述任何肽或蛋白质序列可包括所列序列中的附加的氨基酸N端、或C端、或两者。“骨诱导蛋白”一词包括变体、或多肽及全长蛋白质的生物活性的片段。
本领域所熟知的是，单个氨基酸可由一个以上的核苷酸密码子编码，核苷酸序列可经修饰以产生编码相同肽的替代核苷酸序列。因此，本发明的替代实施方式包括含有先前所述氨基酸的替代DNA序列编码肽。含有权项所述的氨基酸序列的DNA序列编码肽链包括DNA序列，该DNA序列编码以下物质的任意组合权项所述的氨基酸序列，其它N端或C端连接至权项所述氨基酸序列的氨基酸。须知氨基酸和核酸序列也可包括多余的残基(特别是N或C端氨基酸、或5’或3’核苷酸序列)；并且只要这样序列赋予其所表达的多肽或蛋白质以骨诱导潜力，该序列实质上即本发明公布的序列。
附加核苷酸碱基可5’或3’连接至编码骨诱导多肽的核苷酸序列，并可与其它DNA序列联合，例如启动子、聚腺苷酸化信号、附加的限制性内切酶位点、多克隆位点、其它编码片段等。这类多肽链之间，肽链全长的变化很大。
应了解，多肽的“变体”并不完全等同于原始蛋白。制备骨诱导多肽或蛋白质的变体例如，通过一个或多个氨基酸的插入、删除或取代来改变氨基酸序列。修饰多肽或蛋白质的氨基酸序列例如，通过取代来构建一种性质与天然肽相比较具有基本相同同或改进的多肽。该取代可以是保守取代。“保税取代”是用另一种其侧链的极性/非极性特性、电荷或大小与其相近的氨基酸，来取代所述氨基酸。20种基本氨基酸可依据以下特性分组具有非极性侧链(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；不带电极性侧链(甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；酸性侧链(天冬氨酸和谷氨酸)；以及碱性侧链(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)。保守取代可包括，例如Asp取代Glu、Asn或Gln；His取代Lys、Arg或Phe；Asn取代Gln、Asp或Glu；以及Ser取代Cys、Thr或Gly。如丙氨酸即常常用于保守取代。
对于本领域的技术人员，变体多肽的制得可以以第二氨基酸就多肽结构的一个或多个位置取代第一氨基酸，从而作用其生物学活性。氨基酸取代可以是，例如诱导多肽中能导致提高生物活性增加的多肽中引起构形变化。
本领域技术人员也能基于氨基酸亲水性指数或水疗法指数在氨基酸序列中的取代。因此，本发明的变体氨基酸分子具有小于100％但至少为55％、并优选至少约80-90％的、相对包含以下氨基酸序列的多肽氨基酸序列的序列同源性或等同性LMP-1，LMP-2，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，或SEQ ID NO 8中所含多肽。因此，该变体骨诱导多肽或蛋白质的氨基酸序列实质对应于原骨诱导多肽或蛋白质核酸序列。这里的“实质对应于”指的是一个多肽序列，它能引发与含有以下序列的骨诱导性多肽或蛋白质产生的生物和酶活性LMP-1，LMP-2，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，或SEQ ID NO 8中所含多肽；这类活性至少70％原骨诱导蛋白相同，并优选其活性高于天然骨诱导蛋白活性的100％。
骨诱导蛋白的变体可包括具有以下序列的骨诱导蛋白所不具有的氨基酸残基LMP-1，LMP-2，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，或SEQ ID NO 8；也可包括相对包含以下序列的骨诱导蛋白的删除LMP-1，LMP-2，LMP-3，SEQ ID NO1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQID NO 7，或SEQ ID NO 8。相对相应的、含有以下序列的蛋白质，所述变体也可以是截断“片段”LMP-1，LMP-2，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，或SEQ IDNO 8；该片段仅仅是全长蛋白或多肽的一部分。
骨形态发生蛋白(BMP)属于TGF-β蛋白超家族。据显示BMP能诱导异位骨或软骨形成。本发明也提供了一种PTD和BMP的融合蛋白。BMP包括有BMP-2，BMP-3，BMP-3b，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8，BMP-9，BMP-10，BMP-11，BMP-12，BMP-13，BMP-14，BMP-15，GDF-1，GDF-3，GDF-8和GDF-9。其中骨形态发生蛋白BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8或BMP-9本发明的方法中尤其适用。
Smad蛋白是介导来自胞外TGF-β有关因子的受体信号的胞内蛋白，通过SMAD蛋白从细胞膜到核的TGF-β信号(Heldin.等，″TGF-[beta]Signallingfrom Cell Membrane to Nucleus through SMAD Proteins″)，Nature，390卷(1997))。Smad蛋白可以通过BMP结合其受体而活化(即磷酸化)。活化时，Smad蛋白转运至调节基因表达的核。本发明也提供了PTD和Smad蛋白的融合蛋白。当作为本发明中具有蛋白转导域的融合蛋白传递时，Smad-1，Smad-2，Smad-3，Smad-4，Smad-5，Smad-6，Smad-7或Smad-8对促进骨诱导尤其有用。
本发明的蛋白转导域可以是任何肽、模拟物或肽核酸(PNA)序列，该序列可横穿细胞的质膜将附着蛋白或伴生蛋白、肽、或核酸传递至细胞外部。发明者已证明骨诱导蛋白可在不损害其促进骨诱导和蛋白聚糖合成能力的前提下，进行细胞内传递(例如作为融合蛋白的一部分)。PTD包括例如以下来源的多肽果蝇同源异型转录因子触角蛋白(Antp)、单纯疱疹病毒(HSV)蛋白VP22、来自生长因子(如Kaposi成纤维生长因子(K-FGF)(Lin等，J.Biol.Chem.，Vol.270，p.14255-14258，1995))的信号肽序列、一种来自K-FGF信号肽序列的膜转位序列(Rojas等，Nat.Biotech.，Vol.16，p.370-375，1998)，和人免疫缺陷病毒(HIV)-1转录激活剂TAT(Fawell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，p.664-668，1994)。PTD公开于美国专利5,652,122和Schwarze.等，“蛋白质转导不受限制的传递入所有细胞中”(″ProteinTransductionUnrestricted Delivery into all Cells″)，Trends in CellBiology，Vol.10(2000)。本发明发明者发现HIV-TAT PTD在本发明中尤其有用。
本发明还提供一种核酸，所述核酸含有编码可操作地连接于启动子的融合蛋白的核苷酸序列，其中的融合蛋白包含蛋白转导域(PTD)和骨诱导蛋白。核酸可以是一个载体(例，一个表达载体如质粒)的一部分。骨诱导蛋白可包括如LMP，BMP，Smad蛋白和骨诱导肽和多肽。骨诱导肽和多肽的例子包括SEQID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO 7，and SEQ ID NO 8。
本发明还提供传递骨诱导蛋白至细胞的方法。在本发明的方法中，至少一种骨诱导蛋白可以通过融合蛋白的转导传递至细胞，该含有一蛋白转导域(PTD)和一骨诱导蛋白的融合蛋白与细胞接触，从而将该融合蛋白传递至细胞内，该传递通过PTD或细胞渗透性肽易化。
骨诱导蛋白可传递入的细胞包括例如骨(即骨形成)细胞和非骨细胞，这种细胞可包括，例如血沉棕黄层(buffy coat)细胞、干细胞(如间充质干细胞和多能干细胞)、椎间盘细胞(如纤维环细胞和髓核细胞)、间充质细胞、造血细胞、内皮细胞和肌细胞。
还提供了用或者表达的蛋白转导域(PTD)和骨诱导蛋白转导细胞。这种细胞可包括，但不限于血沉棕黄层细胞、干细胞(如间充质干细胞和多能干细胞)、椎间盘细胞(如纤维环细胞和髓核细胞)、间充质细胞、造血细胞、内皮细胞和肌细胞。干细胞可来源于自体或同种异体的组织。如本文所述，含有PTD和骨诱导蛋白的融合蛋白的细胞，可以植入哺乳动物中来诱导骨形成能力。采用LMP作为骨诱导蛋白来诱导骨形成能力的方式公布于美国专利No.6,300,127。依据美国待批准专利No.10/292,951(2002年11月13日提交)中列出的内容，含有PTD和骨诱导蛋白的融合蛋白的细胞也可移植入椎间盘中，刺激蛋白聚糖和/或胶原合成。
本发明同样涉及PTD和核酸的共轭物，所述共轭物含有编码骨诱导蛋白的核苷酸序列。该PTD/核酸共轭物可用来指导骨诱导蛋白的超表达，以促进如骨形成或椎间盘再生等。核苷酸序列编码的骨诱导蛋白可包括，但不局限于，LMP、BMP、Smad蛋白。化学连接肽联至核酸的方式为本领域所熟知。一个此类方式公布于美国专利5,652,122。核酸可以是一种包括有一个编码可连接启动子的骨诱导蛋白核酸序列表达载体的形式。
本发明的方法可用于诱导一种或多种BMP或TGF-β蛋白表达于一种公布于待批准美国专利10/382,844(申请日2003年5月7日)中的细胞。例如依据本发明，选自群的一种或多种蛋白的表达，可通过接触具有PTD/骨诱导蛋白融合蛋白来诱导BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-β1，及其组合。本发明同样备选地提供一种细胞，该细胞超表达选自以下物质组群的一种或多种蛋白BMP-2，BMP4，BMP-6，BMP-7，TGF-β1及其组合。所述细胞可以是任何体细胞，后者包括但不局限于，干细胞、白细胞(buffy coat cell)、骨髓细胞、外周血细胞、或脂肪细胞。该细胞可以是源自自身或异体组织的干细胞。
在肾脏中，细胞也可经刺激通过本发明所述PTD/LMP融合多肽的施用来产生BMP-7；也可对干细胞施加PTD/LMP融合多肽，诱导其表达BMP-7。一旦移植入肾脏内，它们产生的BMP-7可产生先前通过给予外源BMP-7未曾达到的治疗效果。BMP-7诱导严重受损的肾小管上皮细胞的修复，同慢性肾损伤的逆转相关(Zeisberg等，Nat.Med.9964-968，2000)。据记载通过BMP-7施用，在鼠类身上成功治愈了骨衰病(adynamic bone disorder)——慢性肾病的一种并发症。(Lund等，J Am Soc Nephrol15(2)359-369，2004)。在鼠类慢性肾损伤或纤维化的基因模型中，外源人类重组BMP-7提高了肾机能和存活率(Zeisberg等，Am J Physiol Renal Physiol285(6)F1060-7，2003)。BMP-7也经证明能局部逆转糖尿病引发的肾肥大(Wang等，Kidney Int63(6)2037-2049，2003)。Davies等人证明了在慢性肾衰竭中，BMP-7缺陷是一种病理生理因素(J Am Soc Nephrol14(6)1559-1567，2003)。这些研究结合以下这些发明家们的发现——如LMP-1诱导细胞产生BMP-7的发明、LMP肽(SEQID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO 7，和SEQ ID NO 8)通过LMP-1蛋白的相似方式发挥功能——证明了含有一个蛋白转导域和一个LMP-7或LMP-3蛋白或相关肽链的融合多肽，能在肾病治疗中发挥益处。通过本发明的融合多肽诱导以使其表达BMP-7的干细胞，对于所述目的尤其适用。
BMP-4和BMP-7也证明能抑制骨髓瘤细胞增殖并诱导骨髓瘤细胞调亡。BMP的治疗用途建议用于骨髓瘤疾病和骨髓瘤细胞生长。本发明的方法提供一种方法，通过以注射、植入或干细胞移植(所述干细胞已用PTD/LMP融合多肽处理)，将LMP-1、LMP-3或含有以下序列的多肽的进行施用，刺激BMP-4和BMP-7两者在体内的产生SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ IDNO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。干细胞植入物同PTD/LMP源(例如可植入药物投递装置)的混合物尤其有效。
干细胞或多能祖细胞可以提供能产生成骨细胞的细胞源。这些细胞可在其不同的分化阶段分离，并诱导其分化进入特异的谱系途径。该细胞可用于治疗骨疾病，例如骨质疏松或骨脆症(osteogenesis imperfecta)以及骨折不愈。着丝粒结合因子α1(Cbfa1)是骨形成能力所必须的。BMP-2、BMP-4和BMP-7，公认为能够诱导成骨细胞分化、高级调控Cbfa1表达。BMP-8 Smad-3在成骨细胞分化时被高级调控。TGF-β/BMP-Smad信号的活化经证明，能促进Cbfa1表达和成骨细胞分化。本发明提供含有功能性BMP、LMP、Smad蛋白或其组合物的融合蛋白，以促进成骨细胞在人类骨髓来源的中胚层祖细胞中的分化。优选细胞包括有，多能细胞如Jiang等人(Nature，Vol.418，p.41-49，2002)所提到的。优选的骨诱导蛋白或多肽的、或其组合的施用，可在植入前用先体外后体内的方式操作，或在植入或注射之后于体内进行。
因为体内施用时，本发明的骨诱导蛋白可注射于靶位，从而蛋白能通过如PTD或细胞可透过性肽等传递至邻近细胞的内部。也可使用一种包含一载体以及以PTD/骨诱导多肽的植入体。植入物可具有贮备结构，能放置PTD/骨诱导多肽，以释放至周围组织；或也可包括一多孔组合物，该组合物已浸润在含有一种或多种PTD/古诱导多肽构建物的溶液中。水凝胶、缓释胶囊或缓释粒、脂质体、微粒体、纳米粒、生物可降解聚合体，也可使用其它类似药物投递系统来投递本发明的肽和蛋白至靶细胞和组织。美国专利6475516(DiCosmo等)中，提供了一种载有脂质体治疗剂(例如抗体)的水凝胶，该水凝胶共价连接于一种内置医学设备(如植入物)的表面。
椎间盘再生的标志即其中的蛋白聚糖的产量降低，尤其是其中的硫酸化糖胺聚糖(sGAG)和聚集蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖是椎间盘的主要蛋白聚糖，其产量的减小是椎间盘退化的一个重要因素。因为蛋白聚糖在椎间盘功能中所扮演的这一关键的角色，蛋白聚糖正常产量的修复对于任何椎间盘退化的生物治疗都相当重要。
发明者所做的实验证明了，在体内和体外，LMP-1的超表达或细胞间施用能提高椎间盘细胞的蛋白聚糖产量。LMP-1超表达诱导BMP-2和BMP-7mRNA在体内外的高度调控。头蛋白特异性抑制这些BMP-2和BMP-7、抑制AdLMP-1对聚糖蛋白的高级调控，从而证明LMP-1诱导的蛋白聚糖的高级调控通过BMP高级调控来介导。因此，LMP-1通过基因治疗或蛋白质治疗(例如PTD共轭物的传递)的高级调控可用于刺激蛋白聚糖在椎间盘中的产量，并对椎间盘有着治疗作用。
如TGF-β1，IGF-1和EGF等的细胞因子经显示能刺激椎间盘细胞有丝分裂和(某种程度上的)蛋白聚糖产量。其它细胞因子例如BMP-2和BMP-7等经显示能有效刺激蛋白聚糖的产生。因为细胞因子是微小的水溶性分子，但却会迅速自椎间盘扩散或由于其它调控因子而失活。LIM矿化蛋白-1(LMP-1)是一种细胞间调控分子，已知其能诱导多种不同BMP的分泌自白细胞(leukocyte)或成骨细胞。通过将LMP-1、LMP-2、LMP-3，或源于LMP-1或LMP-3或其组合的骨诱导性肽，传递至细胞，尤其是通过PTD/核酸共轭物，BMP的产量可以从细胞内激发。优选的骨诱导肽包括，如SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7或来自SEQ ID NO 8的多肽等。
本发明可通过参考以下非局限性实施例进一步充分理解。
实施例下面描述了(His)6TAT-LMP蛋白缀合物的合成和用途，包括HIV-Tat和LMP-1蛋白的蛋白转导域。经华盛顿大学(St.Louis，MO)的材料转移协议获得了pTAT-HA-载体。
通过用pCDNA3.1/hLMP-1作为PCR的模板在hLMP-1的5’端添加NcoI限制性位点，该PCR的引物如下
正向5’-CCATGGAflCCflCAAAGTAGTGC-3’反向5’-CAGGGCGGGCGGCTGGTAG-3’反应按如下进行95℃，2分钟。[95℃，30秒；66℃，30秒；72℃，1分钟(mm)]×25，和72℃，10分钟。将PCR产物克隆入PCRII-TOPO载体(Invitrogen)，通过测序鉴定合适的克隆。
通过用NcoI和ClaI对质粒克隆进行限制性内切酶消化，和用琼脂糖凝胶电泳和电洗脱纯化所得的产物来完成(His)6TAT-LMP载体的构建。用ClaI和EcoRI对pCDNA3.1/hLMP-1载体进行限制性消化，和用琼脂糖凝胶电泳和电洗脱纯化所得的产物来分离全长hLMP-1序列。还用NcoI和EcoRI对pTAT-HA-载体进行限制性消化，用琼脂糖凝胶电泳和电洗脱来纯化所得的线性载体。然后用标准程序将产物16℃连接过夜。用随后的琼脂糖凝胶电泳和分子量测定来确定正确连接的产物(5′hLMP-1+3′hLMP-1+线性化的pTAT-HA-载体＝(His)6TAT-LMP载体)。
将连接产物转染入BL21(DE3)感受态细胞中，用限制性分析鉴定合适的克隆。
(His)6TAT-LMP蛋白的合成和收获将含有(His)6TAT-LMP融合构建物的阳性克隆的合适的BL21(DE3)大肠杆菌菌落生长到0.8OD(600nm)，用100μM IPTG 37℃4小时诱导蛋白质产生。用标准方法收获诱导的细胞，用超声处理(4×20秒，各2分钟静止时间，4℃)裂解细胞(20mM PO4缓冲液，pH 7.2，8M尿素，100mM NaCl，20mM咪唑)。
离心(10000xg)使裂解液澄清，在重力流条件下将所得的上清液加到Ni2+琼脂糖凝胶亲和柱(Invitrogen)。洗涤柱(20mM PO4缓冲液，pH 6.0，8M尿素，250mM NaCl，20mM咪唑)，然后洗脱结合的蛋白(20mM PO4缓冲液，pH 4.0，8M尿素，500mM NaCl)。
从0％缓冲液B至100％缓冲液B(40分钟5毫升/分钟)的线性梯度(缓冲液A20mM碳酸钠，pH 11，8M尿素；缓冲液B20mM碳酸钠，pH 11，8M尿素，2M NaCl)将洗脱液进行阴离子交换层析(Hitrap Q HP，5mL，Pharmacia)。用SDS-PAGE和Western印迹分析来分析洗脱组分(5mL)中hLMP-1的存在。
将hLMP-1的阳性组分进行疏水作用层析(Hitrap(R)苯基琼脂糖凝胶，5mL，Pharmacia)。用0％-100％缓冲液B 20分钟，5毫升/分钟的线性梯度进行洗脱(缓冲液A20mM碳酸钠，pH10.51.5M硫化铵；缓冲液B20mM碳酸钠，pH10.5)。用SDS-PAGE和Western印迹分析来分析洗脱组分(5mL)中hLMP-1的存在。将(His)6TAT-LMP融合蛋白的阳性组分冻干直至使用。
(His)6TAT-LMP融合蛋白在从头骨形成中的用途将冻干的组分(55pg)重悬于40mM KOH(贮液；1.0μM)中。如Viggeswarapu，等，J.Bone Joint Surg.，83(3)，364(2001)所述制备人血沉棕黄层(buffy coat)细胞。这些细胞在αMEM(Gibco)中与5μL(His)6TAT-LMP融合蛋白混合，37℃孵育30分钟。
然后将含有(His)6TAT-LMP融合蛋白的合适体积的人血沉棕黄层细胞加到多孔胶原基质用于植入。为了证明体内从头骨形成，用无菌移液管将100μL细胞悬液加于5×5mm的I型胶原盘上(disc)用于植入大鼠。将相似数量的细胞悬液加于10×25mm的片(sheet)上用于植入以促进脊柱融合。用外科手术将盘皮下植入4-5周龄无胸腺大鼠的胸/腹(rnu-/rnu-)。在第4周致死动物，此时将盘切开，在70％乙醇中固定，用放射显影和未脱钙组织学检查(制成5μm切片，用Goldner Trichrome染色)。
在兔子中，进行了后外侧腰脊柱的关节融合术，植入了载体基质(即，含有15％羟磷灰石/85％磷酸三钙的胶原海绵)，每侧脊柱接受4×106转导的血沉棕黄层细胞。4周后，无痛致死兔子，切开它们的腰脊柱。用盲法手触移动节段以检测残留的移动(未融合的指示)、放射显影、CT扫描和未脱钙组织学来评估脊柱融合状态。
在大鼠和兔子中，放射显影揭示了高水平的矿化骨形成，与含有LMP-1转染的人血沉棕黄层细胞的原始的胶原盘或片相一致。在对照中未观察到矿化骨形成，原始的胶原盘或片似乎正在吸收。在对照中，组织学揭示了LMP-1转导的植入物中衬以成骨细胞的新的骨小梁，但未看到骨，载体被部分再吸收。
利用骨诱导性肽诱导体内骨形成方案基本与上述相同。将肽加于4个单独的植入物(对于兔子为3个)，250微升每盘，6M/ml。植入物含有胶原盘。将植入物置于Harlan无胸腺大鼠或新西兰白兔的胸内。测试的剂量范围是5nm，10nm，12.5nm，15nm，17.5nm，20nm，22.5nm，和25nm。结果示于图6。
sGAG合成的LMP-1刺激来自Sprague-Dawley大鼠的腰锥间盘细胞的体外实验按如下进行用不同剂量的(感染复数0，5，10，25，50)含有LMP-1核酸序列插入物(AdLMP-1)的腺病毒处理细胞，单层培养6天以测定LMP-1体外过表达的效果。用DMMB方法定量培养基中的硫酸糖胺聚糖(sGAG)水平。用实时PCR定量蛋白聚糖、过表达的LMP-1、BMP-2，4，6和7的mRNA水平。用直接的ELISA方法定量培养基中的BMP-2，4，6和7的水平。为了证明BMP参与锥间盘细胞蛋白聚糖产生的LMP-1上调，将一种特异性阻抑BMP-2，4，6和7活性的分子(头蛋白)(noggin)以不同浓度加入AdLMP-1处理的细胞中。
体内基因治疗实验在新西兰白兔中进行。用AdLMP-1(实验)或携带标记基因(AdLacZ-对照)的腺病毒以三种不同剂量(106，107，和108噬菌斑形成单位/盘)注射腰盘。三周后，收获注射的盘，检测总LMP-1(内源)，过表达的LMP-1，蛋白聚糖，BMP-2和BMP-7的mRNA水平。感染复数为25的AdLMP-1足够诱导sGAG上调的最高水平。需要单层培养6天的时间来达到AdLMP-1处理(MOI 25)后sGAG上调的最高水平。与对照相比，蛋白聚糖mRNA增加了2倍。当细胞在藻酸盐中培养时，AdLMP-1处理对sGAG产生的影响可维持3周。AdLMP-1处理后6天，BMP-2和BMP-7的mRNA水平分别显著增长为对照的3.0±0.2和2.8±0.3倍(p＜0.01)。BMP-4和BMP-6mRNA水平未变。培养基中BMP-2和BMP-7的蛋白水平与对照相比显著增加(p＜0.01)。相反，BMP-4和BMP-6蛋白水平未升高。3200ng/ml的头蛋白完全阻抑了AdLMP-1对蛋白聚糖的上调。检测了腰髓核(nucleus pulposus)中的LMP-1 mRNA的内源水平。与对照相比，用107噬菌斑形成单位/盘AdLMP-1注射的体内锥间盘的LMP-1，BMP-2，和BMP-7的mRNA水平显著升高。
用Sprague-Dawley(SD)大鼠腰盘细胞进行体外实验。用两种尾状斯氏t测验来比较实验组和对照组。图中的误差条表示1个平均标准误差(SEM)。
采用了携带人LMP-1基因cDNA的复制缺陷的5型腺病毒(AdLMP-1)。以只对病毒输送的LMP-1 cDNA特异性的引物，用实时PCR方法进行了SD环隙细胞的单层培养实验，以确定病毒剂量和过表达LMP-1mRNA表达之间的关系。进行了SD环隙细胞的单层培养实验，以确定病毒剂量和sGAG产生之间的关系。用DMMB方法测定了sGAG水平。将最佳的AdLMP-1剂量定义为导致sGAG产生的平台水平的最低剂量。用最佳剂量(25MOI)，进行了时间过程(time-course)实验(9天)以确定达到sGAG产生的平台水平的必需最小时间长度(6天)。用以上确定的最佳病毒剂量和时间(25MOI的AdLMP-1，处理后6天)将AdLMP-1处理的环隙细胞的蛋白聚糖mRNA水平与对照比较。为了确定核细胞以类似于环隙细胞的方式响应，测定以25MOI处理环隙细胞和核细胞后6天，AdLMP-1对sGAG产生和细胞数目的影响。为了研究AdLMP-1处理的更长期效果，在1、2和3周测定了藻酸盐中培养的SD环隙细胞的藻酸盐中的sGAG积累。所有实验最少重复2次。
用MOI 25的AdLMP-1进行SD环隙细胞的单层培养实验。简言之，AdLMP-1处理后0.5，1，3，和6天用实时PCR分析检测LMP-1，BMP-2，BMP-4，BMP-6，和BMP-7的mRNA水平。处理后6天用直接ELISA方法在培养基中检测BMP-2，BMP-4，BMP-6，和BMP-7的mRNA水平。为了测定阻抑BMP活性的效果，在AdLMP-1处理的开始将头蛋白加入到培养基。在6天的实验中，测定了AdLMP-1处理后有或无各种浓度的头蛋白时sGAG水平的变化。
为了测定给予LMP-1(通过AdLMP-1)对蛋白聚糖，BMP-2和BMP-7的体内效果，使用4只新西兰白(NZW)兔(3-4kg)。用左腹膜后方法将前腰盘L2/3，L3/4，L4/5，和L5/6暴露。以交替方式(即，在各兔子中，两个盘用AdLMP-1注射，两个盘用AdGFP注射)将107噬菌斑形成单位(噬菌斑形成单位)的实验病毒(AdLMP-1)或对照病毒(有绿色荧光蛋白cDNA的AdGFP-5型腺病毒作为插入物)注射入各个暴露的盘核中。通过30G Hamilton注射器在10微升磷酸盐缓冲盐水中输送来给予病毒。3周后，收获来自注射的腰盘的髓核组织。将来自2只兔子的核组织合并入对照或实验腰盘组中以获得足够的mRNA用于进一步分析。用反转录和实时PCR定量总LMP-1，BMP-7和蛋白聚糖的mRNA水平。设计总LMP-1的引物以鉴定内源和过表达的LMP-1。
在第二种体内论证中，用各种剂量的AdLMP-1病毒来建立剂量响应关系。给予3种不同剂量的AdLMP-1(106、107、108噬菌斑形成单位)和单一剂量(107噬菌斑形成单位)的AdGFP。在这个实验中，用单一剂量的病毒代替以前实验中的交替病毒型注射各动物的所有腰盘。用8只NZW兔(3-4kg)，4个病毒组各2只兔子。3周后无痛致死兔子，收获髓核。混合从各处理组内收获的组织，分离mRNA并用于产生相应的cDNA。用实时PCR定量总LMP-1，过表达的LMP-1，BMP-2，BMP-7，和蛋白聚糖的mRNA水平。
以不同剂量(MOI 0，10，25，and 50)病毒处理后12小时的过表达LMP-1mRNA的相对量标准化到过表达LMP-1 mRNA(AdLMP-1 MOI 5)的最低可检测水平。
增加AdLMP-1的剂量导致与MOI5相比过表达LMP-1mRNA的统计学显著增加。未处理对照或AdLacZ对照组中未发现过表达LMP-1mRNA的可检测水平，表明环隙细胞中AdLMP-1以剂量依赖方式诱导LMP-1过表达。
不同剂量的AdLMP-1处理后6天测定环隙细胞培养基中的sGAG浓度。第6天培养基中的sGAG浓度是在更换培养基和测定sGAG之间的3天中细胞产生的总sGAG的量度，因此是那段时间中sGAG产生速率的量度。数据表示为处理和未处理对照间的比率。给予LMP-1(通过AdLMP-1，MOI 25)提供最高的sGAG水平，是对照sGAG水平的3.1±0.2倍(p＜0.01)。以MOI 25或MOI 50处理的细胞的培养基中，sGAG水平没有显著差别。因为MOI 25的AdLMP-1剂量是可达到最大sGAG响应的最低剂量，所以发明人选择MOI 25作为以后实验的工作剂量。
进行了时间过程实验，以测定用MOI 25 AdLMP-1处理后改变实验长度的效果。用LMP-1(AdLMP-1，MOI 25)处理环隙细胞，检测3天中sGAG产量的增加。用各时间点的DNA含量将结果标准化，并表示为与相同时间点的未处理对照的比率。第3天sGAG水平增加到1.6±0.2(p＜0.01)，第6天增加到2.9±0.1(p＜0.01)，第9天增加到2.8±0.1(p＜0.01)。第6天和第9天之间未观察到sGAG水平的增加，表明到第6天达到了平台水平。
蛋白聚糖合成的LMP-1诱导因为蛋白聚糖是锥间盘的主要蛋白聚糖，所以AdLMP-1处理后6天检测了蛋白聚糖核心蛋白mRNA的水平。使用定量实时PCR方法，数据表示为与未处理对照的比率。AdLMP-1处理(MOI 25)后，蛋白聚糖mRNA水平是对照的2.1±0.1(p＜0.01)倍。AdLacZ处理(MOI 25)后，蛋白聚糖mRNA水平没有变化，是对照的1.0±0.16倍。这些结果，以及sGAG实验，证明LMP-1刺激锥间盘细胞产生蛋白聚糖。
确立了对于我们的培养系统最佳AdLMP-1活性必要的剂量和时间之后，发明人比较了通过给予AdLMP-1 LMP-1对环隙细胞和核细胞的效果。用MOI 25的AdLMP-1处理大鼠环隙细胞和核细胞，第6天检测各细胞型的sGAG浓度。用DNA含量将sGAG浓度标准化以计入细胞数目的轻微变化。没有将结果标准化到未处理对照以比较未处理对照的环隙细胞型和核细胞型。未处理的环隙细胞和核细胞的结果分别是0.6±0.04sGAG/DNA和1.0±0.12sGAG/DNA。这种差别是统计学显著的(p＜0.05)，表明未处理的核细胞比环隙细胞产生更多的sGAG/细胞。AdLMP-1处理后，环隙细胞和核细胞的结果分别是1.5±0.08sGAG/DNA(p＜0.01)和2.4±0.1 sGAG/DNA(p＜0.01)。与相应的未处理对照相比，这些数值显示了统计学显著性增加。未处理到AdLMP-1处理的细胞的相对增加在环隙细胞和核细胞之间是相似的。通过检测DNA含量测定了经或未经AdLMP-1处理第6天的细胞数目。环隙细胞DNA含量与未处理对照相比增加了1.2倍(p＜0.01)，但核细胞DNA含量未受AdLMP-1影响。这表明LMP-1诱导环隙细胞但非核细胞数目的轻度但显著地增加。
为了在几周时间内体外测试给予LMP-1(通过AdLMP-1)对产生sGAG的影响，发明人采用了一种藻酸盐培养系统。藻酸盐为细胞提供了三维基质，三维基质对于长期体外培养中维持软骨细胞表型是重要的。用MOI 25的AdLMP-1处理单层培养中的环隙细胞，然后24小时后转移到藻酸盐培养物中。将细胞培养1、2或3周。第1周，AdLMP-1组的sGAG水平是未处理对照的1.5±0.06(p＜0.01)倍(图5)。第2周，AdLMP-1处理组的sGAG水平增加到未处理对照的2.9±0.3(p＜0.01)倍。第3周保持了这种差别；AdLMP-1处理组的sGAG水平是对照的2.9±0.1(p＜0.01)倍。这表明，在培养物中至少3周内AdLMP-1有效维持sGAG在藻酸盐中积累的增加。
证明LMP-1过表达对产生蛋白聚糖的效果之后，我们研究了LMP-1过表达诱导这种效果的机制。测定了过表达LMP-1和BMP(BMP-2，4，6和7)的mRNA变化的时间过程。以前已证明，在白细胞和成骨细胞中这些BMP受LMP-1过表达的刺激。
确定了用MOI 25的AdLMP-1处理环隙细胞后过表达的LMP-1的时间依赖性变化。因为在对照中没有检测到过表达的LMP-1 mRNA，所以数据表示为过表达LMP-1的最大mRNA水平的百分比(第6天)，不是与未处理对照的比率。LMP-1 mRNA在处理后12小时可检测到，并继续增加直到检测的最后时间点(第6天)。这表明，早在给予LMP-112小时后，过表达的LMP-1即对下游基因有影响。
还用实时PCR测定了MOI 25的AdLMP-1处理后BMP mRNA水平的时间过程，计算为对各时间点的未处理对照的比率。BMP-2 mRNA早期被上调，在LMP-1处理后12小时达到统计学显著(p＜0.01)增加。第3天BMP-2 mRNA增加达到平台水平。BMP-7 mRNA比BMP-2上调晚，在第3天(p＜0.01)和第6天(p＜0.01)达到统计学显著增加。BMP-4或BMP-6mRNA水平与未处理对照没有显著不同。
确立了在环隙细胞中LMP-1 mRNA过表达使BMP-2和BMP-7 mRNA上调之后，发明人检测了这种mRNA的增加是否与BMP蛋白向培养基中分泌增加相关。用ELISA试验定量条件培养基中的BMP-2，4，6和7蛋白的水平。用MOI 25的AdLMP-1处理单层培养中的环隙细胞。第3天更换培养基一次，第6天分析培养基。因此被测样品中含有后3天(第4-6天)培养中分泌的BMP。培养基中的BMP-2和BMP-7蛋白水平分别是未处理对照的3.5±0.4(p＜0.01)和2.5±0.3(p＜0.05)倍。BMP-4和BMP-6蛋白水平与未处理对照无显著不同，这与从mRNA获得的结果相一致。
因为LMP-1上调了BMP-2和BMP-7的mRNA和蛋白，发明人研究了阻抑这些BMP是否可阻止由LMP-1诱导的sGAG产量的增加。用培养基中的BMP抑制剂头蛋白同时处理含有MOI 25 AdLMP-1的单层培养中的环隙细胞，第6天检测sGAG水平。单用AdLMP-1处理的细胞增加sGAG水平(未处理对照的2.7±0.3倍)，然而，以3200ng/ml头蛋白和MOI 25 AdLMP-1处理的细胞sGAG水平无变化(未处理对照的1.1±0.1倍)，表明头蛋白完全抑制了AdLMP-1的效果。单用头蛋白(3200ng/ml)处理的细胞sGAG水平也几乎无变化(未处理对照的0.8±0.1倍)，表明头蛋白无毒性。头蛋白对AdLMP-1诱导sGAG产生的抑制作用是浓度依赖性的。
在髓核中检测了对照锥间盘(AdGFP注射的锥间盘)中蛋白聚糖，BMP-7和LMP-1 mRNA的内源水平。用内源mRNA水平计算AdLMP-1注射的锥间盘中蛋白聚糖，BMP-7和LMP-1 mRNA的增加。AdLMP-1注射的锥间盘表达的总LMP-1mRNA水平高于AdGFP注射的锥间盘的830％。通过AdLMP-1给予LMP-1使BMP-7mRNA水平比对照增加1100％(p＜0.05)。蛋白聚糖mRNA水平比对照增加了66％(p＜0.05)。
还检测了BMP-2，BMP-7，LMP-1，和蛋白聚糖mRNA的内源水平。观察到AdLMP-1剂量增加和总LMP-1 mRNA之间的相关性。通过AdLMP-1给予LMP-1显著增加了BMP-2和BMP-7mRNA水平，107噬菌斑形成单位/盘的剂量时增加最大(p＜0.05)。107噬菌斑形成单位/盘剂量的AdLMP-1使蛋白聚糖mRNA增加最大，比对照高50％(P＜0.05)。
给予锥间盘细胞LMP-1使sGAG产量和蛋白聚糖mRNA水平增加。给予LMP-1使体外BMP-2和BMP-7的mRNA和蛋白水平增加，给予LMP-1对蛋白聚糖的产生的上调作用可被给予BMP抑制剂头蛋白阻抑。
无痛致死11月龄的Sprague-Dawley大鼠，无菌条件下收获腰脊柱和尾巴的锥间盘组织。单独地将纤维环(annulus fibrosus)和髓核切成小方块。将锥间盘组织置于含有100单位/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基和Ham′s F12培养基(DMEM/F-12；GIBCO BRL，Grand Island，N.Y.，U.S.A.)中。在培养基中37℃用0.2％链霉蛋白酶(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.，U.S.A.)处理锥间盘组织1小时，然后37℃用0.025％胶原酶(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.，U.S.A.)处理6小时。将分离的细胞洗涤，通过70mm网孔(Falcon，Franklin Lakes，N.J.，U.S.A.)过滤到75cm2烧瓶中，烧瓶中含有12ml DMEM/F-12培养基，该培养基含有10％胎牛血清(FBS)，100单位/毫升青霉素，100mg/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺和50mg/ml抗坏血酸盐。在增湿、5％CO2、37℃培养细胞。在约8天中每2天更换培养基。
使用了两种不同的病毒。用含有受CMV启动子驱动的人LMP-1 cDNA的复制缺陷5型腺病毒(AdLMP-1)作为实验病毒。对照病毒由含有lacZ cDNA的相似的复制缺陷5型腺病毒组成。
当锥间盘细胞的原代培养物变为汇合时，以400,000细胞/孔将细胞传代培养到6孔板中。3天后，用含有人LMP-1基因(AdLMP-1)或LacZ基因(AdLacZ)的腺病毒处理这些细胞。第0天通过用血细胞计数器计数对照孔来测定细胞数目。病毒剂量表示为感染复数(MOI)，噬菌斑形成单位的数目(噬菌斑形成单位)/细胞。这基本上是单个锥间盘细胞接触的重组腺病毒噬菌斑形成单位的数目。用溶于含有0％FBS的300ml DMEM/F-12中的AdLMP-1或AdLacZ以各实验中指定的不同MOI(0，10，25，50)37℃处理培养的细胞30分钟。然后用DMEM/F-12培养基将培养物体积增加到2.0ml，该DMEM/F-12培养基含有1％FBS，100单位/毫升青霉素，100毫克/毫升青霉素，2mM L-谷氨酰胺和50毫克/毫升维生素C。在实验过程中每3天更换培养基。
用1，9-二甲基亚甲基蓝(DMMB)法测定培养基中的硫酸糖胺聚糖(sGAG)含量。用Centricon YM-50离心过滤器(Millipore Co.，Bedford，Mass.，U.S.A.)将2ml培养基离心(5000xG，30分钟)以浓缩sGAG。在96孔微量滴定板中将样品溶液(20ml)轻轻地与200ml DMMB染液混合，立即在520nm波长滤光器下检查光学密度(OD)。用硫酸软骨素(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.，U.S.A.)的系列稀释液绘制标准曲线。用DNA含量将培养基中的总sGAG标准化，并表示为与未处理对照的比率。
如前所述，用各孔的DNA含量确定细胞数目，用Hoechst染料33258(Polysciences，Warrington，Pa.，U.S.A.)方法检测DNA含量。通过将培养的细胞接触木瓜蛋白酶(10单位/毫升)使其从板上去除。然后将细胞沉淀，60℃孵育3小时。在96孔萤光板中将20微升等份的木瓜蛋白酶消化物与200毫升Hoechst染料33258溶液混合。分别在456nm和365nm用发光分光计(LuminescenceSpectrometer)LS 50B(Perkin-Elmer，Wellesly，Mass.，U.S.A.)检测发射和激发波长。用已知浓度的牛胸腺DNA(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.，U.S.A.)在各检测时间绘制标准曲线。
藻酸盐珠培养物对于在长期培养中维持软骨细胞表型是有用的。这种方法是在3周培养物中测定AdLMP-1的作用。如前所述处理单层培养中的细胞。1天后，用胰蛋白酶化释放细胞，以培养基洗涤2次。将分离的细胞以600,000细胞/毫升重悬于0.6％低粘度无菌藻酸盐(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.，U.S.A.)溶液中。用连接于10-ml塑料注射器的21-号针逐滴将细胞分散到0.102M CaCl+0.15M NaCl溶液中，以形成藻酸盐珠。10分钟后，用无菌0.9％NaCl溶液洗涤新形成的珠子(含有约12,000细胞/珠)3次，随后用DMEM/F-12洗涤2次。在6孔板中以DMEM/F-12培养基单独培养含有环隙细胞纤维环的珠，该DMEM/F-12培养基含有1％FBS，100单位/毫升青霉素，100毫克/毫升青霉素，2mM L-谷氨酰胺和50毫克/毫升维生素C。在不同时期内(1、2和3周)每2天更换培养基。将藻酸盐珠溶解于350ml柠檬酸钠缓冲液(55mmol/L柠檬酸钠，50mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，pH7.4)中。离心沉淀细胞，如前所述用DMMB法检测溶解液中的sGAG含量。残留在细胞沉淀物中的sGAG与悬液中的sGAG相比可忽略不计。结果用溶解液中的sGAG描述为比未处理对照组增加的倍数。
mRNA水平的定量用实时PCR以定量方式测定BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7和过表达LMP-1的mRNA水平。通过在琼脂糖凝胶上测定产物大小和扩增子的DNA测序，验证了所有基因的引物。测定了各样品中的18S水平用作内部对照。
用硫氰酸胍-酚-氯仿技术一步法抽提各样品的总RNA。用分光光度计(DU-500；Beckman，Fullerton，Calif.，U.S.A.)在260nm波长测定分离的RNA的浓度。用DNAse 1(Ambion，Inc.Texas，U.S.A.)处理RNA以除去样品的DNA污染。以2mg总RNA在40ml体积中进行反转录；30U禽成髓细胞血症病毒反转录酶(Promega，Madison，Wis.，U.S.A.)；5mM MgCl2；60U/ml RNAsin(Promega，Madison，Wis.，U.S.A.)；三磷酸脱氧腺苷(dATP)，三磷酸脱氧胞苷(dCTP)，三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)，三磷酸脱氧胸苷(dTTP)各1mM；和1mg寡(dT)15引物42℃45分钟。用AmplitaqDNA多聚酶进行30个PCR循环(95℃，30″；62℃，30″；72℃，45″)。为了确证没有DNA污染，也将未用反转录酶处理的RNA样品进行PCR没有PCR产物确证了没有DNA污染。
已报道PCR是一种定量检测特异性mRNA的快速、可靠和可重复的方法。采用SYBR绿色实时试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，Calif.，U.S.A.)的实时PCR方法来进行BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7和蛋白聚糖的定量mRNA分析。25毫升(25ml)的反应体积包括5ml cDNA，3.75皮摩尔各引物(BMP-2，-4，-6，-7和18S)，以及12.5ml SYBR绿色主混合液(2x，Biorad，Hercules，Calif.，U.S.A.)。为了定量过表达LMP-1和18S mRNA的水平，还采用了利用TaqMan(R)实时PCR试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，Calif.，U.S.A.)的实时PCR方法。25毫升(25ml)的反应体积包括5ml cDNA，3.75皮摩尔各引物，以及12.5ml TaqManPCR主混合液(2x，Biorad，Hercules，Calif.，U.S.A.)。
用GeneAmp以下列3个步骤的程序进行实时PCR；第1步50℃2分钟，第2步95℃10分钟，和第3步(95℃15秒，60℃1分钟)×45个循环；5700序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，Calif.，U.S.A.)。为了确证扩增特异性，将PCR产物进行位错(dislocation)曲线分析。如前所述，用比较的-ΔΔCt方法根据18S将各反应的阈循环(Ct)标准化。
BMP 2，4，6和7的ELISA试验用溶解于0.05mol/L重碳酸盐缓冲液中的人BMP 2，4，6和7(GeneticsInstitute，Cambridge，Mass.)的递增的浓度(0.1ng/100μL/孔-1000ng/100μL/孔)来绘制BMP的标准曲线。每孔加入100微升样品，一式三份。4℃孵育过夜后，用含0.5％Tween 20的0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤这些板3次，用1％牛白蛋白(Sigma，ST.Louis，Mo.)室温封闭未反应位点1小时。用PBST洗涤这些板之后，以100微升等份将第一抗体(1∶1000)加入到各孔，室温孵育2小时。采用BMP 2，4，和6的多克隆山羊抗体(Santa Cruz Inc，Santa Cruz，Calif.)以及BMP 7的兔抗体(Sigma，St.Louis，Mo.)。用PBST洗涤这些板，然后分别与碱性磷酸酶缀合的抗-山羊IgG和抗-兔IgG(Sigma，St.Louis，Mo.)室温孵育1小时。用底物对-硝基苯磷酸(Sigma，St.Louis，Mo.)显色20分钟，然后用3N NaOH终止反应。通过用Elx800-微型板读数器(Bio-Tek Instruments，Winooska，Vt.)检测405nm处吸收差异来定量颜色。
为了定量结果，对于各标准品绘制了线性回归图。在所有情况下，样品的浓度都是根据与标准品相同的吸光度的对应值从标准品的线性回归图中推断出来的。
头蛋白糖蛋白对BMP的抑制头蛋白是一种糖蛋白，它以高度特异性方式与BMP-2，4，6和7结合，阻止这些BMP激活它们相关的受体。实验中采用了一种小鼠头蛋白的形式(头蛋白-FC Sigma Chemical，St.Louis，Mo.，U.S.A.)来测定AdLMP-1处理后特异性阻抑BMP的效果。AdLMP-1(MOI 25)处理后第0天和第3天将不同浓度的头蛋白加到细胞中。第6天，如上所述用DMMB法检测条件培养基以检查sGAG的产生。结果表明，给予头蛋白可阻抑LMP-1的作用，证明LMP-1的活性部分地与其诱导BMP有关。
权利要求
1.一种用于产生细胞渗透性骨诱导多肽的方法，所述方法包括将一个表达构建物引进合适的宿主细胞内，所述构建物包括a)编码细胞渗透性多肽的多核苷酸；b)编码骨诱导多肽的多核苷酸，所述骨诱导多肽可操作地连接于细胞渗透性多肽上并定位，以产生骨诱导多肽作为融合蛋白的一部分与细胞渗透性多肽一起表达。c)定位的启动子引导多核苷酸的转录。
2.如权利要求1所述所述的方法，其特征在于表达构建物进一步包括纯化标记。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于细胞渗透性多肽选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1和果蝇Antp肽。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于细胞渗透性多肽是HIV-TAT蛋白转导域。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-beta 1和Smad蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。
7.一种用于在哺乳动物中诱导骨形成的方法，所述方法包括给予有效量的融合多肽，所述融合多肽包括蛋白转导域和至少一种骨诱导多肽。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于蛋白转导域选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1和果蝇Antp肽。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于蛋白转导域是一HIV-TAT蛋白转导域。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-beta1和Smad蛋白。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。
12.如权利要求7所述的方法，其特征在于融合多肽作为一种植入物施用。
13.如权利要求7所述的方法，其特征在于融合多肽通过水凝胶施用。
14.如权利要求7所述的方法，其特征在于融合多肽施用给至少一个多能祖细胞施用。
15.如权利要求7中的方法，其中至少一个所述多能祖细胞植入哺乳动物内。
16.一种编码融合蛋白的多核苷酸，包含蛋白转导域和至少一个骨诱导多肽。
17.如权利要求16中的多核苷酸，其中所述蛋白转导域选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1，和果蝇Antp肽。
18.如权利要求16中的多核苷酸，其中所述蛋白转导域是IV-TAT蛋白转导域。
19.如权利要求16中的多核苷酸，其中所述骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-β1和Smad蛋白。
20.如权利要求16中的多核苷酸，其中所述骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。
21.一种诱导哺乳动物中蛋白聚糖合成的方法，包括给予有效量的融合蛋白，所述融合蛋白含有蛋白转导域和至少一个骨诱导多肽。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于蛋白转导域选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1和果蝇Antp肽。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于蛋白转导域是HIV-TAT蛋白转导域。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2和BMP-7。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO 6，SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于蛋白转导域作为一种植入物施用。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于蛋白转导域通过水凝胶施用。
28.如权利要求21所述的方法，其特征在于蛋白转导域施用给至少一个多能祖细胞。
29.如权利要求21中的方法，其中至少一个多能祖细胞植入哺乳动物内。
30.如权利要求21所述的方法，其特征在于蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖。
31.一种分离的融合多肽，包括一种可操作地连接于骨诱导多肽的膜转位肽。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于膜转位肽选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1和果蝇Antp肽。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于膜转位肽是一种HIV-TAT蛋白转导域。
34.如权利要求31所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-β1和Smad蛋白。
35.如权利要求31所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。
36.一种诱导祖细胞中成骨细胞分化的方法，该方法包括给予有效量的融合多肽，所述多肽包括蛋白转导域和至少一种骨诱导多肽。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于蛋白转导域选自HIV-TAT，VP-22，生长因子信号肽序列，Pep-1和果蝇Antp肽。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于蛋白转导域是HIV-TAT蛋白转导域。
39.如权利要求36所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，BMP-2，BMP-4，BMP-6，BMP-7，TGF-β1和Smad蛋白。
40.如权利要求36所述的方法，其特征在于骨诱导多肽选自LMP-1，LMP-3，SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQID NO 6，SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。
41.一种骨诱导多肽，选自SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3，SEQID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，或其组合物。
42.一种骨诱导多肽在标准条件下与互补以下序列的核酸分子杂交tcctcatccg ggtcttgcat gaactcggtg
43.一种骨诱导多肽在高度严格条件中与互补以下序列的核酸分子杂交gcccccgccc gctgacagcg ccccgcaa
全文摘要
本发明提供包括蛋白质转导域和骨诱导多肽的融合多肽，以及利用这种多肽诱导骨形成能力并促进蛋白聚糖合成的方法。本发明还提供已证明具有体内诱导骨形成能力的骨诱导多肽。
文档编号A61K38/00GK1934123SQ200480008027
公开日2007年3月21日 申请日期2004年4月13日 优先权日2004年4月13日
发明者F·泰特斯, J·马克斯, S·德拉皮尔, S·伯登, S·永恩 申请人:Sdgi控股股份有限公司