专利名称：G－csf和具有血管再生作用的因子的合用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和具有血管再生作用的因子作为有效成分的缺血性疾病治疗剂、即缺血性疾病治疗用组合物。
背景技术：
本发明是有关缺血性疾病治疗剂的发明，首先，说明作为缺血性疾病的代表病症之一的闭塞性动脉硬化症。
闭塞性动脉硬化症是由动脉硬化(粥样硬化)性病变引起的主要由脂肪构成的粥样物质沉淀在动脉壁内膜，在四肢，尤其是下肢的主干动脉产生闭塞或狭窄，其末梢产生缺血性障碍的疾病。作为临床症状，可分为冷感或麻痹感、间歇性跛行、安静时疼痛、溃疡·坏死。在日本的闭塞性动脉硬化症患者已达10万人左右(多田裕辅，《(治疗学)》，31卷289-292页；1997年)，预计由于高龄人口的增加和食物的欧美化今后还会增长。
作为闭塞性动脉硬化症的治疗方法，根据症状或患者的状态等，可进行运动疗法、药物疗法、血管修复术。此外，目前，为避免切断重症缺血肢体，正在研究促进血管再生的血管再生疗法(基因治疗、自身骨髓细胞移植等)。这些疗法目前已对闭塞性动脉硬化症的治疗取得了一定的成果，但分别存在以下问题点。
运动疗法在轻度病例中发现有延长步行距离的效果的例子，但本疗法的效果难以预测。此外也有报道，即使有延长步行距离的效果患者也不满意而希望进行血管修复术的情况有30％(太田敬，日本医事新报，3935期25-29页，1990年)，不能说是非常有效的治疗方法为目前的现状。
至于药物疗法，作为主要处方的抗血小板剂只能达到防止病症恶化的程度。即使是最近正在开发的微循环血流改善剂和氧输送能力改善剂也只能期待适用于轻度病例。均非根本性治疗闭塞性动脉硬化症的药物是其现状。
与此相比，血管修复术是目前最有效的治疗法，根据患者的症状、病变部位或范围实施经皮血管形成术或分流术。但是，它们是伴随手术的大规模治疗，除了伴随手术的合并症或死亡症，也存在不能指望长期生存的情况等问题。
使用血管再生因子的基因治疗是使侧支血管发达而改善缺血的治疗方法。作为血管再生因子已知有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。日本正在进行使用人HGF的临床研究。已研究了以重症肢体缺血病例为对象的使用HGF的质体的下肢肌肉的肌内注射的方法，其效果令人期待。但是迄今为止还仅限于实验治疗范围，有关安全性和效果的评价还没有固定，因此一般还没有普及。
此外，最近受到瞩目的自身骨髓细胞的肌内移植是将骨髓细胞移植到病灶附近的肌肉中，在血管内皮细胞中分化形成血管来进行治疗的方法。自身骨髓细胞移植对免疫系统无副作用，确认在动物模型中有骨髓细胞向内皮细胞的分化和血管数的增加。今后，虽有必要增加病例数进行效果评价，但从也能治疗重症病例的角度出发，作为未来的治疗方法备受期待。但由于临床上需在全身麻醉下采取骨髓，与之相伴的患者和医疗工作者的负担增大据认为也是问题之一。
根据最近的研究查明，不仅在骨髓中、末梢血中也存在着可分化为血管内皮细胞的造血干细胞(从所谓可分化为内皮细胞的功能的观点来看被称为“内皮细胞的前体细胞”，但由于该细胞原本是从造血干细胞派生而来，因此本说明书中也根据所谓的能转变为内皮细胞的细胞集落的概念采用“造血干细胞”这一用语)，现已发现这与血管再生有关(Qun Shiet al.，Blood，Vol.92，362-367，1998；Takayuki Asahara et al.，Circulation Research，vol.85，221-228，1999；Mario Peichev et al.，Blood，vol.95，952-958，2000)。因此，通过采取末梢血中的造血干细胞并将其移植到病灶附近的肌肉中，可期待能够治疗闭塞性动脉硬化症。这时，虽然有与采取末梢血干细胞相关的患者和医疗工作者的负担比移植骨髓中的干细胞时的负担轻的优点，但通常末梢血中的造血干细胞的存在频度极低，因此是否能够得到治疗闭塞性动脉硬化症所必需的、足够量的造血干细胞存在很大的疑问。
人G-CSF是作为粒细胞类造血前体细胞的分化生长因子而发现的造血因子，由于促进机体内嗜中性粒细胞造血，作为骨髓移植或癌症化疗后的嗜中性粒细胞减少症的治疗药而适用于临床。此外，除上述作用外，人G-CSF作用于造血干细胞，具有刺激其增殖分化和将骨髓中的造血干细胞动员到末梢血中的作用。实际中，基于后者的作用，临床实践中以促进实施强力化疗后的癌症患者的造血恢复为目的，进行移植由人G-CSF动员的末梢血造血干细胞的末梢血干细胞移植术。G-CSF的这种动员造血干细胞的作用比同样作为粒细胞类造血因子的GM-CSF要强得多。并且从副作用少这点来看，G-CSF也比GM-CSF具有优越性。
HGF是由各种间质细胞产生的、以大多数上皮类细胞、神经元、内皮细胞、一部分间质细胞为目标的蛋白质。已知除细胞生长促进活性以外，还具有细胞运动性促进活性、上皮形态形成(管腔构造等)诱导活性。从作为促进成人体内以肝脏为代表的肾脏、肺、消化道的再生的器官再生因子的功能出发，作为脏器疾病的治疗药备受期待。
发明内容
在对闭塞性动脉硬化症患者首先进行肌内移植骨髓细胞的治疗之前，通过给予G-CSF有望使骨髓中造血干细胞的频度增高，因而可以减少采取骨髓细胞时的骨髓穿刺次数，能减轻患者负担。此时，通过从末梢血中获取移植的造血干细胞，可以进一步减轻患者和医疗工作者的负担。并且，由于末梢血中的造血干细胞显示有助于血管形成，推断这是由于通过给予G-CSF使末梢血中的造血干细胞增加而促进血管形成。因此，可以期待只是给予患者G-CSF就能治疗闭塞性动脉硬化症。通过给予G-CSF来治疗闭塞性动脉硬化症，从无需采取或移植造血干细胞这一点来说，很明显能够极大地减轻患者和医疗工作者的负担。
并且，通过并用使用血管再生因子的基因治疗有望增大治疗效果。即，使G-CSF作用于造血干细胞促进其生长分化，将骨髓中的造血干细胞动员到末梢血中促进脉管形成(vasculorgenesis)，同时，通过HGF或FGF促进血管形成(angiogenesis)，通过发挥双方的不同作用，结果可以预测出血管再生作用的相加或协同效果。
使用G-CSF进行闭塞性动脉硬化症的治疗，即使重症患者也可以期待效果，给患者带来极大福音，不过若与具有促进血管内皮前体细胞分化生长的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等具有血管再生作用的因子或其基因治疗并用时更能期待增大其治疗效果。此时，上述因子或其基因可对患者例如病灶附近给予。同样地，与作为临床上闭塞性动脉硬化症的药物疗法使用的抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂、高脂血症治疗剂等并用，也有望增大其治疗效果。
以上研究结果中，本发明人等发现在给予G-CSF的同时给予作为血管再生因子的HGF或FGF，可以在缺血血管中获得特别高的改善效果，至此完成了本发明。
因此，本发明提供含有G-CSF及HGF或FGF作为有效成分的缺血性疾病治疗剂。
并且，本发明治疗剂也可适用于同样作为缺血性疾病的下述疾病的治疗剂。即，本发明提供含有G-CSF及HGF或FGF作为有效成分的对外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍(脑中风、脑梗塞等)、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病、缺血性心疾病(缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰等)等的治疗剂。
此外，本发明提供闭塞性动脉硬化症的治疗剂。
本发明还提供血管再生剂或肌肉再生剂。
图1是向左足缺血的小鼠分别给予生理盐水(对照)、HGF、G-CSF和HGF+G-CSF对小鼠下肢肌肉重量比(％)的影响的示意图。
图2是向左足缺血的小鼠分别给予生理盐水(对照)、HGF、G-CSF和HGF+G-CSF对小鼠下肢血流比(％)的影响的示意图。
图3是向左足缺血的小鼠分别给予生理盐水(对照)、HGF、G-CSF和HGF+G-CSF对小鼠血流速度的影响的示意图。红色部分为最高速的部分，按黄、绿、蓝的顺序表示低速部分。
图4中，A表示向左足缺血的小鼠分别给予生理盐水(对照HGF-、G-CSF-)、HGF质粒(HGF+、G-CSF-)、G-CSF(HGF-、G-CSF+)、G-CSF+HGF质粒(HGF+、G-CSF+)对小鼠GFP阳性细胞数比率的影响的荧光显微镜照片。绿色表示GFP阳性细胞、蓝色表示核。B表示将显微镜照片中计算出的GFP阳性细胞数计分化的图。
图5中，A表示向左足缺血的小鼠分别给予生理盐水(对照HGF-、G-CSF-)、HGF质粒(HGF+、G-CSF-)、G-CSF(HGF-、G-CSF+)、G-CSF+HGF质粒(HGF+、G-CSF+)对小鼠vWF阳性细胞数比率的影响的荧光显微镜照片。红色表示vWF阳性细胞、蓝色表示核。B表示将显微镜照片中计算出的vWF阳性细胞数计分化的图。
图6中，A表示GFP阳性细胞(绿色)、血管内皮细胞(红色)及核(蓝色)的荧光显微镜照片以及它们重叠在一起的照片。B表示GFP阳性细胞(绿色)、血管平滑肌细胞(红色)及核(蓝色)的荧光显微镜照片以及将它们重叠在一起的照片。其中，nuclei表示“核”，merged表示“重叠”。
图7中，A表示GFP阳性细胞(绿色)、骨骼肌细胞(红色)及核(蓝色)的荧光显微镜照片以及将它们重叠在一起的照片。B表示连续切片的重叠照片。其中，actinin表示“辅肌动蛋白”，nuclei表示“核”，merged表示“重叠”。
图8是向左足缺血的小鼠分别给予生理盐水(a手术翌日，b给药4周后)、HGF质粒(c给药4周后)、G-CSF(d给药4周后)和G-CSF+HGF质粒(e给药4周后)对小鼠下肢血流速度的影响的示意图。“*”表示p＜0.05(vs.生理盐水组)，“+”表示p＜0.01(vs.生理盐水组)，“#”表示p＜0.05(vs.HGF质粒组)，“§”表示p＜0.05(vs.G-CSF组)。
图9是将给药4周后下肢损伤程度计分化的图。白色表示无坏死、灰色表示爪端坏死，黑色表示肢坏死。
图10是向左足缺血的小鼠分别给予生理盐水、HGF质粒、FGF、G-CSF+HGF质粒、G-CSF+FGF质粒对小鼠下肢血流速度的影响的示意图。“*”表示p＜0.05(vs.生理盐水组)，“”表示p＜0.01(vs.生理盐水组)，“#”表示p＜0.05(vs.G-CSF组)，“§”表示p＜0.05(vs.HGF质粒组)， 表示p＜0.05(vs.FGF组)。
图11是将给药4周后下肢损伤程度计分化的图。白色表示无坏死、灰色表示爪端坏死，黑色表示肢坏死。
具体实施例方式
本发明涉及含有G-CSF及HGF或FGF的缺血性疾病治疗剂。
本发明中“缺血性疾病”是指由血液供给的器质性障碍(例如动脉狭窄等)引起的局部性贫血相关的疾病。作为缺血性疾病的例子，例如可举出外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍(脑中风、脑梗塞等)、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病、缺血性心疾病(缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰等)。
此外，本发明涉及含有G-CSF及HGF或FGF的血管再生剂或肌肉再生剂。
人G-CSF是由174个氨基酸残基组成的公知蛋白质。
使用作为本发明缺血性疾病治疗剂的有效成分的G-CSF时，任何G-CSF均可使用，但优选高度纯化的G-CSF。具体可举出哺乳动物的G-CSF、特别是人G-CSF或基本上与之具有同等生物学活性的G-CSF。G-CSF的来源没有特殊限定，可使用来自于天然的G-CSF、由基因重组得到的G-CSF等。由基因重组得到的G-CSF可以是与天然G-CSF的氨基酸序列相同(例如特公平2-5395号、特开昭62-236488号等)，或在该氨基酸序列中缺失、置换和/或添加了1个或多个氨基酸，但是与天然G-CSF具有同等生物学活性的G-CSF等均可。例如，使用定点诱变法(Gotoh，T.et al.(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)NucleicAcids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz H.J.(1987)MethodsEnzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，通过向G-CSF的氨基酸序列导入适当突变，可以制成与G-CSF功能相同的多肽。氨基酸的突变也可以从自然界中产生。已知具有通过对某个氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或被其他氨基酸置换而被修饰的氨基酸序列的多肽能维持其生物学活性(Mark.D.F.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.L.& Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.et al.，Science(1984)224，1431-1433；Daldadie-McFarland，G.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
因此，在G-CSF的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸突变了的氨基酸序列组成的、与G-CSF的功能相同的多肽也可用作本发明的缺血性疾病治疗剂。这样的多肽中氨基酸的突变数通常在30个氨基酸以内，优选15个氨基酸以内，更优选5个氨基酸以内(例如，3个氨基酸以内)。
置换突变体中，期望被能保持氨基酸侧链性质的其它氨基酸置换。能保持氨基酸侧链性质的氨基酸是指例如疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子的侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸或酰胺的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基的侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族的侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。(括号内均表示氨基酸的单字母缩写)在G-CSF的氨基酸序列中添加多个氨基酸残基的多肽中包括含G-CSF的融合多肽。融合多肽是G-CSF与其他多肽相融合的物质，这种多肽也可用于本发明。制备融合多肽时，例如，连接编码G-CSF的DNA和编码其他多肽的DNA以使之读框一致，导入适当的表达载体，并使之被适当的宿主表达即可。用于与G-CSF融合的其他多肽，只要该融合多肽能保持与G-CSF同等的生物学活性，就没有特殊限制。
有关使G-CSF的氨基酸序列变化的G-CSF衍生物已有许多报道，因此也可使用这些公知的G-CSF衍生物(例如，USP5581476号、USP5214132号、USP5362853号、USP4904584号等)。
并且，也可使用经化学修饰的G-CSF。作为化学修饰的G-CSF的例子，例如可举出进行糖链的结构转变、添加、缺失操作的G-CSF或结合了聚乙二醇等化合物的G-CSF等(例如，USP5824778号、USP5824784号、WO96/11953号、WO95/21629号、WO94/20069号、USP5218092号、特开平4-164098号等)。
本发明中的G-CSF采用任何方法制造均可。例如可使用培养人肿瘤细胞的细胞株并采用各种方法提取并分离纯化的G-CSF，或使用基因工程的方法由大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞等的哺乳类细胞；昆虫细胞等产生的并采用各种方法从中提取、分离纯化出的G-CSF等(例如，特公平1-44200号公报、特公平2-5395号公报、特开昭62-129298号公报、特开昭62-132899号公报、特开昭62-236488号公报、特开昭64-85098号公报)。
这样的G-CSF的制造方法，只要能生产出上述规定的G-CSF方法即可，具体来说，可使用产生G-CSF的肿瘤或产生G-CSF的杂交瘤、及使由基因重组赋予了G-CSF产生能力的转化宿主来制造，根据制备的G-CSF的结构，可在制备工序的适当阶段采用适当改变操作或各种修饰操作。另外，通过基因重组制造时宿主不限，可采用大肠杆菌、动物细胞等常用的宿主。
此外，本发明中，G-CSF既可以作为蛋白质给予，也可以像基因治疗那样给予编码G-CSF的基因。
HGF是69kDa的α链和34kDa的β链组成的公知的异二聚体蛋白质。
HGF的给予方法没有特殊限定，HGF可以作为蛋白质给予，但优选像基因治疗那样给予编码HGF的基因。编码HGF的基因通常作为含有表达盒的表达载体等给予。载体没有特别限定，既可使用非病毒载体，也可使用病毒载体(别册实验医学，《(基因导入和表达分析的实验方法》，羊土社，1997；别册实验医学，《(基因治疗的基础技术》，羊土社，1996年等)。作为载体的例子，可举出质粒载体、病毒载体、噬菌体载体、粘粒载体、YAC载体等。表达载体通常含有启动子等的调节成分或抗生素耐性基因等。
基因的导入方法可以采用任何方法，例如，可以使用磷酸钙共沉法、脂转染法、使用脂质膜导入方法、裸露DNA法、受体介导的基因导入的方法、使用基因枪的方法、DEAE-葡聚糖法、使用毛细管的方法等。此外，本发明中既可将基因直接导入体内，也可以对取出的细胞导入基因后再将该细胞返回到体内。
有关HGF和HGF表达载体(HGF表达质粒)已有许多报道，因此本领域技术人员可以适当选择而给予(Nakamura，T.，Nishizawa，T.，Hagiya，M.et al.Nature 1989，342，440-443；Hayashi，S.，Morishita，R.，Higaki，J.et al.Biochem Biophys Res Commun 1996，220，539-545；Morishita，R.，Sakaki，M.，Yamamoto，K.et al.Circulation，2002，105，1491-1496等)。此外，编码HGF的基因的给予方法采用本领域技术人员公知的方法进行即可(例如，WO01/32220、WO01/26694、WO97/07824、WO01/21214等)。
此外，当HGF作为蛋白质给予时，可使用任何HGF，但优选高度纯化的HGF。具体可举出哺乳动物的HGF、特别是人HGF或基本上与之具有同等生物学活性的HGF。HGF的来源没有特殊限定，可使用来自于天然的HGF、由基因重组得到的HGF等。由基因重组方法得到的HGF可以与天然HGF的氨基酸序列相同(例如GenBank Accession Number；M73239、M73240、M29145、L02931、M60718等)，或在该氨基酸序列中缺失、置换和/或添加了1个或多个氨基酸者的，但与天然HGF具有同等生物学活性的HGF等均可使用。例如，使用定点诱变法(Gotoh，T.et al.(1995)Gene152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492；Kunkel(1998)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，通过向HGF的氨基酸序列导入适当突变，可以制成与HGF功能相同的多肽。氨基酸突变也可以从自然界中产生。已知具有通过对某个氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或被其他氨基酸置换而被修饰的氨基酸序列的多肽能维持其生物学活性(Mark.D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.L.& Smith，M.Nucleic Acids Res.(1982)10，6487-6500；Wang，A.et al.，Science(1984)224，1431-1433；Daldadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
因此，在HGF的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列组成的、与HGF的功能相同的多肽也可用作本发明的缺血性疾病治疗剂。这样的多肽中氨基酸的突变数通常在30个氨基酸以内，优选15个氨基酸以内，更优选5个氨基酸以内(例如，3个氨基酸以内)。
HGF的置换突变体中，与G-CSF相同，期望被能保持氨基酸侧链性质的其它氨基酸置换。在HGF的氨基酸序列中添加多个氨基酸残基的多肽中包括含HGF的融合多肽。融合多肽是HGF与其他多肽相融合的物质，这种多肽也可用于本发明。制备融合多肽时，例如，连接编码HGF的DNA和编码其他多肽的DNA以使之读框一致，导入适当的表达载体，并使之被适当的宿主表达即可。用于与HGF融合的其他多肽，只要该融合多肽能保持与HGF同等的生物学活性，就没有特殊限制。
此外，在编码本发明的HGF的基因中，也包含编码与这种HGF功能同等的多肽的基因。
FGF中有酸性FGF(FGF1，140个氨基酸)和碱性FGF(FGF2，155～157个氨基酸)。并且，作为功能类似物还有FGF3(int-2)、FGF4(hst-1)、FGF5、FGF6(hst-2)、FGF7(KGF角质化细胞生长因子，keratinocytegrowth factor)、FGF8(AIGF雄激素诱导的生长因子，androgen-inducedgrowth factor)、FGF9(GAF神经胶质活化因子Glia-activating factor)等。本发明中的“FGF”包括上述全部。
FGF的给予方法没有特殊限定，FGF可以以蛋白质给予，但优选像基因治疗那样给予编码FGF的基因。编码FGF的基因通常可以含有表达盒的表达载体等给予。载体没有特别限定，既可使用非病毒载体，也可使用病毒载体(别册实验医学，《(基因导入和表达分析的实验方法》，羊土社，1997；别册实验医学，《(基因治疗的基础技术》，羊土社，1996年等)。作为载体的例子，可举出质粒载体、病毒载体、噬菌体载体、粘粒载体、YAC载体等。表达载体通常含有启动子等的调节成分或抗生素耐性基因等。
基因的导入方法可以采用任何方法，例如，可以使用磷酸钙共沉法、脂转染法、使用脂质膜导入方法、裸露DNA法、受体介导的基因导入的方法、使用基因枪的方法、DEAE-葡聚糖法、使用毛细管的方法等。此外，本发明中既可将基因直接导入体内，也可以对取出的细胞导入基因后再将该细胞返回到体内。
有关FGF和FGF表达载体(FGF表达质粒)已有许多报道，因此本领域技术人员可以适当选择进行给予(Kurokawa，T et al.，FEBS Lett.213，189-194，(1987)，GenBank Accession NumberJ04513、M27968)。此外，编码FGF的基因的给予方法采用本领域技术人员公知的方法进行即可(例如，Jejurikar S et al.，Journal of Surgical Research，67(2)，137-146，(1997)，Reynolds PN et al.，Tumor Targeting，3(3)，156-168，(1998)，Ruffini F et al.，Gene Therapy，8(16)，1207-1213，(2001)等)。
此外，当FGF作为蛋白质给予时，可使用任何FGF，但优选高度纯化的FGF。具体可举出哺乳动物的FGF、特别是人体FGF或基本上与之具有同等生物学活性的FGF。FGF的来源没有特殊限定，可使用来自于天然的FGF、由基因重组得到的FGF等。由基因重组得到的FGF与天然FGF的氨基酸序列相同(例如，FEBS Lett.213189-194，1987.GenBankAccession NumberJ04513、M27968等)，或在该氨基酸序列中缺失、置换和/或添加了1个或多个氨基酸，但与天然FGF具有同等生物学活性的FGF等均可。例如，使用定点诱变法(Gotoh，T.et al.(1995)Gene152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.et a1.(1984)Nucleic Acids Res.12，944-9456；Kramer，W.和Fritz H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492；Kunkel(1998)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，通过向FGF的氨基酸序列导入适当突变，可以制成与FGF功能相同的多肽。氨基酸的突变也可以从自然界中产生。已知具有通过对某个氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或被其他氨基酸置换而被修饰的氨基酸序列的多肽能维持其生物学活性(Mark.D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，(1984)，5662-5666；Zoller，M.L.& Smith，M.Nucleic Acids Res.10，(1982)，6487-6500；Wang，A.et al.，Science 224，(1984)，1431-1433；Daldadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，(1982)，6409-6413)。
因此，由FGF的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列组成的、与FGF的功能相同的多肽也可用作本发明的缺血性疾病治疗剂。这种多肽中氨基酸的突变数通常在30个氨基酸以内，优选15个氨基酸以内，更优选5个氨基酸以内(例如，3个氨基酸以内)。
FGF的置换突变体中，与G-CSF相同，期望被能保持氨基酸侧链性质的其它氨基酸置换。在FGF的氨基酸序列中添加多个氨基酸残基的多肽中包括含HGF的融合多肽。融合多肽是FGF与其他多肽相融合的物质，这种多肽也可用于本发明。制备融合多肽时，例如，连接编码FGF的DNA和编码其他多肽的DNA以使之读框一致，导入适当的表达载体，并使之被适当的宿主表达即可。用于与FGF融合的其他多肽，只要该融合多肽能保持与HGF同等的生物学活性，就没有特殊限制。
此外，在编码本发明的FGF的基因中，也包含编码与这种FGF功能同等的多肽的基因。
此外，本发明中也可使用经化学修饰的HGF或FGF。作为经化学修饰的HGF或FGF的例子，例如可举出进行了糖链的结构转变、添加、缺失操作的HGF或结合聚乙二醇等化合物的HGF或FGF等。
本发明中的HGF或FGF采用任何方法制造均可。例如可使用培养人肿瘤细胞的细胞株并采用各种方法从中提取并分离纯化的HGF或FGF，或基因工程的方法由大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞等的哺乳类细胞；昆虫细胞等产生的并采用各种方法从中提取并分离纯化出的HGF或FGF等。这样的HGF或FGF的制造方法，只要能生产出上述规定的HGF或FGF方法即可，可使用由基因重组赋予了HGF或FGF产生能力的转化宿主来制造，根据制备的HGF或FGF的结构，可在制备工序的适当阶段采用适当改变操作或各种修饰操作。另外，通过基因重组制造时宿主不限，可采用大肠杆菌、动物细胞等常用的宿主。
G-CSF、HGF、FGF已有市售，也可使用它们的市售产品。
本发明的缺血性疾病治疗剂，为获得作为医药制剂的形态除含有必要的制剂载体和赋形剂外，还可含有稳定剂或防吸附剂，剂型可选择注射剂(皮下、皮内、肌肉内、静脉内、腹腔内等)、长效制剂、经鼻剂、口服制剂(片剂、胶囊、颗粒剂、液体制剂、混悬剂等)、经肺剂、经皮剂、经粘膜剂等适当的制剂，根据需要可采用适当的给药器具。
本发明的缺血性疾病治疗剂根据其给药方法和剂型，并根据需要可适当添加混悬剂、助溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、无痛化剂、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。
混悬剂的例子，可举出甲基纤维素、吐温80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶粉末、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯等。
助溶剂可举出聚氧乙烯固化蓖麻油、吐温80、烟酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。
稳定剂可举出葡聚糖40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。
等渗剂可举出例如D-甘露糖醇、山梨糖醇等。
防腐剂可举出例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
防吸附剂可举出例如人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚乙二醇等。
含硫还原剂可举出例如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰同型半胱氨酸、硫辛酸、硫撑二乙醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫代山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、碳原子数1～7的巯基烷酸等的有巯基的物质等。
抗氧化剂可举出例如异抗坏血酸、二丁羟基甲苯、丁羟基茴香醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。
此外，还可含有氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐；柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠等有机盐等通常添加的成分。
本发明的缺血性疾病治疗剂中含有的G-CSF的给药量和给药次数可根据作为对象的患者症状来决定，给药量通常成人每人0.1～500μg/kg/天，优选1～50μg/kg/天，给药次数为每周1～7日，1日1～3次。给药方法优选静脉内、皮下、肌肉内等给药。
以G-CSF基因给药时，成人每人0.1μg～100mg，优选0.001～10mg，当以脂质体的形态摄取时，以HGF基因计，给药量选择在成人每人约1μg～约4mg，优选约10μg～约400μg的范围。
本发明中，给予HGF基因时，根据治疗目的的疾病、症状等选择适当的给药方法、给药部位。给药部位优选肌肉给药。给药方法优选非口服给药。
给药量根据患者的症状等而不同，作为HGF基因，成人每人0.1μg～100mg，优选0.001～10mg。当以脂质体的形态摄取时，以HGF基因计，给药量选择在成人每人约1μg～约4mg，优选约10μg～约400μg的范围。给药次数根据患者的症状适当选择。数日～数周时间给药1次是合适的。优选每周1次、给药数次。更优选给药8次。
将HGF以蛋白质给药时，给药量和给药次数可根据作为对象的患者症状来决定，给药量通常成人每人0.1～500μg/kg/天，优选1～50μg/kg/天，给药次数为每周1～7日，1日1～3次。给药方法优选静脉内、皮下、肌肉内给药。
本发明中，给予FGF基因时，根据治疗目的的疾病、症状等选择适当的给药方法、给药部位。给药部位优选肌肉给药。给药方法优选非口服给药。
给药量根据患者的症状等而不同，以FGF基因计，成人每人0.1μg～100mg，优选0.001～10mg。当以脂质体的形态摄取时，以FGF基因计，给药量选择在成人每人约1μg～约4mg，优选约10μg～约400μg的范围。给药次数根据患者的症状适当选择。数日～数周时间给药1次是合适的。优选每周1次、给药数次。更优选给药8次。
将FGF以蛋白质给药时，给药量和给药次数可根据作为对象的患者症状来决定，给药量通常成人每人0.1～500μg/kg/天，优选1～50μg/kg/天，给药次数为每周1～7日，1日1～3次。给药方法优选静脉内、皮下、肌肉内给药。
但本发明并不限定于以上的G-CSF、及HGF或FGF的用量。本发明中，G-CSF、及HGF或FGF可作为1个制剂来制备并给药，也可以分别制备并给药。
通过使用本发明的缺血性疾病治疗剂，可以增加造血干细胞的数量，通过从骨髓或末梢血中采集并进行患者自身的自身骨髓移植，有利于末梢血中的血管形成，可以治疗缺血性疾病。此外，通过给药本发明治疗剂使造血干细胞被动员到末梢血中，从而即使不采取或移植造血干细胞也能治疗缺血性疾病。
并且，本发明的缺血性疾病治疗剂可以与抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂、高脂血症治疗剂等至今为止常用的对缺血性疾病有效的药物并用，还可与基因治疗并用。
以下举出实验例(药理效果)、实施例(制剂例)更详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。
实施例实验例1(药理效果)(1)对野生小鼠(C57BL/6、8～10周龄；CLEA，东京，日本)的全身单次照射致死量的放射线(850cGy)。从GFP基因重组小鼠(C57BL/6、10～12周龄)(Okabe et al.(1997)FEBS.Lett.407，313-319)中采取骨髓细胞(5×106个)，并从尾静脉移植到野生小鼠中。移植2个月后，在左大腿动脉的2处结扎，制成下肢缺血模型。随机分为生理盐水给药组、G-CSF给药组、HGF质粒给药组、G-CSF+HGF质粒给药组(每组5只)共4组给药。HGF质粒(Nakamura，T.，Nishizawa，T.，Hagiya，M.et al.Nature 1989，342，440-443；Hayashi，S.，Morishita，R.，Higaki，J.et al.Biochem Biophys Res Commun 1996，220，539-545；Morishita，R.，Sakaki，M.，Yamamoto，K.et al.Circulation，2002，105，1491-1496)使用质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司制)，根据生产商的实验手册进行配制。生理盐水给药组和G-CSF(基因重组人G-CSF(中外制药(株)制))(300μg/kg/天)给药组分别在结扎24小时后进行10天皮下给药。HGF质粒给药组在结扎后24小时以500μg/只进行肌内注射给药。G-CSF+HGF质粒给药组在结扎后24小时肌内注射HGF(500μg/只)，然后立即进行G-CSF给药(300μg/kg/天)10天。
给药4周后下肢肌肉重量比(图1)、下肢血流比(图2)、以及各小鼠的代表性的血流速度(图3)如图所示。此外，实验数据如表1所示。
表1
即使G-CSF、HGF质粒单独给药组与生理盐水给药组相比也显示出改善倾向，但G-CSF+HGF质粒给药组与其他组相比，下肢肌肉重量比、下肢血流比、血流速度均呈现有统计学意义显著恢复，下肢损伤减轻。
综上，通过组合HGF和G-CSF，与各自单独治疗相比，显示其治疗效果增大。
(2)以下为进行组织学检查，将进行与上述同样处理的野生小鼠用氯胺酮(30mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)麻醉，将下肢血管用PBS灌流、用溶于PBS中的4％的多聚甲醛灌流固定。取出缺血的下肢肌肉，包埋于OCT化合物(Miles Scientific，Naperville，IL，USA)中后，用液态氮急速冷冻制成薄切片。将冷冻的切片(6μm)用PBS洗净，用抗体在4℃下染色一夜。对抗体来说，血管内皮细胞的染色使用抗vovWillebrand因子(vWF)抗体(cloneF8/86；DAKO)，血管平滑肌细胞的染色使用α-平滑肌肌动蛋白抗体(clone 1A4；Sigma Aldrich)，骨骼肌细胞的染色使用抗辅肌动蛋白抗体(clone EA；Sigma Aldrich)。然后用PBS洗涤3次，使用TRITC(DAKO，日本)结合2次抗体在4℃下保温4小时(红色)，核用TOTO-3(Molecular Probes公司)染色(蓝色)。将免疫染色的切片用激光共焦点显微镜(LSM510META；Carl Zeiss；Jena，Germany)观察(图4A和图5A)。
将用激光共焦点显微镜拍摄的图像输入计算机，用NIH Image分析。计算相对于每个生理盐水给药组(HGF-，G-CSF-)的切片中的有核细胞数的GFP阳性细胞数(图4B)和vWF阳性细胞数(图5B)。
此外，连续切片中典型的GFP阳性细胞数和血管内皮细胞的照片的重叠照如图6A所示，GFP阳性细胞数和血管平滑肌细胞的照片的重叠照如图6B所示，GFP阳性细胞数和骨骼肌细胞的照片的重叠照如图7A所示。
通过下肢肌肉的免疫染色可知来自骨髓细胞的GFP阳性细胞分化为血管平滑肌细胞或血管内皮细胞。即使HGF质粒单独给药组与生理盐水给药组相比也显示出血管再生增强，但G-CSF+HGF质粒给药组与其他组相比，显示出协同的血管再生作用。此外，还确认有来自骨髓细胞的再生下肢肌肉。推断G-CSF和HGF的并用对下肢损伤的治疗效果是基于对缺血肢中的血管和下肢肌肉的再生的作用。
实验例2(药理效果)在裸小鼠(BALB/cA)的左大腿动脉的2处结扎，造成下肢缺血模型。随机分成生理盐水组(20只)、G-CSF组、HGF质粒组、G-CSF+HGF质粒组(每组10只)共4组给药。与实验例1同样，生理盐水给药组和G-CSF(300μg/kg/天)给药组分别在结扎24小时后进行10天皮下给药。HGF质粒给药组在结扎后24小时以500μg/只进行肌内注射给药。G-CSF+HGF质粒给药组在结扎后24小时肌内注射HGF(500μg/只)，然后立即进行G-CSF给药(300μg/kg/天)10天。给药4周后各组小鼠的代表性的血流速度如图8所示。予以说明，血流速度用平均±sEM表示，平均值间的统计学差异用ANOVA计算。比较采用log-rank检验或Fisher非参数多重检验进行。“*”表示p＜0.05(vs.生理盐水组)，“+”表示p＜0.01(vs.生理盐水组)，“#”表示p＜0.05(vs.HGF质粒组)，“§”表示p＜0.05(vs.G-CSF组)。
将给药4周后下肢损伤程度计分化来评价(图9)。白色表示无坏死、灰色表示爪端坏死，黑色表示肢坏死。
即使G-CSF、HGF质粒单独给药组与生理盐水给药组相比也显示出有统计学意义的显著的下肢血流改善效果，G-CSF+HGF质粒给药组与其他组相比，更显示出有统计学意义的显著的下肢血流恢复效果。其效果与野生型小鼠(实验例1)中的结果具有同样的倾向，但裸小鼠一方更具显著效果。此外，下肢损伤也有统计学意义改善。
实验例3(药理效果)在裸小鼠(BALB/cA)的左大腿动脉的2处结扎，造成下肢缺血模型。随机分成生理盐水给药组(20只)、G-CSF给药组、HGF质粒给药组、FGF给药组、G-CSF+HGF质粒给药组、G-CSF+FGF给药组(每组5只)共6组给药。与实验例1同样，生理盐水给药组和G-CSF(300μg/kg/天)给药组分别在结扎24小时后进行10天皮下给药。HGF质粒给药组在术后24小时以500μg/只肌内注射给药。FGF给药组在结扎后24小时以500μg/只肌内注射FGF(曲弗明(Trafermin)科研制药制)。G-CSF+HGF质粒给药组在结扎后24小时肌内注射HGF(500μg/只)，然后立即进行G-CSF给药(300μg/kg/天)10天。G-CSF+FGF给药组在术后24小时肌内注射FGF(500μg/只)，然后立即进行G-CSF给药(300μg/kg/天)10天。给药4周后各组小鼠的代表性的血流速度如图10所示。予以说明，血流速度用平均±SEM表示，平均值间的统计学差异用ANOVA计算。比较采用log-rank检验或Fisher非参数多重检验进行。“*”表示p＜0.05(vs.生理盐水组)，“”表示p＜0.01(vs.生理盐水组)，“#”表示p＜0.05(vs.G-CSF组)，“§”表示p＜0.05(vs.HGF质粒组)， 表示p＜0.05(vs.FGF组)。
将给药4周后下肢损伤程度计分化来评价(图11)。白色表示无坏死、灰色表示爪端坏死，黑色表示肢坏死。
即使G-CSF、HGF质粒单独给药组与生理盐水给药组相比也显示出有统计学意义的下肢血流改善效果，但G-CSF+HGF质粒给药组与其他组相比，更显示出有统计学意义的下肢血流恢复效果。其效果与野生小鼠(实验例1)中的结果具有同样的倾向，但裸小鼠一方更具显著效果。此外，下肢损伤也有统计学意义改善。
实施例1(制剂例)向人G-CSF(10mM磷酸缓冲液，pH7.0)50μg/mL中加入作为非离子性表面活性剂的吐温20(Tween20聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)至浓度为0.1mg/mL，用NaCl将渗透压调整到1后，用孔径0.22μm的滤膜进行过滤灭菌。将所得溶液填充到实施了灭菌处理的安瓶中，用同样实施了灭菌处理的橡胶塞栓塞，然后用铝盖密封制成注射用溶液制剂。该注射用制剂保存在10℃以下的阴暗处。
实施例2(制剂例)向人G-CSF(10mM磷酸缓冲液，pH7.0)100μg/mL中加入作为非离子性表面活性剂的吐温80(Tween80聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)至浓度为0.1mg/mL，用NaCl将渗透压调整到1后，用孔径0.22μm的滤膜进行过滤灭菌。将所得溶液填充到实施了灭菌处理的安瓶中，用同样实施了灭菌处理的橡胶塞栓塞，然后用铝盖密封制成注射用溶液制剂。该注射用制剂保存在10℃以下的阴暗处。
实施例3(制剂例)向人G-CSF(10mM磷酸缓冲液，pH7.0)50μg/mL中加入作为非离子性表面活性剂的吐温20(Tween80聚氧乙烯山梨糖单月桂酸酯)至浓度为0.1mg/mL，加入HAS至10mg/mL和甘露糖醇至50mg/mL溶解后，用孔径0.22μm的滤膜进行过滤灭菌。将所得溶液填充到实施了灭菌处理的安瓶中，用同样实施了灭菌处理的橡胶塞半栓塞，进行冷冻干燥得到注射用冻干剂。将该注射用冻干剂在室温以下的温度条件下保存。使用时用注射用蒸馏水溶解后使用。
工业实用性本发明的含有G-CSF及HGF或FGF作为有效成分的缺血性疾病治疗剂如实施例1～3所示，可期待对闭塞性动脉硬化症的比较重症的病例具有治疗效果。推测该G-CSF及HGF或FGF的效果是基于促进血管再生而产生的，因此，也可期待对其他缺血性疾病，即外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍(脑中风、脑梗塞等)、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病、缺血性心疾病(缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰等)的治疗效果。本发明的治疗方法与以往的治疗方法相比，简便、安全且有效。
权利要求
1.缺血性疾病治疗剂，含有粒细胞集落刺激因子、以及肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子为有效成分。
2.权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，其中，缺血性疾病指外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病或缺血性心疾病。
3.权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，其中，缺血性疾病指脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰或闭塞性动脉硬化症。
4.权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，其中，缺血性疾病指闭塞性动脉硬化症。
5.权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的缺血性疾病的治疗中，为从骨髓中获得必要且足够量的造血干细胞而采用。
6.权利要求2所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病或缺血性心肌症的治疗中，为从骨髓中获得必要且足够量的造血干细胞而应用。
7.权利要求3所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰或闭塞性动脉硬化症的治疗中，为从骨髓中获得必要且足够量的造血干细胞而应用。
8.权利要求4所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的闭塞性动脉硬化症的治疗中，为从骨髓中获得必要且足够量的造血干细胞而应用。
9.权利要求1所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的缺血性疾病的治疗中，为从末梢血中获得必要且足够量的造血干细胞而应用。
10.权利要求2所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病或缺血性心肌症的治疗中，为从末梢血中获得必要且足够量的造血干细胞而应用。
11.权利要求3所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰或闭塞性动脉硬化症的治疗中，为从末梢血中获得必要且足够量的造血干细胞而应用。
12.权利要求4所述的缺血性疾病治疗剂，在给予患者自身造血干细胞的闭塞性动脉硬化症的治疗中，为从末梢血中获得必要且足够量的造血干细胞而应用。
13.权利要求1～4中任一项所述的缺血性疾病治疗剂，其特征在于，通过给药而在末梢血中增加的造血干细胞有助于患者的血管形成。
14.缺血性疾病的治疗方法，其特征在于，联合使用以给予患者具有血管再生作用的因子或其基因为特征的缺血性疾病治疗和含有以粒细胞集落刺激因子为有效成分的缺血性疾病治疗剂。
15.权利要求14所述的缺血性疾病的治疗方法，其中，具有血管再生作用的因子为肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子。
16.闭塞性动脉硬化症的治疗方法，其特征在于，联合使用以给予病灶附近具有血管再生作用的因子或其基因为特征的闭塞性动脉硬化症治疗和含有以粒细胞集落刺激因子为有效成分的缺血性疾病治疗剂。
17.权利要求16所述的闭塞性动脉硬化症的治疗方法，其中，具有血管再生作用的因子为肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子。
18.缺血性疾病的治疗方法，其特征在于，联合使用抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂或高脂血症治疗剂等的作为临床上缺血性疾病的药物疗法所使用的药物，和权利要求1～3中任一项所述的缺血性疾病治疗剂。
19.闭塞性动脉硬化症的治疗方法，其特征在于，联合使用抗血小板剂、血管扩张剂、微循环改善剂、抗凝剂或高脂血症治疗剂等的作为临床上闭塞性动脉硬化症的药物疗法所使用的药物，和权利要求4所述的缺血性疾病治疗剂。
20.粒细胞集落刺激因子、以及肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子在治疗缺血性疾病中的应用。
21.权利要求20所述的应用，其中，缺血性疾病指外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病或缺血性心肌症。
22.权利要求20所述的应用，其中，缺血性疾病指脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰或闭塞性动脉硬化症。
23.权利要求20所述的应用，其中，缺血性疾病指闭塞性动脉硬化症。
24.粒细胞集落刺激因子、以及肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子在给予患者自身造血干细胞的闭塞性动脉硬化症的治疗中，为从骨髓中获得必要且足够量的造血干细胞的应用。
25.权利要求24所述的应用，其中，缺血性疾病指外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病或缺血性心肌症。
26.权利要求24所述的应用，其中，缺血性疾病指脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰或闭塞性动脉硬化症。
27.权利要求24所述的应用，其中，缺血性疾病指闭塞性动脉硬化症。
28.粒细胞集落刺激因子、以及肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子在给予患者自身造血干细胞的闭塞性动脉硬化症的治疗中，为从末梢血中获得必要且足够量的造血干细胞的应用。
29.权利要求28所述的应用，其中，缺血性疾病指外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病或缺血性心肌症。
30.权利要求28所述的应用，其中，缺血性疾病指脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰或闭塞性动脉硬化症。
31.权利要求28所述的应用，其中，缺血性疾病指闭塞性动脉硬化症。
32.粒细胞集落刺激因子、以及肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子在以给予患者具有血管再生作用的因子或其基因为特征的缺血性疾病治疗中的应用。
33.权利要求32所述的应用，其中，缺血性疾病指外伤、移植时的排斥反应、缺血性脑血管障碍、缺血性肾疾病、缺血性肺疾病、感染症相关的缺血性疾病、四肢的缺血性疾病或缺血性心肌症。
34.权利要求32所述的应用，其中，缺血性疾病指脑中风、脑梗塞、缺血性心肌症、心肌梗塞症、缺血性心衰或闭塞性动脉硬化症。
35.粒细胞集落刺激因子、以及肝细胞生长因子或成纤维细胞生长因子在以给予病灶附近具有血管再生作用的因子或其基因为特征的闭塞性动脉硬化症治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种对缺血性疾病有效的治疗剂，含有粒细胞集落刺激因子(G－CSF)、以及肝细胞生长因子(HGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)为有效成分。通过给予该治疗剂，提供一种特别是对于治疗闭塞性动脉硬化症，可以消除以往采用的运动疗法、药物疗法、血管修复术或最近提倡的基因治疗或骨髓细胞内的肌内移植等中的缺点的有效的治疗方法。并且，本发明治疗剂还可作为缺血性脑血管障碍、缺血性心肌症等的缺血性疾病治疗剂使用。
文档编号A61P9/10GK1780636SQ200480011468
公开日2006年5月31日 申请日期2004年3月19日 优先权日2003年3月20日
发明者福田惠一, 久下康代 申请人:福田惠一, 久下康代