治疗淀粉样蛋白斑相关性病症的nogo－受体拮抗剂的制作方法

专利名称：治疗淀粉样蛋白斑相关性病症的nogo－受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经生物学、神经病学以及药物学。更具体地，其涉及通过给予Nogo受体拮抗剂来治疗异常淀粉样蛋白-β(amyloid-β)(Aβ)肽的产生及沉积的相关疾病的方法，所述疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是一种神经变性紊乱，其导致记忆、认知、推理、判断以及情绪稳定性的进行性丧失，最终导致死亡。AD的病理学标记是脑中淀粉样蛋白斑(amyloid plaque)的存在。但是，淀粉样蛋白斑及血管淀粉样蛋白沉积物(淀粉样血管病(amyloid angiopathy))也存在于其它病症中，例如，在Trisomy 21(唐氏综合征(Down’s Syndrome))、具有Dutch型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)以及脑淀粉样血管病(CAA)中。淀粉样蛋白斑的主要成分是Aβ肽，其是通过β-分泌酶(βACE)及γ-分泌酶(早老素-1，2及相关蛋白)经蛋白水解作用于淀粉样(amyloid)前体蛋白(APP)而得到的。APP通过α-分泌酶及γ-分泌酶也转变为无害的肽及蛋白片段。对人类家族性AD(FAD)的遗传学研究已发现在APP和/或早老素中的突变改变了总Aβ肽的产生或原纤维生成性(fibrillogenic)Aβ42-3肽与其它APP裂解产物的比率。此外，表达突变的人FAD型APP的小鼠无论是否有早老素突变都具有淀粉样蛋白斑沉积以及认知损伤。
尽管AD涉及Aβ肽，仍不太确定何种形式的Aβ肽会导致神经元官能障碍以及它们如何起作用。单体Aβ肽转化为大的淀粉样蛋白斑沉积物经历了几个步骤，且中间体形式可能导致AD的神经元官能障碍。因此，治疗干预集中在降低Aβ肽水平及预防淀粉样蛋白斑形成。这些方法已取得一些成功，其包括如用Aβ肽免疫及被动给予抗Aβ肽抗体。参见，如，Bard等，NatureMed.6916-19(2000)；Holtzman等，Adv.Drug Delivery Rev.541603-13(2002)和国际专利申请WO 99/27944、WO 00/72876及WO 00/72880。但是，还是急需设计出更多的AD治疗方法。
发明概述本发明是基于如下发现用可溶性Nogo受体多肽治疗降低Aβ肽水平，并且用Nogo受体拮抗剂(例如可溶性Nogo受体多肽)治疗减少了Aβ肽和斑块(plaque)沉积物的产生。基于这些发现，本发明的特征包括通过给予Nogo受体多肽可溶性片段及Nogo受体拮抗剂治疗淀粉样蛋白斑沉积相关性病症的方法，所述病症包括阿尔茨海默病。
在某些实施方案中，本发明提供了用于降低哺乳动物中Aβ肽水平的方法，包含给予治疗有效量的可溶性Nogo受体多肽。在某些实施方案中，与疾病、紊乱或病症相关的Aβ肽水平升高了。在某些实施方案中，所述疾病、紊乱或病症是阿尔茨海默病。
在某些实施方案中，通过大丸药(bolus))注射或长期输注给予可溶性Nogo受体多肽。在某些实施方案中，经静脉内给予可溶性Nogo受体多肽。在某些实施方案中，可溶性Nogo受体多肽被直接给予中枢神经系统。在某些实施方案中，可溶性Nogo受体多肽被直接给予侧脑室(lateral ventricle)。
在某些实施方案中，可溶性Nogo受体多肽是哺乳动物NgR1的可溶性形式。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；和(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；和(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；和(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式进一步包含融合部分。在某些实施方案中，所述融合部分是免疫球蛋白部分。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白部分是Fc部分。
在某些实施方案中，所述治疗有效量为0.001mg/kg-10mg/kg。在某些实施方案中，所述治疗有效量为0.01mg/kg-1.0mg/kg。在某些实施方案中，所述治疗有效量为0.05mg/kg-0.5mg/kg。
在某些实施方案中，本发明提供了预防或治疗哺乳动物中Aβ肽斑块相关性疾病、紊乱或病症的方法，包含给予治疗有效量的NgR1拮抗剂。在某些实施方案中，所述斑块存在于中枢神经系统中。在某些实施方案中，所述疾病、紊乱或病症是阿尔茨海默病。
在某些实施方案中，NgR1拮抗剂被直接给予中枢神经系统。在某些实施方案中，NgR1拮抗剂被直接给予侧脑室。在某些实施方案中，通过大丸药注射或长期输注给予NgR1拮抗剂。
在某些实施方案中，可溶性Nogo受体多肽是哺乳动物NgR1的可溶性形式。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；和(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；和(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；和(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
在某些实施方案中，哺乳动物NgR1的可溶性形式进一步包含融合部分。在某些实施方案中，所述融合部分是免疫球蛋白部分。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白部分是Fc部分。
在某些实施方案中，NgR1拮抗剂包含结合至哺乳动物NgR1的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、Fd片段、二价抗体(diabody)或单链抗体。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与产生自杂交瘤的单克隆抗体所结合的多肽结合，所述杂交瘤选自HB 7E11(ATCC保藏号PTA-4587)、HB 1H2(ATCC保藏号PTA-4584)、HB 3G5(ATCC保藏号PTA-4586)、HB 5B10(ATCC保藏号PTA-4588)或HB 2F7(ATCC保藏号PTA-4585)。在某些实施方案中，所述单克隆抗体产生自HB 7E11杂交瘤。在某些实施方案中，所述多肽包含选自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)、LDLSDNAQLR(SEQ ID NO8)、LDLSDDAELR(SEQ IDNO9)、LDLASDNAQLR(SEQ ID NO10)、LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)、LDALSDNAQLR(SEQ ID NO12)、LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)、LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO14)、LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)、DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO16)、DNAQLR(SEQ ID NO17)、ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO18)、LALSDNAQLRVVDPTT(SEQID NO19)、LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO20)、LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO21)或LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQID NO22)的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述治疗有效量为0.001mg/kg-10mg/kg。在某些实施方案中，所述治疗有效量为0.01mg/kg-1.0mg/kg。在某些实施方案中，所述治疗有效量为0.05mg/kg-0.5mg/kg。
发明详述除非另有指定，本文中使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，以本申请及其所包括的定义为准。除非上下文另有需要，单数术语应包括复数以及复数术语应包括单数。本文中提及的所有出版物、专利和其它参考文献全文在此并入作为参考，如同每一份单独出版物或专利申请明确及单独地被表明并入作为参考文献一样。
虽然类似或相当于本文中所述的那些的方法和材料可在本发明实践或测试中使用，但是合适的方法和材料描述如下。所述材料、方法和实例仅是例证性的而并不为了限制。本发明的其它特征和优点在详细的说明书和权利要求书中是显而易见的。
在说明书和权利要求书全文中，术语“包含”或诸如“含有”或“包括”的变体指包括所有列举的完整事物或完整事物组，但不排除任何其它完整事物或完整事物组。
为了进一步定义本发明，提供了如下术语和定义。
本文使用的“抗体”指完整的免疫球蛋白或其抗原结合片段。本发明抗体可以是任何同种型或类(如M、D、G、E和A)或任何亚类(如G1-4、A1-2)，且可具有kappa(κ)或lambda(λ)轻链。
本文使用的“人源化抗体”指其中至少一部分非人序列为人序列所取代的抗体。如何制备人源化抗体的实例见美国专利6,054,297、5,886,152和5,877,293。
本文使用的“治疗有效量”指在剂量上及在必要的时间段内达到所需治疗效果的有效量。
本文使用的“预防有效量”指在剂量上及在必要的时间段内达到所需预防效果的有效量。一般地，由于预防剂量用于受试者发病早期前或疾病早期，因此预防有效量应小于治疗有效量。
本文使用的“患者”指哺乳动物，例如人。
本文使用的“融合蛋白”指包含与第二异源多肽融合的第一多肽的蛋白。
本文使用的“Nogo受体拮抗剂”指抑制Nogo受体-1与配体(如NogoA、NogoB、NogoC、MAG、OM-gp)结合的分子。
本文使用的“Nogo受体多肽”包括结合Aβ肽或拮抗Nogo受体功能的全长Nogo受体-1蛋白及其片段。
本发明的第一方面是基于可溶性Nogo受体多肽直接结合Aβ肽的发现。因此，无意受理论所限，看来可溶性Nogo受体多肽在体内可起Aβ肽滤过器(sink)的作用。可利用该机制以降低循环血、沉积位点或两者中的Aβ肽水平，从而抑制了淀粉样蛋白斑形成或缩小了现存的斑块的尺寸。因为一个作用位点是在血流中，本发明有利避免了将可溶性Nogo受体多肽给予中枢神经系统(CNS)的需要。然而，应当意识到可溶性Nogo受体多肽可不与全身给药一起、或除全身给药之外被直接给予CNS。
本发明的第二方面是基于可溶性Nogo受体多肽或其它Nogo受体拮抗剂如抗Nogo受体抗体在CNS中干扰Nogo受体功能的发现。该结果既降低了Aβ肽水平又减少了斑块沉淀。在该机制中，可溶性Nogo受体多肽或其它Nogo受体拮抗剂的作用位点是在CNS中。不受理论所限，看来抑制NgR功能的至少一个效果是减少了生成Aβ肽的APP的加工。
Nogo受体拮抗剂任何一种Nogo受体拮抗剂都可用于本发明方法中。例如，可用于本发明方法的Nogo受体拮抗剂包括，但不限于可溶性Nogo受体-1多肽、结合至Nogo受体蛋白的抗体及该抗体的抗原结合片段、以及小分子拮抗剂。
可溶性Nogo受体-1多肽本发明的某些实施方案使用了可溶性Nogo受体-1多肽(Nogo受体-1也有多种名称，如“Nogo受体”、“NogoR”、“NogoR-1”、“NgR”及“NgR-1”)。全长Nogo受体-1由信号序列、N-末端区(NT)、8个富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)、LRRCT区(在8个富含亮氨酸重复序列C-末端的富含亮氨酸重复序列区)、C-末端区(CT)及GPI锚组成。人及大鼠的Nogo受体多肽序列示于表1中。
表1.人和大鼠的Nogo受体-1多肽序列
本发明方法中所使用的可溶性Nogo受体多肽包含NT区、8个LRR及LRRCT区，缺少信号序列和功能性GPI锚(即，无GPI锚，或具有GPI锚但其无法有效地结合至细胞膜)。合适的多肽包括，例如，人Nogo受体的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)和26-344(SEQ ID NO4)，及大鼠Nogo受体的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)和27-344(SEQ ID NO6)(表2)。其它可用于本发明方法的多肽描述于，例如，国际专利申请PCT/US02/32007和PCT/US03/25004中。
表2.来自人和大鼠的可溶性Nogo受体多肽
包含可溶性Nogo受体多肽的融合蛋白可用于本发明的方法。在某些实施方案中，所述融合蛋白的异源部分是免疫球蛋白恒定区。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定区是重链恒定区。在某些实施方案中，所述异源多肽是Fc片段。在某些实施方案中，所述Fc连接至可溶性Nogo受体多肽的C-末端。在某些实施方案中，所述融合Nogo受体蛋白是二聚体，如Fc融合二聚体。
抗体本发明某些方法使用了Nogo受体拮抗剂，其为特异性结合免疫原性Nogo受体-1多肽并抑制Nogo受体-1与配体(如NogoA、NogoB、NogoC、MAG、OM-gp)结合的抗体或其抗原结合片段。用于本发明这些方法中的抗体或抗原结合片段可以在体内或体外制备。在某些实施方案中，所述抗Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段是鼠或人的。在某些实施方案中，所述抗Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段是重组的、改造的、人源化的和/或嵌合的。在某些实施方案中，所述抗体选自描述于国际专利申请PCT/US03/25004中的抗体。用于本发明的抗体可被修饰或不被修饰而加以使用。
可用于本发明方法的抗体的举例的抗原结合片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、dAb以及包含互补决定区(CDR)片段的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、二价抗体及多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白(如免疫粘附素)的至少一部分。
本文使用的Fd指由VH和CH1区组成的片段，Fv指由抗体单臂的VL和VH区组成的片段，以及dAb指由VH区组成的片段(Ward等，Nature341544-46(1989))。本文使用的单链抗体(scFv)指其中VL区和VH区通过合成接头以配对形成单价分子的抗体，所述接头可使它们作为单条蛋白链来制备(Bird等，Science242423-26(1988)和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-83(1988))。本文使用的二价抗体指双特异性抗体，其中VH和VL区表达在单条多肽链上，但使用的接头太短以致这两个区在同一条链上无法配对，因此迫使所述区与另一条链的互补区配对，形成了两个抗原结合位点(参见，例如Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-48(1993)和Poljak等，Structure21121-23(1994))。
免疫接种本发明方法所使用的抗体可通过免疫接种合适的宿主(如，脊椎动物，包括人、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛、马，爬行类、鱼类、两栖类，以及在乌类、爬行类和鱼类卵中)来制备。上述抗体可以是多克隆或单克隆的。制备抗体的综述参见，如Harlow和Lane(1988)，Antibodies，A LaboratoryManual；Yelton等，Ann.Rev.of Biochem.，50657-80(1981)；和Ausubel等，(1989)，Current Protocols in Molecular Biology(New YorkJohn Wiley &Sons)。抗体与免疫原性Nogo受体多肽的免疫反应性可通过任何合适的方法(包括例如，免疫印迹测定法和ELISA)进行测定。用于本发明方法的单克隆抗体可通过如上述Harlow和Lane(1988)所述的常规方法来制备。
可使用佐剂或不用佐剂，用免疫原性Nogo受体-1多肽来免疫宿主。合适的多肽描述于，例如，国际专利申请PCT/US01/31488，PCT/US02/32007和PCT/US03/25004中。也可用与完整或破裂细胞的细胞膜相连的Nogo受体-1免疫所述宿主，并通过与Nogo受体-1多肽结合来鉴定抗体。其它制备抗体的合适技术包括在体外将淋巴细胞暴露于Nogo受体-1或本发明的免疫原性多肽，或者在噬菌体或类似载体中来选择抗体文库。参见Huse等，Science2461275-81(1989)。
用于本发明方法的抗Nogo受体-1抗体也可通过筛选重组组合抗体文库来分离。用于制备及筛选上述文库的方法为本领域所公知。存在用于制备噬菌体展示文库的商业渠道可获得的方法及材料(如，Pharmacia的重组噬菌体抗体系统，产品目录号27-9400-01；Stratagene的SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，产品目录号240612以及来自MorphoSys的其它产品)。在从重组免疫球蛋白展示文库中筛选并分离抗Nogo受体-1抗体后，可从展示包装(displaypackage)(如，从噬菌体基因组)中回收编码所选择抗体的核酸，并通过标准重组DNA技术将其亚克隆至其它表达载体中。为表达通过筛选组合文库所分离的抗体，将编码抗体重链和轻链或其可变区的DNA克隆入重组表达载体中并导入宿主细胞中。
Nogo受体拮抗剂的应用本发明涉及通过给予Nogo受体拮抗剂用于治疗异常Aβ肽沉积相关性疾病的方法。用于本发明方法的Nogo受体拮抗剂包括但不限于，可溶性Nogo受体多肽、抗Nogo受体蛋白的抗体及其抗原结合片段，以及小分子拮抗剂。在某些实施方案中，所述异常Aβ肽沉积与疾病、紊乱或病症(如阿尔茨海默病)相关。
可溶性Nogo受体多肽的应用本发明也涉及通过给予可溶性Nogo受体多肽用于降低Aβ肽水平的方法。在某些实施方案中，Aβ肽水平的升高与疾病、紊乱或病症(如阿尔茨海默病)相关。
药物组合物可将用于本发明方法的可溶性Nogo受体多肽及Nogo受体拮抗剂配制为药物组合物来给予包括人类的哺乳动物。用于本发明方法中的所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
在这些药物组合物中有用的药学上可接受的载体包括，如离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、诸如人血清白蛋白的血清蛋白、诸如磷酸盐的缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质类、例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠、锌盐、胶态硅石(colloidal silica)、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
所述用于本发明方法的组合物可通过任何合适的方法给予，如肠胃外、心室内、经口、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、含服(buccal)、阴道或通过植入型药盒(reservoir)给予。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、损伤内及颅内注射或输注技术。如前所述，用于本发明方法的Nogo受体拮抗剂在CNS中起作用，其既导致Aβ肽水平的下降，也导致斑块沉积的减少。因此，在使用了Nogo受体拮抗剂的本发明方法中，Nogo受体拮抗剂必须穿过血脑屏障。穿过血脑屏障是Nogo受体拮抗剂分子自身所固有的物化特性的结果，或是药物配方中其它成分的结果，或是使用诸如针头、插管或手术器械的机械装置以破坏血脑屏障的结果。当Nogo受体拮抗剂不是天生能够穿过血脑屏障的分子时，合适的给药途径为，例如胸骨内或颅内，例如直接地，将其给予侧脑室。当Nogo受体拮抗剂是天生能够穿过血脑屏障的分子时，或当可溶性Nogo受体多肽用于本发明方法，在所述方法中与Aβ肽的直接结合导致Aβ肽水平降低时，给药途径可以是如下所述的各种途径中的一种或多种。
用于本发明方法的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油脂性混悬剂(suspension)。这些混悬剂可根据本领域公知技术，用合适的分散剂或润湿剂及助悬剂(suspending agent)来配制。所述无菌可注射制剂也可是存在于无毒肠胃道外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如是溶于1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中可使用的有水、林格(Ringer′s)溶液及等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油类通常也作为溶剂或助悬介质(suspending medium)。为达到该目的，可使用包括合成的单-甘油酯或二-甘油酯的任何一种刺激性小的不挥发性油类。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，如同天然的药学上可接受的油类，例如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙烯型(version)，可用于可注射制剂的制备。这些油类溶液或混悬剂也可包含长链醇类稀释剂或分散剂，例如经常用于配制包括乳剂和混悬剂的药学上可接受剂型的羧甲基纤维素或类似的分散剂。为了配制目的，也使用其它常用的表面活性剂，例如Tweens、Spans以及其它常用于制备药学上可接受固体、液体或其它剂型的乳化剂或生物利用度增强剂。
肠道外剂型可以是单一大丸剂剂量、输注或加样(loading)大丸剂剂量，随后为维持剂量。这些组合物可一天一次给予或“按需”给予。
某些用于本发明方法的药物组合物可以任何经口可接受的剂型经口给予，所述剂型包括，如胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液。某些药物组合物也可通过鼻喷雾或吸入给予。可用苯甲醇或其它合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常用的增溶剂或分散剂将上述组合物制备为盐水溶液。
与载体材料一起制备单剂型的可溶性Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂的量会根据所治疗的宿主及给药的具体方式而改变。所述组合物可以单剂量、多剂量或在确定的时间段内在输注剂(infusion)中给予。给药方案也可调节以提供最佳期望响应(如，治疗或预防响应)。
本发明方法使用了可溶性Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂的“治疗有效量”或“预防有效量”。上述治疗或预防有效量可根据诸如个体病状、年龄、性别和体重的因素而改变。治疗或预防有效量也是治疗有益效果胜过任何有毒或有害效果的量。
对于任何特定患者而言，具体剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所使用的具体Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂，患者年龄、体重、全身健康、性别及饮食，以及给药时间、排泄率、联合用药和所要治疗的具体疾病的严重程度。医学护理工作者对上述因素的判断是本领域的常规技术。所述剂量也取决于所要治疗的患者个体、给药途径、配制剂的类型、所使用的化合物的特性、疾病的严重程度以及所期望的效果。所用剂量可通过本领域众所周知的药理学和药物代谢动力学原理来确定。
在本发明方法中，Nogo受体拮抗剂通常以脑室内或鞘内方式被直接给予到CNS，如给予到侧脑室。在本发明方法中，当可溶性Nogo受体多肽用于降低Aβ肽水平，所述可溶性Nogo受体多肽通常经静脉内给予。可配制根据本发明方法给药的组合物，以便给予剂量为每天0.001-10mg/kg体重的Nogo受体拮抗剂。在本发明的某些实施方案中，所述剂量是每天0.01-1.0mg/kg体重。在某些实施方案中，所述剂量是每天0.05-0.5mg/kg体重。
补充的活性化合物也可掺入本发明方法所使用的组合物中。例如，Nogo受体抗体或其抗原结合片段，或可溶性Nogo受体多肽或融合蛋白可与一种或多种附加治疗剂共同配制和/或共同给予。
本发明包含任何适于将可溶性Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂递送至所选择靶组织的方法，包括水溶液的大丸药注射(bolus injection of anaqueous solution)或可控制释放系统的植入。使用可控制释放的植入物减少了对重复注射的需求。
本发明方法所使用的可溶性Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂可被直接输注入脑内。用于化合物的直接脑输注的各种植入物是公知的，且它们在向患神经系统紊乱的人类患者递送治疗化合物中是有效的。这些包括使用泵向脑进行长期输注、脑功能区定位植入(stereotactically implanted)、临时性间质导管(interstitial catheter)、永久性颅内导管植入物以及通过外科手术植入的生物可降解植入物。参见，例如，Gill等，同上；Scharfen等，“High ActivityIodine-125 Interstitial Implant For Gliomas，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)583-91(1992)；Gaspar等，“Permanent125I Implants for RecurrentMalignant Gliomas，”Int.J.Radiation Oncologv Biol.Phys.43(5)977-82(1999)；Gildenberg等，Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill (1998)中的第66章，577-580页，Bellezza等，“StereotacticInterstitial Brachytherapy，”和Brem等，“The Safety of InterstitialChemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy inthe Treatment of Newly Diagnosed Malignant GliomasPhase I Trial，”J.Neuro-Oncolog26111-23(1995)。
所述组合物也可包含分散在生物相容的载体材料中的可溶性Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂，对于所述化合物而言，载体起合适的递送或支持系统的作用。持续释放载体的合适的例子包括以具有一定形状的制品形式(如栓剂或胶囊剂)存在的半透性聚合物基质。可植入的或微胶囊持续释放基质包括聚交酯(美国专利3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers22547-56(1985))、聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)、乙烯基乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.1298-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP 133,988)。
在本发明的某些实施方案中，可溶性Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂通过直接输注入脑的适当区域以给予患者。参见，例如Gill等，“Direct braininfusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinsondisease，”Nature Med.9589-95(2003)。存在备选的技术并可用它们来给予本发明的可溶性Nogo受体多肽或Nogo受体拮抗剂。例如，可使用Riechert-Mundinger单元和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位装置进行导管或植入物的脑功能区定位(stereotactic)放置。通过注射120ml碘海醇(omnipaque)和350mg碘/ml，用增强对比度的计算机体层摄影术(CT)以2mm切片厚度扫描可进行三维多层(multiplanar)治疗计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。该装置容许在磁共振成像研究基础上制定治疗计划，结合CT和MRI的靶信息可用于清楚的靶确认。
经改良与GE CT扫描仪(General Electric Company，Milwaukee，WI)一起使用(modified for use with)的Leksell脑功能区定位系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)脑功能区定位系统(Radionics，Burlington，MA)可用于该目的。因此，在植入当天早晨，BRW脑功能区定位器框架的环状底座圈可连接到患者的颅骨。使用夹在基底板上的石墨棒定位器框架可获得以3mm间隔穿过(though)(靶组织)区域的连续CT切片。可在VAX 11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上通过用石墨棒图像的CT坐标以在CT空间和BRW空间之间进行绘图，从而运行计算机化治疗计划方案。
实施例实施例1在阿尔茨海默病中NgR和Nogo的亚细胞定位发生改变我们从NIH资助的哈佛脑组织资源中心(Harvard Brain Tissue ResourceCenter)获得了患阿尔茨海默病(AD)的匿名人类患者和对照的脑组织样品，并使用抗NogoA和抗NgR抗体用组织学方法研究了所述样本中NogoA和NgR的定位(参见Wang等，J.Neurosci.225505-15(2002))。检查了6个对照和6个AD病例中来自海马和Broadman氏44区的组织。通过抗原封闭和免疫印迹中单一免疫反应条带的存在证实了染色的特异性。
在对照的成人脑中，在细胞染色很少的这些脑区的神经毡中可以弥散性颗粒状图像检测到NogoA的免疫反应性。相比之下，在所有的AD病例中，NogoA明显移动到神经元细胞体(cell body)。NgR定位以相反方式发生移动。对照病例中NgR蛋白的最高浓度发现于细胞体(cell soma)中，而在AD病例中，脑显示出弥散性神经毡免疫反应性及很少的细胞染色。使用抗NgR抗体的免疫印迹分析证实了这不是由于NgR水平的改变，并且接着用抗NogoA抗体进行染色清楚地指出这也不是由于神经元的缺失。除了NgR向细胞体之外的移动，我们还观察到NgR在淀粉样蛋白斑中集中，并且对Aβ和NgR的双重免疫组化证实了这两种蛋白共同定位于这些沉积物中。这些发现提示NogoA/NgR途径在AD病理学中起作用。
实施例2APP和多种形式的Aβ肽与NgR的相互作用基于这些观察结果，我们测试了NogoA或NgR是否与APP直接相互作用。在COS-7细胞中表达NgR的表位标记的构建体(如Liu等，Science2971190-93(2002)描述来构建的NgR-myc)和APP(APP-V5；I.M.A.G.E.克隆#5259793被亚克隆入pcDNA3.1-V5His形成与APP-695的C-末端融合物)，并用抗-V5和抗-myc抗体进行免疫沉淀反应。接着用抗-V5、抗-myc和抗-NgR抗体来检测所述免疫沉淀材料的免疫印迹。免疫沉淀反应研究表明APP与NgR是特异性相连的。使用抗-NogoA在免疫沉淀物中并没有检测到NogoA。我们也监测了表位标记的APP在经转染的COS-7细胞中的定位，并发现对照中大多数蛋白的胞内定位在核周区，但NgR与APP的共表达使大多数APP的定位转移到细胞表面。此外，在经转染细胞的双标记试验中APP和NgR定位是相同的。细胞APP表达的总水平并不为NgR共表达所改变。而且，天然APP和NgR蛋白也共同定位在初级神经元中，这可通过用抗-APP(Santa Cruz Biotechnology)和抗-NgR抗体检测来确定。这些结果证实了NgR与APP物理相连。
我们接着研究了APP的Aβ区是否与它和NgR的相互作用相关—包括原纤维生成性Aβ42-3肽是否与NgR结合。我们通过将编码序列与载体pAP-6(Nakamura等，Neuron21093-1100，1988)的信号序列-6xHis-胎盘碱性磷酸酶(AP)序列在框内融合，制备了两种包含碱性磷酸酶(AP)和Aβ的亲水区(氨基酸1-28)的融合蛋白构建体。AP-Aβ和Aβ-AP蛋白都与表达NgR的COS细胞结合，但不与载体-转染的COS细胞结合。该结合是可饱和的，表观Kd为60nM。也可使用纯化的生物素-Aβ(1-40)在ELISA类测定法中用固定的NgR检测相互作用。与之相反，在任一这些试验中，相反(reverse)的40-1肽无法与固定的NgR相互作用。我们在4℃用表达人NgR-1的人SKNMC细胞与Fluo-Aβ42温育2小时，发现原纤维生成性Aβ42肽与这些细胞结合。
如下所述，我们也测试了Aβ肽与可溶性NgR多肽，sNgR310(参见，例如PCT/US03/25004)的结合。将sNgR310固定在微量滴定板上并在4℃加入生物素-Aβ1-40或生物素-Aβ40-1达16个小时。在除去未结合的肽后，使用抗生物素蛋白链菌素偶联的HRP来检测已结合的生物素-Aβ。如同全长NgR的情况一样，我们观察到生物素-Aβ1-40，而不是生物素-Aβ40-1与sNgR310结合。在存在抗-NgR抗体，诸如单克隆抗体HB 7E11(描述于PCT/US03/25004)的条件下，我们也进行了这些试验，并发现生物素-Aβ1-40的结合可被抗-NgR抗体抑制。在独立试验中，我们证实了抗-NgR抗体也抑制生物素Aβ1-40与表达大鼠NgR1的COS7细胞或表达人NgR1的SKNMC细胞的结合。总之，这些数据证实了APP及Aβ肽的天然存在形式与NgR直接发生相互作用。
Aβ(1-28)与NgR相互作用的特异性和选择性可以几种方式进行探查。所述相互作用对于NgR1是特异的，因为NgR2或NgR3-两者与NgR都具有序列相似性—都不结合Aβ-AP。此外，我们观察到物种特异性人NgR与人Aβ的结合超过小鼠NgR与人Aβ的结合，或人NgR与小鼠Aβ的结合，或小鼠NgR与小鼠Aβ的结合。最后，我们研究了从产生自我们实验室的ngr-/-小鼠(这些小鼠缺失了NgR的外显子II且不产生NgR蛋白)培养的神经元细胞(neuron)，发现它们与NogoA的Nogo-66片段(参见，例如国际专利申请PCT/US01/0104和PCT/US02/32007)或Aβ肽都不结合。这些数据证实了NgR是针对Aβ(1-28)的初级神经元细胞表面结合位点。
为了进一步详细说明哪个残基是NgR相互作用所必需的，我们制备了Aβ(1-28)肽中有若干缺失的AP融合蛋白，并通过测定AP活性来监测与COS-7细胞表达的NgR的结合。氨基末端7个残基的缺失并不改变与NgR的结合，但氨基末端14个残基的缺失适度地降低了与NgR的结合。然而，氨基酸1-16的缺失却使其不与NgR结合。在Aβ(1-28)的羧基末端截短了7个氨基酸的突变体与NgR无亲和力。因此，氨基酸7-28与对NgR的亲和力相关，且氨基酸15-28是特别重要的。与这些观察结果一致，我们发现了天然β-分泌酶肽产物(包含氨基酸8-21)而非α-分泌酶剪接产物(在氨基酸17处被蛋白水解)与NgR结合。
实施例3NgR上Aβ结合的位点不同于被髓磷脂配体结合的位点通过在存在不同浓度的竞争性游离Aβ的条件下，让250nm可溶性AP-Aβ(1-28)或AP-Nogo(1-33)结合到包被了纯化的sNgR310-Fc的孔，我们分析了Aβ(1-28)是否与其它已知的NgR的配体来竞争性地结合NgR。在类似的试验中，我们也测试了生物素-Aβ(1-40)是否与大鼠sNgR344-Fc结合。我们观察到Aβ肽与sNgR310-Fc及sNgR344-Fc都结合。因此，Aβ肽—类似于NgR的其它配体—需要NgR蛋白完整的LRR区用于结合，但不需要残基310-450的羧基尾部。但是，在竞争性试验中，Aβ(1-28)取代了Aβ-AP的结合，但不取代AP-Nogo-66(1-33)或AP-OMgp的结合。在我们的试验中Aβ肽在高浓度才稍微开始取代AP-MAG。因此，NgR上的Aβ结合位点看来明显不同于对髓磷脂配体NogoA、OMgp和MAG的结合位点。与之相一致的是，Aβ的存在对髓磷脂或Nogo-66抑制轴突突起(outgrowth)几乎没有影响。
实施例4NgR加强Aβ的产生因为AD发病的关键步骤之一是从APP蛋白水解产生Aβ，我们评估了NgR对该过程的影响。我们用NgR转染HEK293T细胞并观察到来自于这些细胞的条件培养基中含有水平低但为可检测的Aβ，与在表达FAD突变体APPsw的细胞中所观察的情况具有可比性，表明了β-分泌酶加工增加。存在NgR也使α-分泌酶加工增加，这一点在NgR表达也使sAPPα水平上升的事实中得到证明。
为了调查在体内NgR/Aβ相互作用对APP加工的意义，将来自于APPsw/PSEN-1(DeltaE9)小鼠的APPsw转基因(APPsw transgene)繁殖入无NgR背景。如下所述检测3月龄小鼠的脑抽提物中的Aβ和sAPPα水平。用0.1M甲酸抽提前脑，用Tris中和并在10,000×g离心澄清。通过使用免疫沉淀反应及免疫印迹测定脑抽提物中的sAPPα水平，所述免疫沉淀反应使用了抗氨基末端-APP 22C11抗体(Chemicon)，所述免疫印迹使用了抗-Aβ(1-17)6E10抗体(Chemicon)。与同窝出生的配对的对照小鼠相比，在生理条件下缺少NgR明显地减少了Aβ和sAPPα的产生。这些结果证实了NgR在体内上升的Aβ形成中起作用。
实施例5原纤维生成性Aβ42肽促进Aβ肽与NgR的结合我们研究了NgR和Aβ肽之间的相互作用在聚集体形成中是否起作用。将sNgR310固定在微量滴定板上，并加入生物素-Aβ40和Aβ42肽。我们使用抗生物素蛋白链菌素HRP定量已结合的生物素-Aβ40肽，并发现增加Aβ42肽的浓度能以剂量依赖性方式增强生物素-Aβ40肽的结合。我们使用表达人NgR1的SKNMC细胞证实了这些数据，并发现Aβ42肽再次以剂量依赖性方式增强了生物素-Aβ40肽与细胞的结合。我们也发现抗-NgR抗体抑制了由Aβ42-肽-介导的、使生物素-Aβ40与表达人NgR1的SKNMC细胞结合增强的作用。这些结果表明干扰NgR/Aβ的相互作用抑制了Aβ肽聚集体的形成。
实施例6使用NgR拮抗剂治疗减少了Aβ斑块沉积为调查NgR/APP/Aβ相互作用在体内所起的作用，将sNgR310-Fc(一种NgR拮抗剂；参见国际专利申请PCT/US03/25004)输注入APPsw/PSEN-1(DeltaE9)双转基因小鼠中(来自于Jackson实验室)。该sNgR310-Fc蛋白包含与IgG的Fc部分融合的NgR的完整LRR配体结合(the entire LRRligand-binding of the NgR)。为给予sNgR310-Fc蛋白，用异氟烷/氧气麻醉5月龄小鼠并在颅骨上用钻锥钻孔(burr hole)。在前囟点立体定位坐标后(posterior)0.6mm和横向(lateral)1.2mm处，将插管(ALZET脑输注试剂盒II，Alza Scientific Products，Palo Alto，CA)插入右侧脑室中，距软膜表面4.0mm深。用氰基丙烯酸酯使插管支撑在适当的位置(held in place)并将导管与皮下渗透微型泵(Alzet 2ML4)连接。该泵以2.5μl/hr输送1.2mg/mlsNgR310-Fc溶液或大鼠IgG PBS溶液28天(对照小鼠接受了大鼠IgG，因为NgR和Fc部分皆为大鼠来源的)。28天后换泵并连接到相同的插管上。在56天中，输注的蛋白总剂量为每只小鼠2.5mg。在此阶段末期，将小鼠处死并使用来自于Biosource International的ELISA试剂盒，根据厂商的说明书测定脑Aβ水平。如下用抗-Aβ免疫组化反应来评估淀粉样蛋白斑中的Aβ沉积。在用0.1M甲酸处理用于抗原回收后，使用抗-Aβ(1-17)6E10抗体对4％低聚甲醛固定的脑的矢状切面中的Aβ斑块进行免疫组织学检测。对来自每只动物的3张切片用NIH图像来定量斑块区域占脑皮质区的百分比。
在sNgR310-Fc处理的小鼠中，免疫反应性Aβ在斑块中的沉积明显减少。此外，在这些小鼠的脑中Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的总水平降低了50％。在这些小鼠中Aβ水平和淀粉样蛋白斑沉积密切相关，提示sNgR310-Fc改变APP/Aβ代谢的程度超过改变Aβ聚集的程度。然而，我们的数据表明sNgR310-Fc的存在减少了Aβ的产生及其在斑块中的沉积。也通过免疫沉淀反应和免疫印迹分析测定了α-分泌酶产物sAPPα。在sNgR310-Fc处理的动物脑中sAPPα水平下降的程度与Aβ水平下降的程度类似，这表明sNgR310-Fc在体内抑制了α-分泌酶和β-分泌酶的加工。
虽然为了清楚理解本发明的目的，已经通过例证以及实施例对上述发明进行了具体描述，但是根据本发明的教导，对本发明进行某些改变和修饰但不违背所附的权利要求的精神或保护范围对于本领域技术人员而言是显而易见的。
申请人STRITTMATTER，Stephen，M.等申请号PCT/US04/011728申请日2004年4月16日标题治疗淀粉样蛋白斑相关性病症的NOGO-受体拮抗剂代理人号A229 PCT针对说明书所指的被保藏生物材料的专业技术人员获得方案(expert solution)的相关说明对于被保藏生物材料的说明已经全部包括在说明书中。如下附加说明不要求作为说明书的一部分，而应被视为“单独的说明”。它们仅涉及专业技术人员获得方案。
如下附加说明涉及在说明书中被称为“HB 1H2”的被保藏生物材料；出现在说明书第3页31行；以及权利要求书第3页35项。
它在2002年8月9日以保藏号PTA-4584保藏于美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美国该附加说明是针对1)对CA(加拿大)的指定对于对加拿大的指定，根据加拿大专利法的专利细则(Patent Rule)107和108条，从该申请被授予加拿大专利起，或从该申请被驳回、放弃并不再恢复、或撤回之日起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式(by the issue of a sample)来提供给由委托人(commissioner)提名的独立专业技术人员(细则104(4))。
2)对EP(欧洲专利)的指定对于对欧洲专利组织(EPO)的指定，根据EPC实施细则条款(Rule)28(3)，从授予该申请欧洲专利的公告(mention)被公开起，或者如果该申请被驳回或撤回或视撤，则自其申请日起计算20年起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式来提供给由请求者(requester)提名的专业技术人员(Rule 28(4)EPC)。
3)对FI(芬兰)的指定对于对芬兰的指定，从芬兰国家专利与注册委员会(the NationalBoard of Patents and Registration)授予该申请专利权的公告被公开起，或者如果芬兰国家专利与注册委员会最终决定不授予该申请专利权，则自其申请日起计算20年起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
4)对GB(英国)的指定对于对英国的指定，申请人声明其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
5)对IS(冰岛)的指定对于对冰岛的指定，从冰岛专利局授予该申请专利权起，或者如果冰岛专利局最终决定不授予该申请专利权，从冰岛专利局作出最终决定起，被保藏生物材料的样本的提供才对本领域专业技术人员生效。
6)对SE(瑞典)的指定对于对瑞典的指定，从瑞典专利局决定该申请对公众查阅开放起，或者从瑞典专利局最终决定不对公众查阅开放起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
7)对SG(新加坡)的指定根据专利细则第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the FourthSchedule to the Patents Rule 1995)，申请人声明其意愿，仅对专业技术人员提供上述已鉴定培养物的样本。
申请人STRITTMATTER，Stephen，M.等申请号PCT/US04/011728申请日2004年4月16日标题治疗淀粉样蛋白斑相关性病症的NOGO-受体拮抗剂代理人号A229 PCT针对说明书所指的被保藏生物材料的专业技术人员获得方案(expert solution)的相关说明对于被保藏生物材料的说明已经全部包括在说明书中。如下附加说明不要求作为说明书的一部分，而应被视为“单独的说明”。它们仅涉及专业技术人员获得方案。
如下附加说明涉及在说明书中被称为“HB 2F7”的被保藏生物材料；出现在说明书第4页1-2行；以及权利要求书第3页35项。
它在2002年8月9日以保藏号PTA-4585保藏于美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美国该附加说明是针对1)对CA(加拿大)的指定对于对加拿大的指定，根据加拿大专利法的专利细则(patent Rule)107和108条，从该申请被授予加拿大专利起，或从该申请被驳回、放弃并不再恢复、或撤回之日起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式(by the issue of a sample)来提供给由委托人提名的独立专业技术人员(Rule 104(4))。
2)对EP(欧洲专利)的指定对于对欧洲专利组织(EPO)的指定，根据EPC实施细则条款(Rule)28(3)，从授予该申请欧洲专利的公告(mention)被公开起，或者如果该申请被驳回或撤回或视撤，自其申请日起计算20年起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式来提供给由请求者(requester)提名的专业技术人员(Rule 28(4)EPC)。
3)对FI(芬兰)的指定对于对芬兰的指定，从芬兰国家专利与注册委员会(the NationalBoard of Patents and Registration)授予该申请专利权的公告被公开起，或者如果芬兰国家专利与注册委员会最终决定不授予该申请专利权，自其申请日起计算20年起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
4)对GB(英国)的指定对于对英国的指定，申请人公开其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
5)对IS(冰岛)的指定对于对冰岛的指定，从冰岛专利局授予该申请专利权起，或者如果冰岛专利局最终决定不授予该申请专利权，从冰岛专利局作出最终决定起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
6)对SE(瑞典)的指定对于对瑞典的指定，从瑞典专利局决定该申请对公众查阅开放起，或者从瑞典专利局最终决定不对公众查阅开放起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
7)对SG(新加坡)的指定对于对新加坡的指定，根据专利细则第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申请人公开其意愿，仅对专业技术人员提供上述已鉴定培养物的样本。
申请人STRITTMATTER，Stephen，M.等申请号PCT/US04/011728申请日2004年4月16日标题治疗淀粉样蛋白斑相关性病症的NOGO-受体拮抗剂代理人号A229 PCT针对说明书所指的被保藏生物材料的专业技术人员获得方案(expert solution)的相关说明对于被保藏生物材料的说明已经全部包括在说明书中。如下附加说明不要求作为说明书的一部分，而应被视为“单独的说明”。它们仅涉及专业技术人员获得方案。
如下附加说明涉及在说明书中被称为“HB 3G5”的被保藏生物材料；出现在说明书第3页31行至第4页1行；以及权利要求书第3页35项。
它在2002年8月9日以保藏号PTA-4586保藏于美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美国该附加说明是针对1)对CA(加拿大)的指定对于对加拿大的指定，根据加拿大专利法的专利细则(Patent Rule)107和108条，从该申请被授予加拿大专利起，或从该申请被驳回、放弃并不再恢复、或撤回之日起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式(by the issue of a sample)来提供给由委托人提名的独立专业技术人员(Rule 104(4))。
2)对EP(欧洲专利)的指定对于对欧洲专利组织(EPO)的指定，根据EPC实施细则条款(Rule)28(3)，从授予该申请欧洲专利的公告(mention)被公开起，或者如果该申请被驳回或撤回或视撤，自其申请日起计算20年起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式来提供给由请求者(requester)提名的专业技术人员(Rule 28(4)EPC)。
3)对FI(芬兰)的指定对于对芬兰的指定，从芬兰国家专利与注册委员会(the NationalBoard of Patents and Registration)授予该申请专利权的公告被公开起，或者如果芬兰国家专利与注册委员会最终决定不授予该申请专利权，自其申请日起计算20年起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
4)对GB(英国)的指定对于对英国的指定，申请人公开其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
5)对IS(冰岛)的指定对于对冰岛的指定，从冰岛专利局授予该申请专利权起，或者如果冰岛专利局最终决定不授予该申请专利权，从冰岛专利局作出最终决定起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
6)对SE(瑞典)的指定对于对瑞典的指定，从瑞典专利局决定该申请对公众查阅开放起，或者从瑞典专利局最终决定不对公众查阅开放起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
7)对SG(新加坡)的指定对于对新加坡的指定，根据专利细则第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申请人公开其意愿，仅对专业技术人员提供上述已鉴定培养物的样本。
申请人STRITTMATTER，Stephen，M.等申请号PCT/US04/011728申请日2004年4月16日标题治疗淀粉样蛋白斑相关性病症的NOGO-受体拮抗剂代理人号A229 PCT针对说明书所指的被保藏生物材料的专业技术人员获得方案(expert solution)的相关说明对于被保藏生物材料的说明已经全部包括在说明书中。如下附加说明不要求作为说明书的一部分，而应被视为“单独的说明”。它们仅涉及专业技术人员获得方案。
如下附加说明涉及在说明书中被称为“HB 7E11”的被保藏生物材料；出现在说明书第3页30-31行；以及权利要求书第3页35项。
它在2002年8月9日以保藏号PTA-4587保藏于美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美国该附加说明是针对1)对CA(加拿大)的指定对于对加拿大的指定，根据加拿大专利法的专利细则(Patent Rule)107和108条，从该申请被授予加拿大专利起，或从该申请被驳回、放弃并不再恢复、或撤回之日起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式(by the issue of a sample)来提供给由委托人提名的独立专业技术人员(Rule 104(4))。
2)对EP(欧洲专利)的指定对于对欧洲专利组织(EPO)的指定，根据EPC实施细则条款(Rule)28(3)，从授予该申请欧洲专利的公告(mention)被公开起，或者如果该申请被驳回或撤回或视撤，自其申请日起计算20年起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式来提供给由请求者(requester)提名的专业技术人员(Rule 28(4)EPC)。
3)对FI(芬兰)的指定对于对芬兰的指定，从芬兰国家专利与注册委员会(the NationalBoard of Patents and Registration)授予该申请专利权的公告被公开起，或者如果芬兰国家专利与注册委员会最终决定不授予该申请专利权，自其申请日起计算20年起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
4)对GB(英国)的指定对于对英国的指定，申请人公开其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
5)对IS(冰岛)的指定对于对冰岛的指定，从冰岛专利局授予该申请专利权起，或者如果冰岛专利局最终决定不授予该申请专利权，从冰岛专利局作出最终决定起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
6)对SE(瑞典)的指定对于对瑞典的指定，从瑞典专利局决定该申请对公众查阅开放起，或者从瑞典专利局最终决定不对公众查阅开放起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
7)对SG(新加坡)的指定对于对新加坡的指定，根据专利细则第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申请人公开其意愿，仅对专业技术人员提供上述已鉴定培养物的样本。
申请人STRITTMATTER，Stephen，M.等申请号PCT/US04/011728申请日2004年4月16日标题治疗淀粉样蛋白斑相关性病症的NOGO-受体拮抗剂代理人号A229 PCT针对说明书所指的被保藏生物材料的专业技术人员获得方案(expert solution)的相关说明对于被保藏生物材料的说明已经全部包括在说明书中。如下附加说明不要求作为说明书的一部分，而应被视为“单独的说明”。它们仅涉及专业技术人员获得方案。
如下附加说明涉及在说明书中被称为“HB 5B10”的被保藏生物材料；出现在说明书第4页1行；以及权利要求书第3页35项。
它在2002年8月9日以保藏号PTA-4588保藏于美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美国该附加说明是针对1)对CA(加拿大)的指定对于对加拿大的指定，根据加拿大专利法的专利细则(Patent Rule)107和108条，从该申请被授予加拿大专利起，或从该申请被驳回、放弃并不再恢复、或撤回之日起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式(by the issue of a sample)来提供给由委托人提名的独立专业技术人员(Rule 104(4))。
2)对EP(欧洲专利)的指定对于对欧洲专利组织(EPO)的指定，根据EPC实施细则条款(Rule)28(3)，从授予该申请欧洲专利的公告(mention)被公开起，或者如果该申请被驳回或撤回或视撤，自其申请日起计算20年起，才可以将所述被保藏生物材料的样本仅仅以发放样本的方式来提供给由请求者(requester)提名的专业技术人员(Rule 28(4)EPC)。
3)对FI(芬兰)的指定对于对芬兰的指定，从芬兰国家专利与注册委员会(the NationalBoard of Patents and Registration)授予该申请专利权的公告被公开起，或者如果芬兰国家专利与注册委员会最终决定不授予该申请专利权，自其申请日起计算20年起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
4)对GB(英国)的指定对于对英国的指定，申请人公开其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
5)对IS(冰岛)的指定对于对冰岛的指定，从冰岛专利局授予该申请专利权起，或者如果冰岛专利局最终决定不授予该申请专利权，从冰岛专利局作出最终决定起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
6)对SE(瑞典)的指定对于对瑞典的指定，从瑞典专利局决定该申请对公众查阅开放起，或者从瑞典专利局最终决定不对公众查阅开放起，才仅对本领域专业技术人员提供被保藏生物材料的样本。
7)对SG(新加坡)的指定对于对新加坡的指定，根据专利细则第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申请人公开其意愿，仅对专业技术人员提供上述已鉴定培养物的样本。
权利要求
1.一种用于降低哺乳动物中Aβ肽水平的方法，包含给予治疗有效量的可溶性Nogo受体多肽。
2.权利要求1的方法，其中Aβ肽水平的升高与疾病、紊乱或病症相关。
3.权利要求2的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是阿尔茨海默病。
4.权利要求1的方法，其中可溶性Nogo受体多肽通过大丸药注射或长期输注给予。
5.权利要求4的方法，其中可溶性Nogo受体多肽经静脉内给予。
6.权利要求4的方法，其中可溶性Nogo受体多肽被直接给予中枢神经系统。
7.权利要求6的方法，其中可溶性Nogo受体多肽被直接给予侧脑室。
8.权利要求1-3任一的方法，其中可溶性Nogo受体多肽是哺乳动物NgR1的可溶性形式。
9.权利要求8的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
10.权利要求8的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
11.权利要求8的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
12.权利要求8的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
13.权利要求8的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式进一步包含融合部分。
14.权利要求13的方法，其中融合部分是免疫球蛋白部分。
15.权利要求14的方法，其中免疫球蛋白部分是Fc部分。
16.权利要求1-3任一的方法，其中治疗有效量为0.001mg/kg-10mg/kg。
17.权利要求16的方法，其中治疗有效量为0.01mg/kg-1.0mg/kg。
18.权利要求17的方法，其中治疗有效量为0.05mg/kg-0.5mg/kg。
19.一种预防或治疗哺乳动物中与Aβ肽斑块相关的疾病、紊乱或病症的方法，包含给予治疗有效量的NgR1拮抗剂。
20.权利要求19的方法，其中所述斑块位于中枢神经系统中。
21.权利要求20的方法，其中所述疾病、紊乱或病症是阿尔茨海默病。
22.权利要求19-21任一的方法，其中NgR1拮抗剂被直接给予中枢神经系统。
23.权利要求22的方法，其中NgR1拮抗剂被直接给予侧脑室。
24.权利要求22的方法，其中NgR1拮抗剂通过大丸药注射或长期输注给予。
25.权利要求19-21任一的方法，其中NgR1拮抗剂包含哺乳动物NgR1的可溶性形式。
26.权利要求25的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
27.权利要求25的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
28.权利要求25的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
29.权利要求25的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10个保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜结构域，和(ii)功能性信号肽。
30.权利要求25的方法，其中哺乳动物NgR1的可溶性形式进一步包含融合部分。
31.权利要求30的方法，其中融合部分是免疫球蛋白部分。
32.权利要求31的方法，其中免疫球蛋白部分是Fc部分。
33.权利要求19-21任一的方法，其中NgR1拮抗剂包含与哺乳动物NgR1结合的抗体或其抗原结合片段。
34.权利要求33的方法，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、Fd片段、二价抗体或单链抗体。
35.权利要求33的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与产生自杂交瘤的单克隆抗体所结合的多肽结合，所述杂交瘤选自HB 7E11(ATCC保藏号PTA-4587)、HB 1H2(ATCC保藏号PTA-4584)、HB 3G5(ATCC保藏号PTA-4586)、HB 5B10(ATCC保藏号PTA-4588)或HB 2F7(ATCC保藏号PTA-4585)。
36.权利要求35的方法，其中所述单克隆抗体产生自HB 7E11杂交瘤。
37.权利要求36的方法，其中多肽包含选自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)、LDLSDNAQLR(SEQID NO8)、LDLSDDAELR(SEQ ID NO9)、LDLASDNAQLR(SEQ IDNO10)、LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)、LDALSDNAQLR(SEQID NO12)、LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)、LDLSSDNAQLR(SEQID NO14)、LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)、DNAQLRVVDPTT(SEQID NO16)、DNAQLR(SEQ ID NO17)、ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID NO18)、LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO19)、LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO20)、LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQID NO21)或LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO22)的氨基酸序列。
38.权利要求36的方法，其中多肽由选自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)、LDLSDNAQLR(SEQID NO8)、LDLSDDAELR(SEQ ID NO9)、LDLASDNAQLR(SEQ IDNO10)、LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)、LDALSDNAQLR(SEQID NO12)、LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)、LDLSSDNAQLR(SEQID NO14)、LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)、DNAQLRVVDPTT(SEQID NO16)、DNAQLR(SEQ ID NO17)、ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID NO18)、LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO19)、LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO20)、LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQID NO21)或LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO22)的氨基酸序列组成。
39.权利要求19-21任一的方法，其中治疗有效量为0.001mg/kg-10mg/kg。
40.权利要求39的方法，其中治疗有效量为0.01mg/kg-1.0mg/kg。
41.权利要求40的方法，其中治疗有效量为0.05mg/kg-0.5mg/kg。
全文摘要
本发明提供了通过给予Nogo受体拮抗剂用于治疗异常淀粉样蛋白－β(Aβ)肽沉淀相关性疾病的方法，所述疾病包括阿尔茨海默病。本发明也提供了通过给予可溶性Nogo受体多肽用于降低哺乳动物中Aβ肽水平的方法。
文档编号A61K38/16GK1832752SQ200480016919
公开日2006年9月13日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月16日
发明者斯蒂芬·M·斯特里特马特, 丹尼尔·H·S·李, 李维维 申请人:耶鲁大学, 比奥根艾迪克Ma公司