专利名称：人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，涉及一种人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法。
背景技术：
胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂是一种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂，存在于哺乳动物的消化系统。胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂是一种由胰腺腺泡细胞合成，并和各种淀粉酶，脂肪酶，蛋白水解酶等一起分泌到胆汁。
胰腺分泌的蛋白水解酶有很大一部分是内源性蛋白水解酶，包括胰蛋白酶，糜蛋白酶，弹性蛋白酶等。这些蛋白水解酶可以水解蛋白之间的肽键，也会导致胰腺自身的损伤。体内有几种方式确保蛋白水解酶在一定的情况下以失活的状态存在以免造成自体损伤以蛋白酶原形式存在于胰腺的导管当中；以酶原颗粒的方式包装起来；分泌蛋白酶抑制剂抑制小部分被激活的蛋白酶原。
胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂是一多功能抑制剂，能够有效抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、溶血纤维蛋白酶及各种组织或血浆激肽释放酶等多种蛋白水解酶的活性，减少溶酶体酶释放，改善循环状况和组织灌注，抑制炎症介质产生和释放。
人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂在治疗急性胰腺炎，烧伤后的休克及产后大出血等疾病，有独特的疗效；是治疗上述疾病最适合的胰蛋白酶抑制剂药物人源性蛋白，不会产生免疫原反应被机体的免疫系统清除，可延长药物的效应；作为一种小分子蛋白(分子量只有6.2KD)，能通过肾小球滤过膜，因此可高效抑制释放到外周体液的蛋白水解酶。
天然的人源性胰蛋白酶抑制剂需要从人的胆汁中分离提取，纯化步骤繁琐，材料来源极少，难以大量获取。基因重组技术可以提供一个大量获得重组人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的方法。通过基因重组技术获得的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，具有和天然人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂相同的氨基酸序列和二级结构，相当的抑制胰蛋白酶的活性，可具同样的治疗效果。
发明内容
本发明采用基因工程技术制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，以克服从人体组织中提取，成本高且来源少等缺点。
本发明采用真核分泌表达的方法来制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，包括(1)具有工程菌密码子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的合成以及表达载体的构建；(2)工程菌的构建及发酵；(3)重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的制备与纯化。
本发明的目的可以通过以下措施来达到(1)具有毕赤酵母工程菌密码子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂全基因序列的合成以及表达载体的构建的具体方法如下按毕赤酵母密码子偏好性化学合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因，其核苷酸序列为5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAACGGTTGTACCAAAATTTATGATCCAGTTTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAGACCTCTATTCTGATTCAGAAATCTGGTCCATGT-3’(2)设计引物，以所合成的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因为模板，进行PCR扩增；(3)将所获得的编码人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因克隆在质粒中，进行DNA序列测序分析与所设计的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因序列完全相符；(4)经序列分析后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因克隆到商业化表达载体pPIC9K，转化甲醇酵母菌株KM71；(5)对甲醇酵母菌株KM71进行甲醇诱导表达。
上清中的表达产物经过层析柱等分离纯化，最终获得具有人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂生物活性的重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂产物。该重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂具有生物活性，该重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂能够有效抑制胰蛋白酶的活性。
本发明的优点1.对人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂在真核细胞甲醇酵母中进行分泌表达，简化后继的纯化步骤。
2.采用离子交换层析和分子筛层析方法进行纯化人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，比其他所报道的亲和层析更简单，成本更低。
3.经高密度发酵表达后可获得高达0.9g/L的高表达量，比以往报道的重组表达人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的表达量高18倍。
图1为人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的PCR电泳结果。
M100bp DNAmarker；1，2阴性对照；3，4PCR目的条带。
图2为含人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的pPIC9K-rHuPSTI表达质粒酶切鉴定图。
1100bp DNA marker；2pPIC9K-rHuPSTI Xho I/Not I双酶切。
图3为pPIC9K-rHuPSTI表达质粒酶切线性化电泳图。
1wide range marker；2线性化后的pPIC9K-rHuPSTI表达质粒；3环状的pPIC9K-rHuPSTI质粒。
图4是重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂发酵上清表达产物SDS-PAGE分析图谱。
1发酵上清；2G25分子筛穿过峰；3QXL阴离子层析柱穿过峰；4QXL阴离子层析柱洗脱峰；5分子筛分离的目的蛋白。
图5为含基因rHuPSTI的重组表达质粒pPIC9K-rHuPSTI构建图。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的制备作详细描述实施例1重组表达质粒pPIC9K-rHuPSTI的构建1.试剂与材料载体质粒pPICZαA和pPIC9K购自Invitrogen公司；表达菌株KM71购自Invitrogen公司，重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因由上海博亚生物技术公司合成；限制性内切酶和T4DNA连接酶购自New England公司，PCR引物由上海博亚生物技术公司合成，胶回收试剂盒购自Omega生物技术公司。
2.方法(1)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的合成I.引物合成由于该基因核苷酸序列较长，直接合成目的基因较难，因此经过从技术上以及经济上的考虑后，通过合成四段引物经过PCR的方法扩增出全长的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因。
1.5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAA-3’2.5’-TGTTACCATCGGTACCACAAACTGGATCATAAATTTTGGTACAACCGTTCAGTTCGTTATAACATTT-3’3.5’-TTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAG-3’4.5’-ACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAATAGAGGTCTGACGTTTACGGTTTTCAA-3’II.PCR扩增取上述四段引物各50pmol混合于同一管PCR反应体系中，再分别加入5ul 10×的PCR缓冲液，4ul 2.5mM dNTP以及0.25U Taq酶，并用H2O定容到50ul。通过PCR扩增获得改造后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因。PCR扩增的条件为 PCR扩增，电泳检测，发现在200bp附近出现预期的特异性扩增带(见图1)，回收此带，获得改造所得的改造后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因全长。
(2)寡核苷酸引物上游引物5’-AAACTAGAGAAAGAGAGGCTGAAGCTGATTCTCTGGGTCGTGAAGC-3’下游引物5’-TTTGCGGCCGCTTAACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAA-3’上游引物内含Xho I酶切位点(单下划线)、pPICZαA载体上部分序列(双下划线)，下游引物内含NotI(单下划线)酶切位点和强终止子(双下划线)。
(3)PCR扩增以(1)中所获得的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因为模板，取上游引物和下游引物然后进行PCR反应，反应条件为94℃变性5分钟，进入循环，94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸60秒，共30个循环，再在72℃延伸10分钟。
将PCR扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收。
(4)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因克隆质粒(pPIC9K-rHuPSTI)的构建回收的电泳产物经过核酸内切酶Xho I和Not I的酶切，PCR扩增产物先以Xho I/Not I的组合克隆到pPICZαA质粒上构建成pPICZαA-rHuPSTI克隆载体更换酶切窗口，然后以Sac I/Not I的组合克隆到表达载体克隆到载体pPIC9K上，得到重组表达载体pPIC9K-rHuPSTI(其构建过程如图5所示)。pPIC9K-rHuPSTI经Xho I/Not I进行双酶切鉴定(酶切结果见图2)。克隆载体pPiCZαA-rHuPSTI和表达载体pPIC9K-rHuPSTI中的外源基因经测序鉴定正确，与原来设计的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因完全相符。
(5)工程菌的建立用Sac I单酶切人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因克隆质粒(pPIC9K-rHuPSTI)，使质粒线性化(见图3)，按照Invitrogen操作手册，将上述线性化的质粒转化KM71毕赤酵母感受态细胞。在营养缺陷型培养基MD琼脂糖平板上挑取单菌落，接种于100mlBMGY培养基，在30℃以280rpm转速振摇24个小时，使酵母菌的菌密度OD600＝5左右。在室温以5000g离心5分钟，去上清，用20ml BMMY培养基稀释菌体，每隔24小时加入甲醇至终浓度为1％以诱导人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的分泌表达，比较个菌株的表达率。选取最高表达量的菌株作为后继实验的种子工程菌KM71(pPIC9K-HuPSTI)进行后续的实验。
实施例2毕赤酵母工程菌KM71(pPIC9K-HuPSTI)的发酵1.工程菌工程菌KM71(pPIC9K-HuPSTI)；2.培养基一级种子菌活化用YPD培养基(g/L)蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g二级种子菌活化用MGY培养基(g/L)硫酸铵10g，YNB3.4g，甘油10g，生物素4×10-4g；发酵罐发酵培养基
基础培养基(NH4)2SO420g/L，glycerol 40g/L，KH2PO4 12g/L，CaSO4·2H2O 1g/L，Histidine 0.4g/L。
微量元素PTM1CuSO4.5H2O 6.0g/L，NaI 0.08g/L，MgSO4·H2O 3.0g/L，ZnC12 20.0g/L，HBO4 0.02g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，CoCl2 0.5g/L，Biotin0.2g/L，NaMnO4·2H2O 0.2g/L，H2SO4 4ml/L。
诱导碳源50％甲醇+25％甘油(每升含12ml PTM1)3.种子菌的活化取在-70℃、20％甘油中保藏的工程菌株划板(YPD板)，30℃培养约2天，从YPD平板上挑取单菌落接种于20ml YPD培养基，30℃振荡培养20小时；以1∶10的比例将菌液接种于400ml MGY培养基，30℃振荡培养过夜至OD600达5.0左右，作为接种发酵罐的种子菌。
4.高密度发酵培养7L发酵罐中加入4L发酵用培养基，121℃灭菌20分钟，调节温度至30℃，用氨水调节pH至5.0，加入PTM113ml(4.35ml/L)和1ml消泡剂，接入种子菌(1∶10)。发酵过程中温度控制在30℃，通气量维持在2vvm以上，转速控制在300-800rpm之间，维持溶氧在20％以上。
发酵分为三个阶段生长期，从加入种子菌，培养约16-24小时，直到将培养基中的甘油耗尽，表现为溶氧长时间在低水平浓度，突然上升到80％或以上。之后进入甘油促生长期，通过提高发酵罐内菌密度来增加目的蛋白的表达量补加50％甘油(含有PTM1，12ml/L)，补料速度为18ml/L·h，持续4-6小时。最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加甲醇和甘油混合诱导碳源进行诱导，诱导碳源的流加速度从1ml/L·h经10小时线性上升至6ml/L·h，持续96小时，期间如果溶氧低于20％就通过增加通气量和转速来提高罐内培养基的溶氧浓度或者暂停补料来维持溶氧在20％以上的水平。
由于毕赤酵母生长会产酸性代谢物，在发酵过程中，用发酵罐系统泵自动补入37％氨水，调节罐内pH值，及时补充消泡剂。并每隔24小时取样测定OD600及菌体湿重，同时将发酵上清进行SDS-PAGE检测蛋白的表达状况。
5.发酵液收集4℃，8000rpm离心15min弃菌体，收集上清。
实施例3重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂制备与纯化用甲醇诱导人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂分泌表达96小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟收集上清液，取上清液上Sepherdex G-25分子筛(用56mMTris-HCl pH9.0缓冲液预先平衡)，收集穿过紫外蛋白峰，取样15％SDS-PAGE电泳检测结果。经过脱盐和换缓冲液的蛋白溶液上样至Q Sepharose XL层析柱(用56mM Tris-HCl pH9.0缓冲液预先平衡)，用平衡缓冲液洗脱紫外至基线后，收集穿过紫外蛋白峰，取样15％SDS-PAGE电泳检测结果。然后用缓冲液56mMTris.HCl，40mM KCl，pH9.0一步洗脱，收集蛋白洗脱峰，取样15％SDS-PAGE电泳检测结果。把Q Sepharose XL洗脱峰上样至Sepherdex G-50分子筛(用50mMNH4HCO3缓冲液预先平衡)收集目的蛋白组分，冷冻干燥并取样15％SDS-PAGE电泳检测结果，获得的冻干粉可在-20℃冷冻干燥保存实施例4重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的性质分析主要参照Norihisa Kikuchi等(1987)测定胰分泌型蛋白酶抑制剂活性的方法。该方法主要以BAPNA作为胰蛋白酶(Trypsin)的底物，随着酶促反应的发生，底物BAPNA会释放出显色基团，其显色基团在405nm处的光吸收会发生变化，通过测定光吸收值，可以测定胰蛋白酶(Trypsin)的活性。根据该方法测得1mg的重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂可以抑制3.4-3.8mg的牛胰蛋白酶(Trypsinfrom bovine pancreas，6630U/mg，Sigma)，与理论上的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的抑制效价相一致。
参考文献Norihisa Kikuchi.et al.Production of Recombinant Human Pancreatic Secretory TrypsinInhibitor by Escherchia coli.Journal of Biochemistry.1987，102607-612；
权利要求
1.人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，包括以下步骤(1)按毕赤酵母密码子偏好性化学合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因，其核苷酸序列为5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAACGGTTGTACCAAAATTTATGATCCAGTTTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAGACCTCTATTCTGATTCAGAAATCTGGTCCATGT-3’；(2)设计引物，以所合成的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因为模板，进行PCR扩增；(3)将所获得的编码人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因克隆在质粒中，进行DNA序列测序分析与所设计的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因序列完全相符；(4)经序列分析后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因克隆到商业化表达载体pPIC9K，转化甲醇酵母菌株KM71；(5)对甲醇酵母菌株KM71进行甲醇诱导表达。
2.按权利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，其特征在于步骤(1)毕赤酵母密码子偏好性化学合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的化学合成是通过以下合成的4段引物进行PCR扩增获得(a)5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAA-3’；(b)5’-TGTTACCATCGGTACCACAAACTGGATCATAAATTTTGGTACAACCGTTCAGTTCGTTATAACATTT-3’；(c)5’-TTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAG-3’；(d)5’-ACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAATAGAGGTCTGACGTTTACGGTTTTCAA-3’。
3.按权利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，其特征在于步骤(2)以内含有Xho I酶切位、pPICZαA载体上部分序列的上游引物5’-AAACTAGAGAAAGAGAGGCTGAAGCTGATTCTCTGGGTCGTGAAGC-3’以及内含Not I酶切位点和强终止子的下游引物5’TTTGCGGCCGCTTAACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAA-3’进行PCR扩增。
4.按权利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，其特征在于在步骤(3)中，把步骤(2)获得的PCR扩增产物先以Xho I/Not I的组合克隆到pPICZαA质粒上构建成pPICZαA-rHuPSTI克隆载体更换酶切窗口，然后以Sac I/Not I的组合克隆到表达载体克隆到载体pPIC9K上，得到重组表达载体pPIC9K-rHuPSTI。
5.按权利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，其特征在于步骤(5)采用发酵罐发酵培养基如下基础培养基(NH4)2SO420g/L，glycerol 40g/L，KH2PO4 12g/L，CaSO4·2H2O 1g/L，Histidine 0.4g/L；微量元素PTM1CuSO4·5H2O 6.0g/L，NaI 0.08g/L，MgSO4·H2O 3.0g/L，ZnCl2 20.0g/L，HBO4 0.02g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，CoCl2 0.5g/L，Biotin0.2g/L，NaMnO4·2H2O 0.2g/L，H2SO4 4ml/L；诱导碳源50％甲醇+25％甘油(每升含12ml PTM1)。
6.按权利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，其特征在于步骤(5)的培养基的溶氧在20％以上。
7.按权利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法，其特征在于进一步包括步骤(6)以对步骤(5)甲醇酵母菌株KM71进行甲醇诱导表达后的上清中的表达产物经过层析柱等分离纯化。
全文摘要
本发明公开了人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的基因工程生产方法。本发明采用真核分泌表达的方法来制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，包括(1)具有工程菌密码子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂基因的合成以及表达载体的构建；(2)工程菌的构建及发酵；(3)重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂的制备与纯化。本发明采用基因工程技术制备重组人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制剂，克服了从人体组织中提取，成本高且来源少等缺点。
文档编号A61P1/00GK1806847SQ200510036959
公开日2006年7月26日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者徐安龙, 任宇锋, 赖春娥, 区景行, 王磊 申请人:中山大学