专利名称：一种注射型组织工程骨修复材料及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，具体是涉及一种注射型组织工程骨及其构建方法。
背景技术：
目前，组织工程骨大多构建为支架材料负载细胞生长因子再复合种子细胞的模式。支架材料和生长因子的选择是组织工程学研究的重点内容。支架材料作为种子细胞载体，有负载细胞和缓释生长因子的作用，目前常用的支架材料多为固体类材料，其在组织工程骨的构建中已取得了令人瞩目的效果。但是，也不同程度地存在难以塑形、负载生长因子和种子细胞操作复杂、负载率不高、细胞易流失等缺陷。因此，注射型或水凝胶类材料是目前骨组织工程研究的热点。生长因子在组织工程骨构建与应用中的作用是明显确切的。以往多采用单一的生长因子进行研究，但单一的生长因子无法发挥多因子的协同作用，其效果也是较为有限的。采用多因子联合应用较单一的生长因子的成骨效果更佳，但不同生长因子之间如何匹配，不同生长因子之间的最佳比例都有待研究，而且纯化的生长因子在不同程度上都存在制备复杂、成本高、具有一定免疫原性等缺点。因此虽然生长因子在骨科基础研究领域虽已取得大量研究成果，但在临床上仍无法得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种注射型组织工程骨修复材料，该骨修复材料为可注射性材料负载自体PRP再复合自体骨髓基质细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，且使用自体细胞生长因子，不存在免疫排斥问题，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。
本发明所述的一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，以可注射性材料壳聚糖-β-磷酸三钙复合物作为载体支架，复合富血小板血浆PRP以及种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。
所述的可注射材料壳聚糖-β-磷酸三钙优选为将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β-磷酸三钙复合物。
所述的壳聚糖优选是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
所述的骨髓基质干细胞优选为经传代增殖培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞。
所述的PRP是取自自体静脉血，以二次离心法提取而得的富血小板血浆。
本发明的另一目的在于提供一种注射型组织工程骨修复材料的构建方法。
本发明所述的注射型组织工程骨修复材料的构建方法，包括以下步骤A.材料准备(1)种子细胞抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代107数量级；(2)自体RPR取自体静脉血，以二次离心法提取富血小板血浆即PRP，置-70℃保存备用；(3)氯化钙-凝血酶混合溶液配制1ml 10％氯化钙内含1000U凝血酶；B.壳聚糖-β-磷酸三钙可注射材料的制备将壳聚糖与β-TCP按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成壳聚糖-β-磷酸三钙复合物；C.种子细胞与PRP的复合将培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞加入PRP，混合均匀；D.注射型组织工程骨修复材料的制备壳聚糖-β-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤C的种子细胞与PRP的复合物，以及氯化钙-凝血酶混合溶液，加入量比例为壳聚糖、β-TCP、PRP、氯化钙-凝血酶按3ml∶1.8g∶0.3ml∶0.1ml，充分混匀，即获得所述的注射型组织工程骨修复材料。
所述的注射型组织工程骨修复材料的构建方法中，优选的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
本发明所采用的PRP是自体全血提取物，内含多种生长因子，这些生长因子浓度配比与体内正常比例相似，并且PRP制备简便，价格低廉，自体PRP无毒、无免疫原性，是较为理想的符合临床应用需要的生长因子来源。
传统的生物材料与生长因子复合，多是采用材料与生长因子直接浸泡的方法，采用这种方法构建的材料上虽然含有生长因子，但生长因子与材料附着不牢固，易流失。将药物控释技术引入组织工程后，即在骨支架材料内采用缓释载体负载生长因子，这种方法虽可以达到生长因子缓慢释放，增强生长因子的有效作用，但这种负载生长因子的组织工程骨体系构建较为复杂。在固态材料与PRP复合上也存在如此问题，通常的制备方法是先将PRP与凝血酶复合制成凝胶后再与固态支架复合，这种方法PRP与材料间复合不是很牢固，复合的PRP在体内也难以避免因血液的冲刷而流失。本发明所采用的壳聚糖与β-TCP混和后最初为液态，并逐渐凝固为固态。在材料为液态时加入PRP，将PRP与材料混合均匀，复合PRP的材料立即与含有氯化钙的凝血酶混合，材料内的氯化钙、凝血酶与PRP混合后可以促进血小凝集，使血小板释放PDGF、IGF等多种生长因子。可注射的壳聚糖与β-TCP复合PRP的优点在于在材料为液态时复合PRP简便易行，PRP在材料内复合均匀，且材料凝固后材料与PRP混为一体，材料内的PRP不易流失，确保了材料植入体内后PRP能在骨缺损处局部释放较高浓高的生长因子。
本发明所采用的PPR是经二次离心法制备出来的，其血小板浓度较全血提高了4倍多，实验结果发现，复合PRP的材料在第4天时已明显促进BMSCs的增殖。实验结果表明PRP这种复合方式可以促使PRP内生长因子的释放，并起到促进BMSCs的增殖作用，这说明PRP作为可注射性材料壳聚糖-β-TCP中的生长因子是可行的。采用这种方式复合的PRP在体内具有促进骨再生的效果，以这种复合材料构建的可注射组织工程骨具有广阔的临床应用前景。
图1为空白对照组BMSCs复合培养第6天倒置显微镜观察(×100)照片。
图2为壳聚糖-β-TCP与BMSCs复合培养第6天倒置显微镜观察(×100)照片。
图3为壳聚糖-β-TCP/PRP与BMSCs复合培养第6天倒置显微镜观察(×100)照片。
具体实施例方式
本发明所述的一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，以可注射性材料壳聚糖-β-磷酸三钙复合物作为载体支架，复合富血小板血浆PRP以及种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。
所述的可注射材料壳聚糖-β-磷酸三钙优选为将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β-磷酸三钙复合物。
所述的壳聚糖优选是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
所述的骨髓基质干细胞优选为经传代增殖培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞。
所述的PRP是取自自体静脉血，以二次离心法提取而得的富血小板血浆。
实施例一种子细胞的培养取5月龄健康中国青山羊(体重35.0～40kg，雌雄不限，由南方医科大学动物实验中心提供)，麻醉后无菌操作下用16号骨穿针行髂骨穿刺，多点穿刺抽取骨髓10mL，离心并用100目钢网过滤后接种入培养瓶内，完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)，置于CO2孵箱(美国Harris公司)内进行培养，每3天换液，待原代细胞长满瓶底，用0.25％胰酶-0.02％DMEM液将贴壁细胞消化分离，加完全培养基，置CO2孵箱继续培养，每2-3天换液。
实施例二富血小板血浆(PRP)的制备用装有1ml 10％枸橼酸钠抗凝剂的注射器抽取羊静脉血10ml，摇匀，置入离心管中，采用二次离心法制备PRP(黄爱文，金丹，裴国献，陈书军，胡稷杰，林海宁，曾宪利，复合富血小板血浆(PRP)的可注射型组织工程骨的构建及其修复兔桡骨缺损的放射学评估，中华创伤骨科杂志，2005，7(4)363-367.)。每10ml全血约制成1ml PRP，-70℃冰箱保存备用。
实施例三注射型组织工程骨修复材料的制备取第3代BMSCs(种植密度2×104/孔)接种于24孔培养板，每孔加入培养基0.6ml。
可注射型壳聚糖、β-磷酸三钙(β-TCP)材料由暨南大学材料科学与工程系提供。将3ml壳聚糖、1.8gβ-TCP于体外复合8min后，依次将0.3mlPRP，0.1ml凝血酶(10％氯化钙内含100U凝血酶)加入液态的壳聚糖-β-TCP中，充分混匀，制备成壳聚糖-β-TCP/PRP复合物。
注射型组织工程骨修复材料的制备实验分为3组，即壳聚糖-β-TCP/PRP组、单纯壳聚糖-β-TCP组和空白对照组。其中壳聚糖-β-TCP/PRP组、单纯壳聚糖-β-TCP组每孔加5mm×5mm×3mm的固化成形的壳聚糖-β-TCP/PRP或单纯壳聚糖-β-TCP与细胞混合培养，对照组单纯接种细胞，每个时间点每组各5孔，于不同时间进行倒置显微镜观察(Nikon公司)及MTT(Sigma公司)检测。
实施例四倒置显微镜观察逐日使用倒置显微镜观察各组细胞生长情况。
细胞接种后(1)空白对照组4小时后细胞有部分贴壁，12小时后完全贴壁，细胞呈多角形、梭形，散在分布；空白对照组BMSCs复合培养第6天的结果如图1所示。
(2)壳聚糖-β-TCP/PRP组材料周边细胞生长较快，6～7天时汇合成单层；壳聚糖-β-TCP与BMSCs复合培养第6天的结果如图2所示。
(3)材料组(单纯壳聚糖-β-TCP组)细胞生长与对照组相似，8～10天细胞汇合成单层，所有组细胞形态正常；壳聚糖-β-TCP/PRP与BMSCs复合培养第6天的结果如图3所示。
实施例五MTT法测定细胞增殖按上述方法接种细胞后，于第2、4、6、8天弃原培养基，加入无血清DMEM 1ml和MTT(5mg/ml)100μl，37℃CO2孵箱内孵育4小时后，小心吸去MTT，加入二甲基亚砜0.5ml，振荡15min，酶标仪上选择波长570nm，测定光吸收值。
随培养时间的延长，各组D570逐渐增加，到第8天最高，壳聚糖-β-TCP组在各时间点与空白对照组均无显著性差异(P＞0.05)。壳聚糖-β-TCP/PRP组在第4天时与壳聚糖-β-TCP组和空白对照组已有显著性差异(P＜0.05)(表1)。
表1各组MTT法测定吸光度值(n＝5 x±s)Tab 1 absorbance determined by MTT assay in three groups(n＝5，x±s)
*P＜0.05、**P＞0.05 vs空白对照组，#P＜0.05、##P＞0.05 vs壳聚糖-β-TCP组统计方法所测数据在SPSS10.0上进行方差统计分析，P值小于0.05时为有统计学差异。
权利要求
1.一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，其特征在于以可注射性材料壳聚糖-β-磷酸三钙复合物作为载体支架，复合富血小板血浆PRP以及种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。
2.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于所述的可注射材料壳聚糖-β-磷酸三钙为将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β-磷酸三钙复合物。
3.根据权利要求2所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于所述的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于所述的骨髓基质干细胞为经传代增殖培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞。
5.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于所述的PRP是取自自体静脉血，以二次离心法提取而得的富血小板血浆。
6.如权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料的构建方法，其特征在于，包括以下步骤A.材料准备(1)种子细胞抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代107数量级；(2)自体RPR取自体静脉血，以二次离心法提取富血小板血浆即PRP，置-70℃保存备用；(3)氯化钙-凝血酶混合溶液配制1ml 10％氯化钙内含1000U凝血酶；B.壳聚糖-β-磷酸三钙可注射材料的制备将壳聚糖与β-TCP按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成壳聚糖-β-磷酸三钙复合物；C.种子细胞与PRP的复合将培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞加入PRP，混合均匀；D.注射型组织工程骨修复材料的制备壳聚糖-β-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤C的种子细胞与PRP的复合物，以及氯化钙-凝血酶混合溶液，加入量比例为壳聚糖、β-TCP、PRP、氯化钙-凝血酶按3ml∶1.8g∶0.3ml∶0.1ml，充分混匀，即获得所述的注射型组织工程骨修复材料。
7.根据权利要求6所述的注射型组织工程骨修复材料的构建方法，其特征在于所述的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
全文摘要
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法制备人工器官技术领域，具体是涉及一种注射型组织工程骨修复材料及其构建方法。本发明所述的一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，以可注射性材料壳聚糖－β－磷酸三钙复合物作为载体支架，复合富血小板血浆PRP以及种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。本发明还提供一种注射型组织工程骨修复材料的构建方法。本发明所述的一种注射型组织工程骨修复材料可任意塑形且复合细胞简便，且使用自体细胞生长因子，不存在免疫排斥问题，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。
文档编号A61L31/00GK1923300SQ20051003696
公开日2007年3月7日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者裴国献, 金丹, 程文俊 申请人:南方医院