专利名称：注射型组织工程骨修复材料及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法制备人工器官技术领域，具体是涉及一种注射型组织工程骨修复材料及其构建方法。
背景技术：
可注射型组织工程骨是利用初始状态为液态的可降解生物材料，与种子细胞有机复合，制备成液态可注射的组织工程骨，并且在完全填充骨缺损的过程中，逐步固化，形成凝胶或固态的组织工程骨修复骨缺损。可注射骨易于塑形，与种子细胞、生长因子复合便捷，且具有组织损伤小、不破坏修复区血供、操作简便易行等优点，适应了微创外科技术发展的要求，因此正逐步引起国内外诸多学者的高度关注。目前，用于可注射骨的材料多为凝胶类，主要包括纤维蛋白凝胶，聚氧化乙烯水凝胶，藻酸盐凝胶等，这些生物材料注入体内后为凝胶状，并不具备生物力学强度，虽然复合种子细胞植入体内后都有一定的成骨效果，但距理想的可注射骨支架材料还有相当的距离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种注射型组织工程骨修复材料，该骨修复材料为可注射性材料复合骨髓基质干细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。
本发明所述的一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，以可注射性材料壳聚糖-β-磷酸三钙复合物作为载体支架，复合种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。
所述的可注射材料壳聚糖-β-磷酸三钙优选为将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β-磷酸三钙复合物。
所述的壳聚糖优选是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
所述的骨髓基质干细胞优选为经传代增殖培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞。
本发明的另一目的在于提供一种注射型组织工程骨修复材料的构建方法。
本发明所述的注射型组织工程骨修复材料的构建方法，包括以下步骤A.种子细胞抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代107数量级；B.可注射性支架材料的制备将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成壳聚糖-β-磷酸三钙复合物；C.种子细胞的处理将培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞用0.3ml的DMEM混匀；D.种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合壳聚糖-β-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤C的种子细胞，加入量比例为壳聚糖、β-磷酸三钙、DMEM按3ml∶1.8g∶0.3ml，充分混匀，即获得所述的注射型组织工程骨修复材料。
所述的注射型组织工程骨修复材料的制备方法中，优选的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
本发明所采用的壳聚糖(chitosan)是甲壳素部分脱乙酰基后的衍生物，为天然高分子聚合物，具有良好的生物降解性，降解产物无毒副作用。本发明所采用的β-磷酸三钙(β-TCP)属于钙磷陶瓷类，具有和自然骨相似的化学成份、良好的生物相容性和生物降解性。本发明将两者复合而成为较理想的组织工程骨可注射性支架材料。
以往对壳聚糖交联所采用的交联剂为戊二醛(Yin Y.Ye F，Cui J，Zhang F，Li X，Yao K.Preparation and characterization of macroporous chitosan-gelatin/beta-tricalcium phosphatecomposite scaffolds for bone tissue engineering.J Biomed Mater Res A，2003，67(3)844-855.)，但戊二醛被证实有细胞毒性，故本发明中采用柠檬酸作为壳聚糖的交联剂。柠檬酸是人骨有机质的重要组成部分，占到全身的70％，其对糖、脂肪、蛋白质的氧化代谢过程有重要作用。由于柠檬酸中含有羧基，可以与壳聚糖中的羟基发生酯化反应，未反应的羧基将与壳聚糖中的氨基作用形成盐键。通过此键，使壳聚糖交联形成有机网络结构。
本发明选用壳聚糖为有机相，β-TCP为无机相，β--TP与壳聚糖复合后，分散在有机网络结构中，复合物最初为液态，逐惭固化，形成固态、多孔网状结构，且具有一定的生物力学强度，从而制备了一种新型有机/无机复合的可注射材料。
可注射骨构建的一个关键的因素是细胞与注射材料混合后，细胞能否在注射骨三维支架内生长与增殖，细胞与材料是否具有良好的生物相容性。本发明采用3ml壳聚糖与1.8gβ-TCP复合是优化的合适配比(壳聚糖∶β-TCP＝1ml∶0.6g)，3ml壳聚糖与1.8gβ-TCP复合均匀后，最初为液态，12～15min后逐惭凝固为固态，并具有一定的生物力学强度。在此基础上，本发明验证了在复合材料为液态时复合BMSCs作为可注射骨的可行性以及材料和细胞的生物相容性。实验中发现加入培养基量过多(＞0.6ml)将明显延长材料的固化时间，故发明人选择0.3ml培养基与离心后的BMSCs制成细胞悬液后与液态时的材料复合。实验中，发明人在倒置显微镜下的观察发现，壳聚糖-β-磷酸三钙支架材料与BMSCs复合培养后，细胞生长、增殖旺盛，形态正常。MTT法检测发现壳聚糖-β-磷酸三钙支架材料与BMSCs复合培养后，与对照组相比，细胞增殖能力不受影响(P＞0.05)。将BMSCs混合在液态的材料内，在材料成形后，电镜观察显示材料表面的BMSCs与材料贴附良好，并且分裂、增殖，分泌骨基质。
本发明通过实验结果证实了壳聚糖-β-磷酸三钙复合支架材料与BMSCs的相容性好，是一种可行的可注射型组织工程骨支架材料。以这种复合材料构建的可注射组织工程骨具有广阔的临床应用前景。
图1为空白对照组BMSCs复合培养第6天倒置显微镜观察(×100)照片。
图2为壳聚糖-β-TCP与BMSCs复合培养第6天倒置显微镜观察(×100)照片。
图3为壳聚糖-β-TCP固化后结构扫描电镜观察(×5000)照片。
图4为壳聚糖-β-TCP与BMSCs复合培养第3天扫描电镜观察(×600)照片。
图5为壳聚糖-β-TCP与BMSCs复合培养第6天扫描电镜观察(×600)照片。
图6为壳聚糖-β-TCP与BMSCs复合培养第6天扫描电镜观察(×2000)照片。
具体实施例方式
本发明所述的一种注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，以可注射性材料壳聚糖-β-磷酸三钙复合物作为载体支架，复合种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。
所述的可注射材料壳聚糖-β-磷酸三钙优选为将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β-磷酸三钙复合物。
所述的壳聚糖优选是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
所述的骨髓基质干细胞优选为经传代增殖培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞。
实施例一种子细胞的培养取5月龄健康中国青山羊(体重35.0～40kg，雌雄不限，由南方医科大学动物实验中心提供)，麻醉后无菌操作下用16号骨穿针行髂骨穿刺，多点穿刺抽取骨髓10mL，离心并用100目钢网过滤后接种入培养瓶内，加含10％胎牛血清(美国Hyclone公司)的高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)，置于CO2孵箱(美国Harris公司)内进行培养，每3天换液，待原代细胞长满瓶底，用0.25％胰酶-0.02％DMEM液将贴壁细胞消化分离，加条件培养基(DMEM+10％胎牛血清+地塞米松10-8mol/L+β-甘油磷酸钠10mmol/L+抗坏血酸50mg/L)，置CO2孵箱继续培养，每2～3天换液。
实施例二种子细胞细胞与可注射材料的复合实验中所采用的壳聚糖为液态材料，β-磷酸三钙(β-TCP)为固态材料(暨南大学材料科学与工程系提供)，将两种材料混合均匀后，最初为液态，12～15min后逐渐凝固为固态。本实验采用3ml壳聚糖、1.8g的β-TCP于体外复合，待固化成形后，以无菌手术刀片切割成4mm×4mm×3mm大小备用。取第3代BMSCs(种植密度2×104/孔)接种于24孔培养板，每孔加入培养基1ml，实验分为2组，即材料组和空白对照组。其中实验组每孔加4mm×4mm×3mm小块的壳聚糖-β-TCP复合材料与细胞混合培养，对照组单纯接种细胞，于不同时间进行处理，用于MTT检测。将3ml壳聚糖、1.8gβ-TCP于体外复合8min后，取第3代BMSCs(约1×107)加入0.3ml DMEM制成细胞悬液，将细胞悬液与液态的壳聚糖-β-TCP混匀，制备成BMSCs/壳聚糖-β-TCP复合物。待材料凝固成形后，取小块材料置于6孔板，加完全培养基，置于CO2孵箱内进行培养，用于扫描电镜观察。
实施例三倒置显微镜观察逐日使用倒置显微镜观察各组细胞生长情况。
结果细胞接种4小时后，细胞有部分贴壁，12小时后完全贴壁，细胞呈多角形、梭形。细胞生长较快，2～3天细胞克隆形成，8～10天后汇成单层，材料组细胞生长与对照组相似(如图1和图2所示)，细胞形态正常。
实施例四扫描电镜观察于第3、6天将复合细胞的生物材料取出，PBS漂洗，2％戊二醛固定，系列脱水，叔丁醇置换，真空干燥，表面喷金后进行扫描电镜观察。
可注射组织工程材料壳聚糖-β-TCP体外复合成形后，扫描电镜下呈三维立体多孔结构，含大量孔隙，微孔排列不规则，孔径大小不均，部分孔隙相互交通(如图3所示)。细胞与材料混合培养3天时，混合在材料表面的细胞可在材料表面生长，多为不规则的类圆形(如图4所示)；培养7天时，细胞数量明显增加，胞体扁平，为梭形或多角形，胞体表面有颗粒状物，细胞连接成片，有大量基质形成，细胞可跨过孔隙表面或向空隙内生长(如图5与图6所示)。
实施例五MTT法分析BMSCs与壳聚糖-β-TCP复合材料复合培养后的成活和增殖能力按上述方法接种细胞后，于第2、4、6、8天弃原培养基，加入无血清DMEM 1ml和MTT(5mg/ml)100μl，37℃CO2孵箱内孵育4小时，小心吸去MTT后，加入二甲基亚砜0.5ml，振荡15分钟，酶标仪上选择波长570nm，测定光吸收值。
随培养时间的延长，各组D570逐渐增加，到第8天最高，壳聚糖-β-TCP组在各时间点与对照组均无显著性差异(＞0.05)(表1)。
表1两组MTT法测定吸光度值(n＝5 x±s)Tab1 absorbance determined by MTT assay in two groups(n＝5，x±s)
*p＞0.05vs对照组统计方法所测数据采用SPSS10.0统计软件进行独立样本的t检验，P值小于0.05时为有统计学差异。
权利要求
1.注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，其特征在于以可注射性材料壳聚糖-β-磷酸三钙复合物作为载体支架，复合种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。
2.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于所述的可注射材料壳聚糖-β-磷酸三钙为将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成的壳聚糖-β-磷酸三钙复合物。
3.根据权利要求2所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于所述的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料，其特征在于所述的骨髓基质干细胞为经传代增殖培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞。
5.如权利要求1所述的注射型组织工程骨修复材料的构建方法，其特征在于，包括以下步骤A.种子细胞抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代107数量级；B.可注射性支架材料的制备将壳聚糖与β-磷酸三钙按1ml∶0.6g的比例于体外复合形成壳聚糖-β-磷酸三钙复合物；C.种子细胞的处理将培养至第三代107数量级的骨髓基质干细胞用0.3ml的DMEM混匀；D.种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合壳聚糖-β-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤C的种子细胞，加入量比例为壳聚糖、β-磷酸三钙、DMEM按3ml∶1.8g∶0.3ml，充分混匀，即获得所述的注射型组织工程骨修复材料。
6.根据权利要求5所述的注射型组织工程骨修复材料的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖是用柠檬酸作为交联剂处理后形成有机网络结构的壳聚糖。
全文摘要
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法制备人工器官技术领域，具体是涉及一种注射型组织工程骨修复材料及其制备与应用。本发明所述的注射型组织工程骨修复材料，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生理活性的复合体，以可注射性材料壳聚糖－β－磷酸三钙复合物作为载体支架，复合种子细胞；所述的种子细胞为骨髓基质干细胞。本发明还提供一种注射型组织工程骨修复材料的制备方法。本发明通过实验结果证实了壳聚糖－β－磷酸三钙复合支架材料与BMSCs的相容性好，是一种可行的可注射型组织工程骨支架材料。以这种复合材料构建的可注射组织工程骨具有广阔的临床应用前景。
文档编号A61L27/00GK1923298SQ200510036968
公开日2007年3月7日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者裴国献, 金丹, 程文俊 申请人:南方医院