专利名称：抗急性髓性白血病的gm－csf靶向药物脂质体及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗急性髓性白血病的药物，具体的说是在包封有抗急性髓性白血病的药物的脂质体表面联接具有主动靶向性的导向物GM-CSF而形成的靶向药物脂质体及其制备方法。
背景技术：
急性白血病是造血系统的恶性肿瘤，发病率约3/10万居住人群，占青少年恶性肿瘤第一位。致病原因目前还不是十分清楚，可能与病毒、物理及化学致癌因素有关。急性白血病往往导致正常造血功能障碍和白血病细胞浸润症状，临床常有严重感染、出血、贫血等表现，不经治疗中位生存期不足三个月，对生命财产构成很大威胁。急性白血病分为急性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病两种主要类型，其中在我国急性髓性白血病占2/3以上。
急性髓性白血病通常采用化学治疗，标准的DA化疗方案能够使60％-80％的初发患者获得缓解，但单纯用化疗治愈率不足15％。近年来急性髓性白血病(AML)的治疗有了很大进展，骨髓干细胞移植等方法可以使近50％~60％的患者获得治愈，但仍然有相当部分患者疗效较差或复发而成为难治病例。另一方面，某些患者的身体状况如年龄较大或有脏器功能损伤不能承受较强烈的化疗或骨髓移植治疗，因此，对于一般情况不佳耐受性差的患者，开发增强药物的特异靶向性、增加疗效、减少不良反应的治疗方法显得十分重要。国外多采用单克隆抗体作为靶向制导剂，单用或携带同位素、毒素、化疗药物制备成靶向治疗剂。但单克隆抗体十分昂贵，如果用鼠抗还易导致抗体产生而不能重复使用。
脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新型制剂。它具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体自身的免疫功能，并改变被包封药物的体内分布、使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。因此，脂质体在许多疾病尤其是癌症的治疗中显示了明显的优越性。脂质体作为抗癌药物的载体具有能增加药物与癌细胞的亲和力，克服耐药性，增加药物被癌细胞的摄取量、降低用药剂量、提高疗效、降低毒副作用的特点。大量的研究结果表明抗癌药物脂质体可以提高药物疗效、降低毒性作用(参见文献BayesM.Gateways to clinical trials[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol，2003，25(1)53-76；和Gokhale PC.Improved safety pharmacokinetics and therapeuticefficacy profiles of a novel liposomal formalation of mitoxantrone[J].Anticancer Res，2001，21(5)3313-3321；和Adlakha-Hutchem G.Controlled destabilization of aliposomal drug delivery system enhances mitoxantrone antitumor activity[J].NatBiotechnol，1999，17(8)775-779)。但是脂质体本身的靶向性是一种非特异性作用，要使脂质体特异性地分布到特定的组织器官需要在脂质体表面联接上导向物质制成靶向脂质体。
靶向脂质体对靶细胞具有特异亲和力、疗效显著、不良反应小，同时包封多种化疗药物制成联合化疗靶向脂质体，可方便高效地实现联合化疗。靶向脂质体的优点是载药量大，体内滞留时间长，有专一靶向性，是当前较受重视的一种释药系统(参见文献Bendas G.Immunoliposomesa promising approach totargeting cancer therapy[J].BioDrugs，2001，15(4)215-224，和Hou XP.Study onthird-type immunoliposomes loaded drugs and the targeting in vitro and in vivo[J].Yao Xue Xue Bao，2001，36(7)539-542，和Maruyama.K.In vivo targeting byliposomes[J].Biol Pharm Bull，2000，23(7)791-799)。
发明内容
本发明的目的，是提供一种抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向药物脂质体。它利用对急性髓性白血病细胞(表达GM-CSF受体)具有特异靶向性的GM-CSF作为导向物质，联接已包封抗急性髓性白血病的药物的脂质体，制备成靶向脂质体。抗急性髓性白血病的药物可以采用抗肿瘤抗生素或烷化剂类抗肿瘤药或影响核酸生物合成的抗肿瘤药或影响蛋白质合成的抗肿瘤药或拓扑异构酶抑制剂或生物毒素，以组成不同的与GM-CSF组成的药物脂质体。抗急性髓性白血病的药物优选米托蒽醌、柔红霉素、阿霉素、阿克拉霉素、刺孢酶素、吡南阿霉素、阿糖胞苷、氟达拉宾、吉西他宾、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、长春新碱、长春花碱、拓扑替康、足叶一甙、VM26、环磷酰氨、异环磷酰氨、顺铂、卡铂、卡氮芥、马法兰、马利兰、羟基脲、紫山醇。
本发明采用粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为导向药物与药物脂质体联接形成新的具有靶向治疗特征的治疗制剂，用于治疗急性髓性白血病，一方面使治疗成本较单克隆抗体显著降低，另一方面由于脂质体可以携带一种或多种较大剂量的治疗因子，从而显著提高疗效并有利于克服耐药。
本发明采用体外模型MTT实验检测其对急性髓性白血病细胞株HL60的细胞毒作用和对细胞凋亡的影响，为用靶向脂质体包封药物治疗恶性肿瘤，提供了研究基础。
本发明的另一个目的，是提供制备DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的方法。
它包括以下步骤1).制备DHAQ脂质体；2).测定DHAQ脂质体包封率；3).制备DHAQ靶向脂质体；4).DHAQ-GM-CSF靶向脂质体的纯化。
本发明的实施例采用治疗急性白血病有良好疗效的米托蒽醌(DHAQ)作为被包封药物，导向物质采用粒-巨嗜细胞集落刺激因子GM-CSF。在脂质体表面联接导向物质制成靶向药物脂质体DHAQ-GM-CSF，通过导向物质的特异性专一地与靶细胞表面的受体分子相互作用，而使脂质体在靶区释放药物。
本发明的再一个目的，是提供DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体对急性髓性白血病具有特异杀伤性的试验结果。
本发明的优点是用DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体治疗AML具有相对选择作用，药物的特异靶向性好，疗效高，毒副作用小，提高患者对化疗的耐受性，使DHAQ发挥更佳的抗白血病作用。由于重组人GM-CSF易得到，不会刺激体内产生抗体而影响疗效，可以多次重复使用，因此成本低，安全性高。
本发明采用急性髓性白血病细胞株HL60，其细胞膜上可以大量表达GM-CSF受体，结合位点为322个/细胞。
本发明采用戊二醛交联法，以戊二醛作偶联剂，使其两端的醛基分别与磷脂的NH2和蛋白质的NH2缩合，将已制好的脂质体和导向物质相联。此方法方便高效，其反应条件温和，免疫物质活性高。
本发明采用DHAQ脂质体表面联接导向物质制成的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体，其脂质体粒径为160-220，此粒径的脂质体细胞毒作用强。其原因是在导向物质和被包封药物相同的条件下，靶向脂质体对细胞的杀伤作用主要受脂质体的粒径和被包封的药物量决定，前者主要是影响脂质体颗粒与细胞碰撞结合的机率，小颗粒脂质体具有较高的运动速度和碰撞机率游离于受体-配体结合，后者主要是决定单位导向物质的效应。在脂质体粒径无显著差异的条件下，较大颗粒的脂质体包封的药物更多与小颗粒相比具有更高的单位效应，故能发挥更强的杀伤作用。因此，我们选择超声30min制备粒径为约为200nm脂质体以达到更好的细胞杀伤作用。
当然选择不同的抗急性髓性白血病的药物与GM-CSF组成的药物脂质体，达到相同或近似的细胞毒作用，有不同的粒径。
脂质体作为抗癌药物载体，具有能增加与癌细胞的亲和力、克服耐药性、增加药物被癌细胞的摄取、降低用药剂量、提高疗效、降低毒副作用的特点。
GM-CSF是粒单核细胞系祖细胞增殖分化的正向调节因子，它能刺激髓系造血细胞生长和分化，增强成熟粒细胞和单核巨噬细胞的功能。GM-CSF通过结合细胞表面的同源受体发挥作用。
本发明在进行MTT实验的同时，还进行了GM-CSF的导向性的验证实验。由于DHAQ-GM-CSF靶向脂质体上的GM-CSF能够发挥导向作用，而该导向效应是通过配体-受体结合而起效的，如果预先加入饱和量的GM-CSF占领HL60细胞表面的受体，则后续加入的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的特异性杀伤作用将被阻断，仅余留脂质体的非特异性杀伤作用。
图1-1为电镜下本发明的脂质体；图1-2为电镜下本发明的脂质体；图1-3为电镜下本发明的脂质体；图2-1电镜下调亡的HL60细胞；图2-2电镜下调亡的HL60细胞；图3-1流式细胞术测GM-CSF活性保留率；图3-2流式细胞术测GM-CSF活性保留率；图3-3流式细胞术测GM-CSF活性保留率；图4-1Annexin V/PI双染法测HL60细胞的凋亡率；图4-2Annexin V/PI双染法测HL60细胞的凋亡率；图4-3Annexin V/PI双染法测HL60细胞的凋亡率；图4-4Annexin V/PI双染法测HL60细胞的凋亡率；图5不同浓度的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体、DHAQ脂质体、DHAQ对HL60细胞的杀伤作用趋势图(24h)；图6不同浓度的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体、DHAQ脂质体、DHAQ对HL60细胞的杀伤作用趋势图(48h)。
具体实施例方式
为了进一步说明DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体及制备方法，参照下列实施例说明，这些实施例是为了进一步进行解释，而不以任何方式限制本发明。
1.材料HL60细胞，由上海生物研究所提供。
2.试剂DHAQ原料药购自重庆凯林制药有限公司；GM-CSF原料药由北京北医联合医药有限公司提供，其结合位点平均为322个/HL60细胞[16]；胆固醇、卵磷脂、MTT、DMSO购自Sigma公司；PE-抗人GM-CSF抗体及对照购自美国Biolegend公司；FTIC-Annexin-V购自北京晶美生物技术有限公司；乙醚、无水乙醇、戊二醛购自重庆医药化玻分公司，均为分析纯；胎牛血清购自杭州四季青工程有限公司。
细胞培养HL60细胞用含体积分数为10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃，体积分数为5％的CO2，饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期的细胞进行实验。
实施例1 DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的制备、纯化和鉴定1.DHAQ脂质体的制备采用逆向蒸发法制备DHAQ脂质体(参见文献Szoke F.Procedure forpreparation of liposomes with large internal aqueous space and highcapture by reverse-phase evaporation[J].Proc Natl Acad Sci USA，1978，75(9)4194)。
取10mgDHAQ原料药，溶于20ml蒸馏水中备用，另取卵磷脂(Pc)2g、胆固醇(Cho)0.4g(Pc∶Cho＝1∶0.2，W/W)，加入60ml乙醚，搅拌至完全溶解，将DHAQ溶液缓慢加入Pc和Cho的乙醚溶液中(WPc∶WDHAQ＝200∶1，有机相∶水相＝3∶1)，边加边搅拌，再置于超声振荡仪中振荡约30min，至水相和有机相混合均匀，呈蓝色乳状悬液。乳状液以旋转蒸发仪减压蒸发40min，30℃，中间加入PBS缓冲液15ml。上述操作均在20℃室温下进行。
2.DHAQ脂质体的纯化采用离心法分离脂质体和游离DHAQ水溶液。
将上述步骤1中制得的乳状液以10000rpm的转速离心20min，取脂质体层用于靶向脂质体的制备，水溶液层用于包封率的测定。
3.DHAQ脂质体包封率的测定用下列公式(1)计算包封率Qw％＝[(W总-W游)/W总]×100％(1)式中Qw％为包封率；W总为DHAQ的总投样量；W游为未包封的游离DHAQ含量W游的测定参照中国药典第二部中DHAQ和注射用DHAQ的含量测定项下的规定，采用比色法进行测定(参见中国药典第二部附录IIB[S]，附录27.)，具体操作如下取DHAQ原料药10mg，精密称定，置于100ml量瓶中，加水1ml溶解，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/l的盐酸溶液5ml，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，照比色法，在663nm的波长处测定吸光度，DHAQ的吸收系数为570，代入公式(2)计算A＝ECL (2)式中A为吸光度、E为吸收系数、C为100ml溶液中所含的被测物质的克数，L为液层厚度(单位cm).
连续测定三个样品的C值，计算平均数即为对照品溶液的浓度，换算成对照品的含量。
精密量取实施例2中2步骤得到的水溶液1ml，置于50ml量瓶中，用无水乙醇分次洗涤量器，洗涤并入量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，照上述方法，自“精密量取5ml”起，依法测定，照公式(3)计算含量CX＝(AX/AR)/CR(3)式中CX为待测样品溶液的浓度、AX为待测样品溶液的吸光度、CR为对照品溶液的浓度、AR为对照品溶液的吸光度。
连续测定三瓶，计算平均数，即得1ml水溶液中游离DHAQ的含量，换算成实施例2中2步骤水溶液中游离DHAQ的含量W游。上式中CX为已知，AX为与待测样品同时测得的对照品的吸光度。
4.DHAQ靶向药物脂质体的制备采用戊二醛交联法制备靶向脂质体(参见文献汪冰，杨翰仪.单克隆抗体偶联脂质体的制备及其与胃癌细胞特异结合研[J].沈阳药学院学报，1993，11(1)17)。
取10％的DHAQ脂质体溶液13ml，加入25％的戊二醛13ml，室温20℃，放置10min，过量的戊二醛用生理盐水透析4h除去，换液2次，加入1mgGM-CSF原料药，4℃过夜。得到DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体。
5.DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的纯化采用蔗糖密度梯度离心法分离游离GM-CSF和靶向脂质体(参见文献汪冰，杨翰仪.用密度梯度离心法分离脂质体-IG复合物与游离IG[J].中华物理医学杂志，1993，1(15)39)。
取上述制得的DHAQ-GM-CSF靶向脂质体0.4ml，加入0.8ml蔗糖溶液(30％，W/W)混匀，放入离心管中，加入2.4ml蔗糖溶液(15％，W/W)作为第二层，最上层加0.4ml缓冲液作为封闭层，4℃，30000rpm，离心30min，从上到下吸出，封闭层和脂质体层各0.4ml，脂质体层再按上述方法梯度离心一次。
6.偶联率的测定采用紫外分光光度法测定偶联率(参见文献牛荣丽，薛弘燮，李志良.阿苯达唑靶向脂质体的制备[J].新疆医科大学学报，2001，24(1)60-62)。
分离后的靶向脂质体为脂质体-蛋白质复合物，用紫外分光光度法测定其中蛋白质的含量即为偶联上的GM-CSF量，具体操作如下取纯化后的DHAQ-GM-CSF靶向脂质体加入比色杯中，在280nm波长处测定其A值，连续测定三个样本，计算平均值，再代入公式(4)计算偶联率＝(纯化后DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的A值/纯化前DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的A值)×100％ (4)7.DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体中GM-CSF活性保留率的测定采用流式细胞术测定靶向脂质体中GM-CSF活性的保留率。
取对数生长期的HL60细胞，调成密度为5×108个/l的细胞悬液，接种于6孔板上，每孔加入细胞悬液3ml，实验分为3组DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组、GM-CSF组和空白对照组。
DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组加入浓度为2.5μg/ml的靶向脂质体溶液300μl；GM-CSF组加入浓度为0.9μg/ml的GM-CSF溶液300μl(等于DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体中GM-CSF的浓度)；空白对照组加入等体积生理盐水。
3组于CO2孵箱内培养2h后，2000rpm离心10min，弃培养液，用PBS洗涤2次，2000rpm离心20min，弃上清液，收集细胞，加入PE-抗人GM-CSF抗体，0.5h后用PBS洗涤2次，流式细胞仪分析。
结果DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的包封率81％；多为单层脂质体，粒径170-220nm，参见图1-1-图1-3；偶联率41.7％；活性保留率75.1％，参见图3-1-图3-3。
采用浓度为10％戊二醛既可达到较理想的偶联率(41.7％)，又可尽量避免戊二醛对导向物质的影响以及戊二醛对后续透析实验带来的不便。
实施例2.细胞毒实验采用MTT法。取无药培养1周的HL60细胞，配成5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，在配制细胞悬液时尽量使细胞成单个细胞，在接种时不断轻轻振摇细胞悬液，以使每孔加入的细胞数一致，每孔加入细胞悬液200μl(1×104个细胞/孔)。
实验分为四组①DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组依次加入浓度(按DHAQ的含量计)为0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的靶向脂质体溶液，20μl/孔。
②DHAQ脂质体组依次加入浓度(按DHAQ的浓度计)为0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的脂质体溶液，20μl/孔。
③DHAQ组依次加入浓度为0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的DHAQ溶液，20μl/孔。
④空白对照组加入等体积的生理盐水。每个浓度组设3个平行孔。
将96孔板置于振荡器上振荡20min后置于CO2孵箱内培养24h、48h后，吸去培养液，加入无血清的培养液200μl/孔和浓度为50mg/ml的MTT溶液20μl/孔，轻轻振荡培养板，放回CO2孵箱中孵育4h，吸尽每孔中的液体，加入DMSO150μl/孔，于振荡器上振荡20min，使形成的紫色结晶充分溶解，用酶标仪测定每孔的A值(波长为490nm)。实验重复3次，取每组每一浓度的均值按下式求细胞存活率细胞存活率＝(处理组A490nm值/对照组A490nm值)×100％细胞抑制率＝1-细胞存活率根据线性方程求得IC50。
结果经DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体、DHAQ脂质体、DHAQ处理24h、48h后，HL60细胞存活率参见表1和表2。
表1不同浓度的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体、DHAQ脂质体、DHAQ对HL60细胞的杀伤作用(24h)(x±s)
注以SAS软件包进行两样本均数间的q检验，a＝0.05*与相应浓度的DHAQ组比较，p＜0.05；#与相应浓度的DHAQ-GM-CSF靶向脂质体组比较，p＜0.05。
表2不同浓度的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体、DHAQ脂质体、DHAQ对HL60细胞的杀伤作用(48h)(x±s)
注以SAS软件包进行两样本均数间的q检验，a＝0.05*与相应浓度的DHAQ组比较，p＜0.05；#与相应浓度的DHAQ-GM-CSF靶向脂质体组比较，p＜0.05。
3种药物作用24h后，在浓度＜0.0025μg/ml时，其细胞毒作用无显著性差异；在浓度为0.025μg/ml时，DHAQ-GM-CSF靶向脂质体组的细胞毒作用显著强于DHAQ脂质体组和DHAQ组(p＞0.05)。而后两者的作用之间无显著性差异(p＞0.05)，当浓度≥0.25μg/ml时，DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组和DHAQ脂质体组的细胞毒作用均显著强于DHAQ组(p＞0.05)，其中DHAQ-GM-CSF靶向脂质体组的细胞毒作用比DHAQ脂质体更强，且二者的差异也具有统计学意义(p＞0.05)。
3种药物作用48h后，当浓度≥0.0025μg/ml时，DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组和DHAQ脂质体组的细胞毒作用均显著强于DHAQ组(p＜0.05)，其中DHAQ-GM-CSF靶向脂质体组的细胞毒作用比DHAQ脂质体更强，且二者的差异也具有统计学意义(p＜0.05＝。
参见图5和图6。DHAQ-GM-CSF靶向脂质体、DHAQ脂质体和DHAQ对HL60细胞作用24h的IC50分别是3.04μg/ml、9.33μg/ml、18.15μg/ml；作用48h的IC50分别是0.87μg/ml、3.02μg/ml、6.69μg/ml本实验采用HL60细胞株，是一种急性髓性白血病细胞株，其细胞膜上大量表达GM-CSF受体，结合位点为322个/细胞。
实施例3 DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体中GM-CSF导向作用验证实验在本发明中，我们在进行MTT实验的同时进行了GM-CSF的导向性的验证实验。该实验说明DHAQ-GM-CSF靶向脂质体上的GM-CSF能够发挥导向作用，其导向效应是通过配体-受体结合而起效的，如果预先加入饱和量的GM-CSF占领HL60细胞表面的受体，则后续加入的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体的特异性杀伤作用将被阻断，仅余留脂质体的非特异性杀伤作用。采用MTT法与实施例2同时进行。
方法同实施例2。
实验分为5个剂量组每组首先加入7.5ng饱和量的GM-CSF(含3×1011个GM-CSF分子，是每孔细胞结合位点的104倍)，置于CO2孵箱中孵育1h，然后加入浓度依次为0.0025μg/ml、0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体溶液20μl/孔，每个浓度设置3个平行孔，按照实施例3中的方法测定每孔的A490nm值，求细胞存活率，再与实施例3中DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组的结果作对比。
结果，预先加入饱和量的GM-CSF可阻断DHAQ-GM-CSF靶向脂质体对HL60细胞的毒性作用，24h和48h时各浓度组的阻断实验组的细胞存活率均显著高于相应浓度的DHAQ-GM-CSF组(p＜0.05)。
实施例5 透射电镜观察1.DHAQ脂质体结构和粒径分布将DHAQ脂质体原液稀释80倍，滴在有膜铜网上，阴干，滴加1％醋酸双氧铀溶液，静置5min，滤纸吸干，H600透射电镜下放大6万倍观察其形态并摄影。
2.细胞形态取对数生长期的HL60细胞，调成密度为5×108个/l，接种于6孔板上，每孔加入细胞悬液3ml。
实验分为2组DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组和空白对照组。
DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组加入浓度为2.5μg/ml的靶向脂质体溶液300μl；空白对照组加入等体积生理盐水。
两组于CO2孵箱中培养24h，2000rpm离心10min，弃培养液，用PBS洗涤2次，2000rpm离心20min，弃上清液，4℃预冷的3.5％戊二醛沿管壁缓慢加入，覆盖沉淀的细胞，固定1h，用探针拨离细胞团块，凝胶包埋，锇酸染色，超薄切片，H600透射电镜下观察细胞超微结构的改变及凋亡细胞形态特征。
结果DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体作用24h后的HL60细胞，经瑞特染色，在光镜下可见细胞胞浆浓缩，染色质变粗、核浓缩、核碎裂等细胞凋亡的形态。透射电镜下可见大量坏死细胞和凋亡细胞，凋亡细胞膜和线粒体结构完整，染色质浓缩，沿核膜聚集成块状和新月状，形成大量凋亡小体。参见图2-1-图2-2。
3.流式细胞术检测早期凋亡情况采用AnnexinV/PI双染法。
实验分为4个组DHAQ脂质体组、DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组、DHAQ组、空白对照组。
DHAQ脂质体组加入浓度为2.5μg/ml的DHAQ脂质体液300μl；DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组加入浓度为2.5μg/ml的靶向脂质体溶液300μl；DHAQ组加入浓度为2.5μg/ml的DHAQ液300μl；空白对照组加入等体积生理盐水。
细胞处理方法同实施例2中的步骤7，培养6小时后弃培养液，收集细胞，孵育缓冲液洗1次，用100μl的AnnexinV标记液重悬细胞，室温下孵育10-15min，沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次，加入荧光(SA-Flous)溶液，4℃下孵育20min，离心去上清，孵育缓冲液洗涤1次，加入400μl孵育缓冲液洗，流式细胞仪分析。
经DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体、DHAQ脂质体、DHAQ作用24h后的HL60细胞中出现凋亡细胞，DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体组的凋亡率(25.05％)较DHAQ脂质体组(15.33％)和DHAQ组(6.64％)明显提高。参见图4-1-图4-4。
结论DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体对HL60细胞的细胞毒作用具有剂量依赖性。一定浓度的DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体可以诱导HL60细胞发生凋亡。DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体对HL60细胞明显的细胞毒作用显著强于DHAQ脂质体和DHAQ，将DHAQ制备成靶向脂质体具有提高被包封药物的疗效和降低毒性的作用，有助于提高患者的耐受性，使DHAQ更好地发挥抗白血病作用，DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体作为免疫导向化疗药物治疗白血病具有可行性，对AML具有治疗作用。
DHAQ-GM-CSF靶向药物脂质体在制备、纯化和鉴定方法方面具有可行性。本发明具有较高的包封率、偶联率和活性保留率，是一种理想的免疫导向治疗制剂，具有广泛的临床应用和推广前景。
采用本发明方法用脂质体包封不同的抗急性髓性白血病的药物表面联接GM-CSF得到包封多种化疗药物的靶向药物脂质体，可以达到上述同样的效果，因而具有广泛的参考应用价值。
权利要求
1.一种抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向药物脂质体，由在脂质体表面联接具有主动靶向性的细胞因子导向物和脂质体内一种或几种抗急性髓性白血病的药物组成。
2.根据权利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向药物脂质体，其特征在于抗急性髓性白血病的药物包括抗肿瘤抗生素或烷化剂类抗肿瘤药或影响核酸生物合成的抗肿瘤药或影响蛋白质合成的抗肿瘤药或拓扑异构酶抑制剂或生物毒素中的一种或/和几种。
3.根据权利要求2所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向药物脂质体，其特征在于抗急性髓性白血病的药物包括米托蒽醌、柔红霉素、阿霉素、阿克拉霉素、刺孢酶素、吡南阿霉素、阿糖胞苷、氟达拉宾、吉西他宾、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、长春新碱、长春花碱、拓扑替康、足叶一甙、VM26、环磷酰氨、异环磷酰氨、顺铂、卡铂、卡氮芥、马法兰、马利兰、羟基脲、紫山醇。
4.根据权利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向药物脂质体，其特征在于所述的细胞因子导向物为粒单细胞集落刺激因子。
5.制备权利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向药物脂质体的方法，包括以下步骤1).制备抗肿瘤药物脂质体；2).测定脂质体包封率；3).制备相应的GM-CSF靶向脂质体；4).GM-CSF靶向脂质体的纯化；5).GM-CSF靶向脂质体中GM-CSF活性的测定。
6.权利要求1所述的抗急性髓性白血病的GM-CSF靶向药物脂质体，用于治疗急性髓性白血病的制剂。
全文摘要
本发明涉及一种抗急性髓性白血病的GM－CSF靶向药物脂质体及制备方法，它由在脂质体表面联接具有主动靶向性的细胞因子导向物和脂质体内抗急性髓性白血病的药物组成。本发明的体外模型MTT实验检测其对急性髓性白血病细胞株HL60的细胞毒作用和对细胞凋亡的影响，实验证明本发明药物的特异靶向性好，疗效高，毒副作用小，提高了患者对化疗的耐受性，可以多次重复使用，并且成本低，安全性高，为用靶向脂质体包封药物治疗恶性肿瘤，提供了研究基础。
文档编号A61K45/00GK1806794SQ20051005726
公开日2006年7月26日 申请日期2005年9月12日 优先权日2005年9月12日
发明者娄世峰, 张颖, 陈林, 陈姝, 翁春岚, 彭薇, 周慷, 邓建川, 罗云 申请人:重庆医科大学附属第二医院