使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法、稳定化组合物和饮食品的制作方法

专利名称：使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法、稳定化组合物和饮食品的制作方法
技术领域：
本发明关于使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，乳酸菌抗过敏活性相对高温处理稳定的化组合物，和具有稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等饮食品及其制造方法。
背景技术：
在发达国家，过敏是发病频率最高的疾病之一。过敏发病机理通常分为I型到IV型四种，I型、II型和IV型与发生食物过敏有关。另一方面，花粉症、特异反应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等与环境相关的过敏具有I型发病机理。
I型过敏的特征在于，过敏原特异性IgE的诱导和组胺、白三烯等化学介质的释放有关。IL-4、IL-5、IL-13等Th2细胞因子，对于B细胞发生抗体类型转换，产生IgE抗体是必不可少的。实际上已知，过敏患者的淋巴细胞中Th2细胞是增加的。即，外界侵入的过敏原，借助树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞，以其一部分结合于MHC II类分子的状态，呈递给T细胞，Th2细胞被激活，分化。Th2细胞释放的Th2细胞因子诱导B细胞类别转换，产生IgE抗体，IgE抗体结合于组织内的肥大细胞、血中的嗜碱性细胞表面的Fc·R。抗原在下次入侵时，被肥大细胞、嗜碱性细胞表面结合的IgE抗体识别，在IgE抗体间形成桥联。以该刺激为导火索，肥大细胞、嗜碱性细胞爆发性游离释放出化学介质，从而表现出各种过敏症状。
在预防和治疗IgE、化学介质介导的过敏中，例如有，通过和组胺竞争性结合组胺受体，从而阻断末梢神经发出的信号的传达的抗组胺剂、通过降低产生化学介质的细胞的活性来试着减轻症状的抗过敏剂，通过降低免疫应答性来减轻炎症的甾体试剂、通过定期注射抗原本身诱导耐受性的脱敏疗法等，但这些都有副作用的问题，并且效果也不确定。
近年来，通过调节Th2细胞因子的产生来抑制IgE的方法备受瞩目。已报道，结核菌、溶血性链球菌、乳酸菌等一些种类的细菌，通过增强Th1免疫，从而抑制Th2免疫，达到降低IgE的效果(临床免疫，1999年，第32卷，454页；インタ一ナシヨナルア一カイブスオブアレルギ一アンドイムナロヅ一，1998年，第115卷，278页；特开平9-2959号公报)。
其中，从安全性考虑，鉴于乳酸菌易于用于食品等，因此是很好的原料。但是，并不是所有的乳酸菌都有很好的增强Th1免疫的效果，这就需要挑选有用菌株。已显示，通过将公知的抗过敏乳酸菌鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LGG菌株用于妊娠妇女，可抑制小孩遗传过敏性皮炎发病(ランセツト，2001年，第357卷，1076页)。将乳酸菌作为抗过敏剂使用，已在多个专利公报公开。例如，特开平9-2959号公报公开了，在培养小鼠淋巴细胞时，添加嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、以及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等乳酸菌，将IgE产生量小于等于30ng/mL者用作抗过敏剂；特开平10-309178号公报公开了，将婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等双歧杆菌作为特别是治疗食物过敏使用的抗过敏剂；以及特开2000-95697号公报公开了，将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)等乳酸菌作为过敏性支气管哮喘、过敏性鼻炎和遗传过敏性皮炎等I型过敏的抑制剂使用。
另一方面，已知乳酸菌等增强Th1免疫，是指通过产生IL12、IFN-γ等，激活巨噬细胞、T杀伤细胞、NK细胞等细胞免疫，其与抑制病毒、细菌感染、癌的发生有关。具体而言，巨噬细胞产生的IL-12，通过促进未分化的T辅助细胞向Th1细胞分化，激活单核、巨噬细胞、NK细胞，从而获得对入侵物、癌症的抵抗性。由此，提示可以使用能够诱导IL-12大量产生的乳酸菌株作为免疫激活剂(Cancer&Immunology&Immunotherapy，2000年，第49卷，157页；特开平7-228536号公报；特开2002-80364号公报)。
近年，很多因发生过敏引起的体质变化的人，都出现遗传过敏性皮炎、花粉症等症状，这已成为社会问题。其中，尤其是对重症患者，需要使用各种药物进行治疗。但事实是，大部分对象并未接受到全面治疗，而只是在日常生活过程中，应对性地采取包含民间疗法在内的对应治疗。鉴于这样的状况，近来通过食物来抑制过敏的研究非常盛行。其结果是，例如，发现紫苏油、鱼油、特定茶多酚等多种饮食品成分具有抗过敏效果，并已将它们用于治疗策略。
作为具有抗过敏效果的饮食品的成分，已知特定的乳酸菌也像上述物质具有同样效果，使用该乳酸菌的酸奶、乳酸菌饮料，作为具有抗过敏效果的饮食品，已在实际中部分得到应用。从安全性角度考虑乳酸菌易于用于食品等，作为有用的原料而备受瞩目。例如，将乳酸菌用作减少与I型过敏发病相关的IgE抗体数量，使过敏的治疗和预防变容易的抗过敏剂，以各种乳酸菌作为有效成分的抗过敏剂，已经被公开(特开平9-2959号公报，特开2004-26729号公报)。尽管通过该种抗过敏用饮食品进行预防或治疗是安全的，并可在温和的条件下摄取，但是，需要每天连续摄取，并且该连续摄取需要以可能的量发挥功效。
作为乳酸菌向食品的应用，可以举出酸奶、乳酪、发酵乳等，此外，也试图用于乳制品以外的饮食品，但都只限于用于无需高温加热处理的饮食品。例如，作为试图和茶成分一起使用的例子有，在冷却后的茶叶汤中，添加从绿茶分离得到的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，发酵后用于饮料等(特开平11-276072号公报)；将以含有茶提取物等的培养基培养得到的乳酸菌培养物用作饮食品(特开2001-190272号公报)；茶叶等植物资源细细粉碎后，作为培养基，添加Lactobacillus plantalium之类的乳酸菌，进行培养后，将培养物用作发酵食材(特开2002-330725号公报)；将茶叶提取液中的多酚去除后，添加乳酸菌进行培养后，用作含有具有甜味花香的γ-氨基酸香味的茶饮料(特开2003-333990号公报)等。
但是，由于最近市场中流通的容器装饮料等很多饮食品，在其制造过程、流通过程或食用时需要进行高温加热处理，此时会有，乳酸菌菌体的性状发生变化，抗过敏活性受到影响的问题。因而，以往一直存在，乳酸菌的抗过敏活性在高温加热处理的饮食品的应用受到制约的问题。此外以往，针对高温加热处理的饮食品，不仅存在上述问题，而且也一直没有探讨高温加热处理对乳酸菌抗过敏能力的影响，也就一直没有得到利用。
另一方面，植物、饮食品中所含的多酚类物质生理活性受到瞩目，已有大量研究和报道。例如已公开，绿茶提取物中的多酚类物质具有抗菌作用、抗氧化作用、抑制胆固醇增高的作用、α-淀粉酶活性抑制作用等(特开2003-138258号公报、特开昭60-156614号公报、特开平3-133928号公报、特开2004-166671号公报)。乳酸菌和多酚同时摄取产生的通便改善效果(特开2004-155727号公报)、在茶提取液中的培养(特开2003-333990号公报)。这些公开由于都关注的是多酚类物质的生理活性，并没有触及与乳酸菌在抗过敏能力方面的相互作用。
专利文献1特开昭60-156614号公报。
专利文献2特开平7-228536号公报。
专利文献3特开平9-2959号公报。
专利文献4特开平10-309178号公报。
专利文献5特开平11-276072号公报。
专利文献6特开2000-95697号公报。
专利文献7特开2001-190272号公报。
专利文献8特开2002-330725号公报。
专利文献9特开平3-133928号公报。
专利文献10特开2002-80364号公报。
专利文献11特开2003-138258号公报。
专利文献12特开2003-333990号公报。
专利文献13特开2004-26729号公报。
专利文献14特开2004-155727号公报。
专利文献15特开2004-166671号公报。
非专利文献1临床免疫，1999年，第32卷，454页；インタ一ナシヨナルア一カイブスオブアレルギ一アンドイムナロヅ一，1998年，第115卷，278页。
非专利文献2ランセツト，2001年，第357卷，1076页。
非专利文献3Cancer&Immunology&Immunotherapy，2000年，第49卷，157页。

发明内容
发明要解决的问题本发明的目的在于，提供可在高温处理时维持乳酸菌抗过敏活性的、使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法、相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，和具有稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等饮食品及其制造方法，它们可适用于在制造过程、流通过程或食用时需进行高温加热处理的饮食品，进而也适用于高温处理后保存于常温的饮食品。
解决问题的手段本发明人在对高温处理的饮食品中的乳酸菌的抗过敏活性进行潜心研究的过程中发现，通过使乳酸菌和多酚类物质一同存在，则即使是在高温处理的情况下，乳酸菌的抗过敏活性也可保持稳定，从而完成了发明。
即，本发明人在向绿茶中添加具有抗过敏能力的乳酸菌，进行UHT杀菌的研究中发现，绿茶成分中的多酚，具有UHT杀菌、高温保存时使饮食品的抗过敏活性稳定的作用，以及稳定高温处理后常温保存的饮食品的抗过敏活性的作用，从而完成本发明。尤其可适用于包括饮料在内的，在其制造过程、流通过程或食用时需进行高温加热处理的众多的饮食品。本发明的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，可作为相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物提供，通过该组合物，可赋予高温处理的饮食品稳定化的乳酸菌抗过敏活性，本发明包含上述的相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物。作为本发明中使用的多酚类物质，可优选使用像绿茶提取多酚类物质那样的由植物提取的多酚类物质，如茶之类的饮食品自身含有多酚类物质的情况下，利用该多酚类物质，或根据需要在该多酚类物质中再补充多酚类物质，均可实施本发明。
此外，本发明中，在采用本发明的稳定化方法，制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等时发现，通过在特定pH条件下进行高温处理，即，通过在pH4.6～6.6范围，尤其优选pH5.5～6.5范围进行，可制造具有对高温处理更稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等，进而，在采用本发明的稳定化方法，制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等时发现，通过将高温处理配制的饮料等调整到特定的pH范围后，装入容器密封保存，可制造具有更稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等，完成了本发明。
本发明的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，可适用于进行高温处理的多种饮食品，尤其可适用于绿茶、发酵茶或半发酵茶之类的茶饮料，即根据本发明可提供具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料。进而，本发明可使用具有高抗过敏活性的乳酸菌作为在本发明中使用的乳酸菌，本发明包含使用具有这样的高抗过敏活性的乳酸菌的、使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，以及具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等。作为这样的具有高抗过敏活性的乳酸菌的示例，可以举出，保藏于根据有关专利微生物保藏的布达佩斯条约的国际保藏单位独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址 305-8566，日本国茨城县筑波东1丁目1番地1中央第6；保藏日2004年2月20日)保藏号为FERMBP-08634和FERM BP-08635的类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)KW3110和其衍生菌株。本发明的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，即使是在使用乳酸菌的加热死菌的情况下，也起到赋予乳酸菌产生的抗过敏活性的效果。
即，具体而言，本发明包括(1)使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其特征在于，使乳酸菌和多酚类物质共存；(2)根据上述(1)所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，多酚类物质是植物提取多酚类物质；(3)根据上述(2)所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，植物提取多酚类物质是绿茶提取多酚类物质；(4)根据上述(1)～(3)任一项所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，乳酸菌是具有高抗过敏活性的乳酸菌；(5)根据上述(4)所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，具有高抗过敏活性的乳酸菌是类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KW3110株、植物乳杆菌KW4110株、类干酪乳杆菌KW3925株、类干酪乳杆菌KW3926株或唾液链球菌(Streptococcus salivarius)KW3210株或它们的衍生菌株；(6)根据上述(4)或(5)所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，具有高抗过敏活性的乳酸菌是类干酪乳杆菌KW3110(FERM BP-08634)，或其衍生菌株(FERM BP-08635)。
此外，本发明还包括(7)相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，其特征在于，上述(1)～(6)任一项所述的乳酸菌和上述(1)～(6)任一项所述的多酚类物质共存；(8)根据上述(7)所述的相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，其中，使乳酸菌和多酚类物质共存的相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物是用于饮料添加的。
进而，本发明包括(9)具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的食品，其特征在于，上述(1)～(6)任一项所述的乳酸菌和上述(1)～(6)任一项所述的多酚类物质共存；(10)具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其特征在于，上述(1)～(6)任一项所述的乳酸菌和上述(1)～(6)任一项所述的多酚类物质共存；(11)根据上述(10)所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，饮料是不含乳成分的、装入密封容器的饮料；(12)根据上述(10)或(11)所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，饮料是装入密封容器的含有果汁的清凉饮料或茶饮料；(13)根据上述(10)～(12)任一项所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，饮料是在茶饮料中添加乳酸菌和多酚类物质，或者是通过添加乳酸菌，使得上述(1)～(6)任一项所述乳酸菌和上述(1)～(6)任一项所述多酚类物质共存而得到的饮料；(14)根据上述(13)所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，茶饮料是绿茶饮料；(15)根据上述(13)所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，茶饮料是发酵茶或半发酵茶；(16)根据上述(10)～(15)任一项所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，装入密封容器的饮料中，乳酸菌的添加量是，109～1011个/100g饮料。
此外，本发明还包括(17)制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其特征在于，在制造上述(10)～(16)任一项所述的具有乳酸菌抗过敏活性的饮料时，在pH4.6～6.6范围内进行饮料的高温处理；(18)根据上述(17)所述的制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其中，在pH5.5～6.5范围内进行饮料的高温处理；(19)根据上述(17)或(18)所述的制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其中，饮料的高温处理是UHT杀菌处理；(20)制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其特征在于，在制造具有上述(10)～(16)任一项所述的具有乳酸菌抗过敏活性的饮料时，将经高温处理配制的饮料调整到pH5.5～6.5范围后，装入容器并密封；(21)根据上述(17)～(20)任一项所述的制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其中，饮料是绿茶饮料。


图1是显示可用于本发明的乳酸菌及其获取地(No.1)的图。
图2是显示可用于本发明的乳酸菌及其获取地(No.2)的图。
图3是显示可用于本发明的乳酸菌及其获取地(No.3)的图。
图4是显示本发明的实施例中，在将乳酸菌混合到各种绿茶后，由UHT杀菌引起的抗过敏活性的变化的图。
图5是显示本发明的实施例中，在5℃和50℃保存1周后，绿茶中乳酸菌的相对抗过敏活性的图。
图6是显示本发明的实施例中，在各种pH条件下，进行加热处理时，乳酸菌抗过敏残留活性的相对活性的测定结果的图。
图7是显示本发明的实施例中，在将UHT杀菌后的绿茶调整到各种pH后，装入容器并密封的情况下，绿茶中的乳酸菌抗过敏能力的评价结果的图。
具体实施例方式
本发明包括通过使乳酸菌和多酚类物质共存，从而使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定的方法；使用该方法所得的相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物；以及具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮食品。本发明中的“高温处理”，例如包括，在高于或等于50℃的温度下进行的杀菌操作、热售卖机中的商品展示、UHT杀菌等在饮食品制造过程、流通过程或饮食时所加的高于或等于常温的温度处理，使乳酸菌抗过敏活性降低的温度处理。在制造本发明的具有稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等时，优选在pH4.6～6.6的条件下，进行高温处理。更优选在pH5.5～6.5的范围内进行。
作为本发明使用的多酚类物质，可举出优选的如绿茶提取多酚类物质之类的植物提取多酚类物质。在像茶那样，饮食品自身含有多酚类物质的情况下，可利用该多酚类物质，使得乳酸菌和多酚类物质共存，根据需要还可在饮食品自身所含的上述多酚类物质中再补充添加多酚类物质，或者通过浓缩等，提高多酚类物质浓度，使得共存量达到要求。
要从植物原料制备多酚类物质，可通过对植物体进行热水提取等，适当制备。作为本发明的多酚提取方法之一，可采用绿茶提取。这里所说的绿茶提取是指，用热水或水溶性有机溶剂提取茶叶后，浓缩提取液，再精制，或者直接精制提取液。此外，也可使用市售的三井农林(株)生产的“多酚”、伊藤园(株)生产的“テアフラン”、太阳化学(株)生产的“サンフエノン”等绿茶提取液的浓缩物。本发明中，饮食品中乳酸菌和多酚类物质共存时，作为优选的多酚类物质浓度，多酚类物质总浓度至少在50～130mg/100mL的范围，更优选在60～130mg/100mL的范围。
本发明中使用的乳酸菌，只要具有抗过敏活性，就没有特殊限定，可以使用乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)等任意乳酸菌。作为用于本发明的乳酸菌，例如可举出，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidaphilus)、短乳杆菌(Lactobacillusbreve)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、凯氏乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳球菌(Lactococcusplantarum)、棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等。
可在本发明中使用的乳酸菌的例子及其获取地示于图1(No.1)和图2(No.2)。本发明中，所有的菌株都用KW开头的编号予以标识，这是由于这些试验株有的是自己分离得到的，有的是市售乳制品使用的，还有的是从公共机构得到的，因而为方便起见，均采用统一的标识名，各KW株和获取来源的关系如图1(No.1)、图2(No.2)和图3(No.3)所示。此外，上述图1和图2的“获取地”中，“JCM”表示的是理化学研究所微生物系统保存设施，“IFO”表示的是前财团法人发酵研究所(现在，独立行政法人制品评价技术基础机构，生物资源中心(NBRC))。
本发明中，作为具有抗过敏活性的乳酸菌，可以使用具有高抗过敏活性的乳酸菌。作为具有高抗过敏活性的乳酸菌，可以举出类干酪乳杆菌KW3110株、植物乳杆菌KW4110株、类干酪乳杆菌KW3925株、类干酪乳杆菌KW3926株、唾液链球菌KW3210或它们的衍生菌株。
该乳酸菌，例如，类干酪乳杆菌KW3110株，可以从日本乳业技术协会以干酪乳杆菌L14株的名义得到。此外，根据日本乳业技术协会的记载，L14株被记载为干酪乳杆菌株，但本发明人用QUALICON公司生产的Ribo Printer，进行RFLP(Restriction Flagment LengthPolymorphism)和AFLP(Amplified Flagment Length Polymorphism)分析后，判断该株为类干酪乳杆菌，因此，本发明中记载为类干酪乳杆菌。本发明中作为抗过敏用组合物的有效成分使用的类干酪乳杆菌KW3110，如上所述可从日本乳业技术协会得到，此外，还保藏于根据有关专利微生物保藏的布达佩斯条约为国际保藏单位的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏号FERM BP-08634。此外，类干酪乳杆菌KW3110的衍生菌株，也保藏于上述特许生物寄托中心，保藏号FERM BP-08635。
此外，作为本发明中具有高抗过敏活性的乳酸菌使用的植物乳杆菌KW4110株、类干酪乳杆菌KW3926株，可分别作为植物乳杆菌JCM1149株、类干酪乳杆菌JCM8132株，从JCM(理化学研究所微生物系统保存设施)得到，此外，类干酪乳杆菌KW3925株，可作为类干酪乳杆菌NRIC1917株，从NRIC(东京农业大学)得到。
本发明中使用的具有抗过敏活性的乳酸菌，可通过将上述乳酸菌在培养基中培养来制备。培养时使用的培养基，只要是上述乳酸菌能够生长的培养基即可，可以使用动物乳、脱脂乳、乳性乳清、MRS培养基、GAM培养基、BL培养基、BLB培养基(Briggs Liver Broth)之类的合成培养基等。培养温度可以为20℃到50℃，优选为25℃到42℃。此外，培养时间可以为3小时到96小时。可将培养结束后的培养基直接，或者根据需要再进行处理，作为本发明的乳酸菌。例如，培养结束后，可通过将培养基离心、过滤等收集菌体，只将菌体作为本发明的乳酸菌，也可将其经喷雾干燥得到干燥菌体，或其冻干菌体作为本发明的乳酸菌。本发明的乳酸菌，除上述乳酸菌菌体外，还可还有其它成分。作为其它成分，可举出赋形剂等添加剂和后述培养基成分等。
以下显示本发明中使用的具有高抗过敏活性的乳酸菌的具体制备例(乳酸菌KW3110株菌体的制备)使用培养用培养基(葡萄糖1％、酵母提取物(武田キリン食品社)1％、MgSO4·7H2O 50ppm、MnSO4·5H2O 50ppm)培养乳酸菌。将乳酸菌KW3110株接种于10mL培养用培养基，37℃静置20～24小时，进行上述培养。本培养是将0.6mL上述培养液接种于120mL的培养用培养基，用200mL的发酵容器(型号BMJ-25、エイブル公司)，于28℃培养。通气量为0.12L/min，搅拌速度为500rpm。pH用25％的NaOH溶液调至pH4.5以下。培养48小时。
培养结束后，以8500Xg、10分钟离心分离，收集菌体。混悬于30mL灭菌蒸馏水，以8500Xg、10分钟离心分离，收集菌体。重复3次上述清洗操作，除去培养基来源的成分。将洗净的菌体混悬于10mL灭菌水，于高压消毒锅中100℃处理30分钟后，冻干。最终得到乳酸菌干燥菌体50～70mg。对得到的乳酸菌的抗过敏活性予以确认。
本发明中将乳酸菌和多酚类物质并存，使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，可适用于制造过程、流通过程或饮食时要高温处理的众多的饮食品。本发明作为将乳酸菌和多酚类物质并存，相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，可添加到各种饮食品中，赋予饮食品稳定的抗过敏活性。
本发明中将乳酸菌和多酚类物质并存，使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，尤其可有效适用于赋予饮料稳定的抗过敏活性。作为该饮料，可以举出茶饮料或非茶饮料。作为与这种情况配合的尤其优选的多酚类物质，可以举出像绿茶提取多酚类物质之类的植物提取多酚类物质。作为绿茶提取多酚类物质的配合对象，可以举出，选自绿茶、半发酵茶和发酵茶的茶提取液，此外，绿茶提取多酚类物质还可作为配合非茶饮料的尤其优选的多酚类物质。其中，优选在茶提取液中配合有上述绿茶提取物的饮料，尤其优选在绿茶提取液中配合有上述绿茶提取物的绿茶饮料。
作为半发酵茶，可以举出乌龙茶；作为发酵茶，可以举出红茶。此外，作为非茶饮料，例如，可以举出作为软饮料的碳酸饮料、含有果实提取物的饮料、含有蔬菜提取物的浆汁、接近于水的饮料(nearwater)、运动饮料、减肥饮料(diet drinks)等。根据本发明，在将已赋予有稳定的抗过敏活性的饮料作为装入密封容器中的饮料进行产品生产的时候，优选将添加的乳酸菌调整到每100克饮料含有109～1011个的范围。
本发明中，作为配合本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌的饮料，可以举出如上述那样各种饮料，在制造这些饮料时，饮料处方设计时常用的糖类、香料、果汁和食品添加物等都可使用。关于饮料的制造，可以参考现有的参考书，例如参考《改订版ソフトドリンクス》(株式会社光琳)等。
本发明中，作为尤其适宜配合的饮料，从抗过敏作用和制品保存、稳定化的观点考虑，优选不含乳成分，即，例如，含有果汁的清凉饮料或像上述茶饮料之类的不含乳成分的饮料。本发明的具有稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等，可装入容器密封，作为“密封容器装饮料”进行产品生产。此时，优选将经高温处理配制的饮料调整到pH5.5～6.5范围后，再充填。
以下，由实施例对本发明进行更具体说明，但本发明的技术范围并不限于这些示例。
实施例1以3.5kg溶解有3g抗坏血酸的80℃的温水提取绿茶叶(主要是カブセ茶、玉露)100g约6分钟。筛网过滤提取液，除去茶叶，离心分离。在上清液中加入5g碳酸氢钠，3g抗坏血酸，加入水直到总重为12kg。以该绿茶叶为基础绿茶(1)；在(1)中添加8g多酚70A(三井农林株式会社)，作为基础绿茶+多酚70A(2)；将使用的离心分离后的提取液上清为(1)的2倍的绿茶作为茶叶提取液2倍绿茶(3)；在(1)的离心分离前的提取液中添加18g PVPP，搅拌后，离心分离，将上清液作为PVPP处理绿茶(4)。
(1)～(4)中的pH为6.0～7.0，此外，(1)～(4)的多酚总量，采用没食子酸乙酯为标准液，以酒石酸铁法定量(参考文献茶叶研究报告第71号(1990)茶的分析，单宁值的比色定量法)。定量结果示于表1。
表1

在上述绿茶(1)～(4)中添加0.02％的乳酸菌类干酪乳杆菌KW3110株(加热死菌，从キリンビ一ル(株)功能食品公司得到)，UHT杀菌。杀菌是在135℃、30秒和137℃、30秒的条件下进行，热罐装(hot pack)充填于500mL容积的塑料瓶。25mL杀菌后的绿茶，以8000转离心分离10分钟，得到乳酸菌沉淀物。将沉淀物以PBS(-)清洗干净后，再次离心分离，将沉淀物混悬于5mL PBS(-)中。
乳酸菌的体外抗过敏活性是通过和小鼠脾淋巴细胞混合培养后，测定培养基中释放的IL-2的量来测定的。在第0天和第6天时，给7-10周龄BALB/c小鼠(Charles River)腹腔内注射1mg卵清蛋白(OVA)和2mg氢氧化铝佐剂。第13天解剖，取出脾脏，制备淋巴细胞。将脾淋巴细胞用添加有终浓度分别为10％和1mg/mL的FCS(Roche)和OVA的RPM11640(Sigma)培养基混悬，使得细胞浓度为2.5×106细胞/mL。在上述培养基中添加乳酸菌，使其浓度为0.25μg/mL，在37℃、CO2浓度5％的条件下，培养1周。离心分离，回收培养上清，用Opt EIA ELISA set(Becton Dickinson)测定IL-12的产量。
图4显示的是混合到各绿茶后，由UHT杀菌引起的抗过敏活性的变化。显示的是UHT杀菌后相对于杀菌前的相对抗过敏活性。其结果是，在两种杀菌条件下，基础绿茶+多酚70A(2)和茶叶提取液2倍绿茶，在UHT杀菌后的残留活性均比基础绿茶(1)高10～20％。PVPP处理绿茶(4)的残留抗过敏活性比基础绿茶(1)低10～20％。由此认为残留抗过敏活性的高低和表1所示的多酚含量(单宁含量)有关。
实施例2将实施例1制备的4种绿茶于5℃和50℃保存一周后，评价绿茶中乳酸菌抗过敏活性。试验按照和实施例(1)相同的顺序进行。图5显示的是50℃保存一周后相对于5℃保存的相对抗过敏活性。
在两种杀菌条件下，基础绿茶+多酚70A(2)和茶叶提取液2倍绿茶(3)，在保存温度下，抗过敏活性基本不变；而基础绿茶(1)的抗过敏活性降低，PVPP处理绿茶(4)的抗过敏活性则大幅度降低。和实施例(1)中UHT杀菌刚结束时的抗过敏活性一样，发现就50℃保存的稳定性而言，多酚含量高具有优越性。由于已确认50℃保存具有优良的稳定性，因而认为常温保存下的长期稳定性更高。
实施例3在pH为4.0、4.3、4.6、5.0、5.3、5.6、6.0、6.3、6.6、7.0的50mM枸橼酸/枸橼酸钠缓冲液中添加0.025％的乳酸菌类干酪乳杆菌KW3110株干燥菌体，95℃加热处理180分钟。加热后，离心分离获得乳酸菌沉淀物，评价乳酸菌抗过敏能力。试验按照和实施例(1)一样的顺序进行。图6显示的是混合到各pH缓冲液后，由加热处理引起的抗过敏能力的变化。加热处理所致的残留活性依赖于pH。结果显示，pH7.0时的残留活性比pH6.0低40％左右。这和实施例4中与绿茶混合时的结果一样。
实施例4以3.5kg溶解有3g抗坏血酸的80℃的温水提取绿茶叶(主要是カブセ茶、芽茶)100g约6分钟。筛网过滤提取液，除去茶叶，离心分离。在上清液中加入3g碳酸氢钠，3g抗坏血酸和3g绿茶提取物，2g乳酸菌类干酪乳杆菌KW3110株干燥菌体，然后加入水混合，直到总重量为12kg。以其为绿茶(1)pH＝6.0。改变上述绿茶(1)的碳酸氢钠添加量，pH分别调整为5.5、6.5和7.0，分别作为绿茶(2)、(3)和(4)。将该绿茶(1)～(4)UHT杀菌后，热罐装充填于350mL容积的塑料瓶。离心分离杀菌后的绿茶，得到乳酸菌沉淀物，评价绿茶中乳酸菌的抗过敏能力。试验按照和实施例(1)一样的顺序进行。图7显示的是混合到各绿茶后，由UHT杀菌引起的抗过敏能力的变化。其结果是，pH5.5、6.0、6.5与加热处理所致的残留活性在同一程度，而pH7.0则低50％左右。于是确认，残留抗过敏能力的高低和pH相关。
产业上的可利用性本发明提供使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法。根据本发明，可对在制造过程、流通过程或饮食时进行高温加热处理的众多的饮食品，以及高温处理后保存于常温的众多的饮食品，赋予乳酸菌产生的稳定的抗过敏活性，可使该活性稳定化，维持活性。本发明可有效适用于本身含有大量多酚的茶类等饮料，根据本发明，可提供具有乳酸菌产生的稳定的抗过敏活性的饮料。本发明中，作为优选的实施方式，可使用具有高抗过敏活性的乳酸菌作为所用乳酸菌，借助该乳酸菌，可提供具有高抗过敏功能的活性稳定的饮食品。
权利要求
1.使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其特征在于，使乳酸菌和多酚类物质共存。
2.根据权利要求1所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，多酚类物质是植物提取多酚类物质。
3.根据权利要求2所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，植物提取多酚类物质是绿茶提取多酚类物质。
4.根据权利要求1～3任一项所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，乳酸菌是具有高抗过敏活性的乳酸菌。
5.根据权利要求4所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，具有高抗过敏活性的乳酸菌是类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KW3110株、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KW4110株、类干酪乳杆菌KW3925株、类干酪乳杆菌KW3926株或唾液链球菌(Streptococcus salivarius)KW3210株或它们的衍生菌株。
6.根据权利要求4或5所述的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法，其中，具有高抗过敏活性的乳酸菌是类干酪乳杆菌KW3110(FERM BP-08634)，或其衍生菌株(FERM BP-08635)。
7.相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，其特征在于，权利要求1～6任一项所述的乳酸菌和权利要求1～6任一项所述的多酚类物质共存。
8.根据权利要求7所述的相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，其中，乳酸菌和多酚类物质共存的相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物是用于饮料添加的。
9.具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的食品，其特征在于，权利要求1～6任一项所述的乳酸菌和权利要求1～6任一项所述的多酚类物质共存。
10.具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其特征在于，权利要求1～6任一项所述的乳酸菌和权利要求1～6任一项所述的多酚类物质共存。
11.根据权利要求10所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，饮料是不含乳成分的装入密封容器的饮料。
12.根据权利要求10或11所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，饮料是装入密封容器的含有果汁的清凉饮料或茶饮料。
13.根据权利要求10～12任一项所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，饮料是在茶饮料中添加乳酸菌和多酚类物质，或者是通过添加乳酸菌，使得权利要求1～6任一项所述乳酸菌和权利要求1～6任一项所述多酚类物质共存而得到的饮料。
14.根据权利要求13所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，茶饮料是绿茶饮料。
15.根据权利要求13所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，茶饮料是发酵茶或半发酵茶。
16.根据权利要求10～15任一项所述的具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料，其中，在装入密封容器的饮料中，乳酸菌的添加量是，109～1011个/100g饮料。
17.制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其特征在于，在制造权利要求10～16任一项所述的具有乳酸菌抗过敏活性的饮料时，在pH4.6～6.6范围内进行饮料的高温处理。
18.根据权利要求17所述的制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其中，在pH5.5～6.5范围内进行饮料的高温处理。
19.根据权利要求17或18所述的制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其中，饮料的高温处理是UHT杀菌处理。
20.制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其特征在于，在制造具有权利要求10～16任一项所述的具有乳酸菌抗过敏活性的饮料时，将经高温处理配制的饮料调整到pH5.5～6.5范围后，装入容器并密封.
21.根据权利要求17～20任一项所述的制造具有对高温处理稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料的方法，其中，饮料是绿茶饮料。
全文摘要
提供可在高温处理时维持乳酸菌抗过敏活性的使乳酸菌所具有的抗过敏活性对高温处理稳定化的方法、相对于高温处理乳酸菌抗过敏活性稳定的组合物，和具有稳定的乳酸菌抗过敏活性的饮料等饮食品及其制造方法。通过使乳酸菌和多酚类物质共存，即使是在进行高温处理时，也可维持乳酸菌的抗过敏活性。作为本发明使用的多酚类物质，可以使用像绿茶提取多酚类物质之类的植物提取多酚类物质。本发明中，可使用具有抗过敏活性的多种乳酸菌，尤其是，可优选使用具有高抗过敏活性的乳酸菌作为乳酸菌。本发明的方法可适用于制造过程、流通过程或饮食时进行高温加热处理的饮食品。
文档编号A61P43/00GK101018853SQ20058003060
公开日2007年8月15日 申请日期2005年9月8日 优先权日2004年9月10日
发明者米田俊浩, 井门久美子, 山内浩一郎, 斋木朗, 贞苅季代子 申请人:麒麟麦酒株式会社