多肽的制作方法

专利名称：多肽的制作方法
多肽
本发明涉及通过病原微生物表达的抗原性多肽、包括所述抗原性多肽的 疫苗和针对所述抗原性多肽的治疗性抗体。
背景
目前医药开发面对的 一个问题是许多重要病原微生物的抗生素抗性菌抹 的进化。产生抗生素抗药性的病原生物的一个例子是金黄色葡萄球菌。金黄
色葡萄球菌(5".awwM)是一种细菌，其正常生长环境是约20 - 40%的正常 健康人的鼻粘膜上皮，也常在人的皮肤上发现，通常并不导致损害。然而， 在某些情况下，特别是当皮肤破损时，该微生物可以导致感染。在医院里， 病人可能做了外科手术和/或是服用了免疫抑制药物，这是医院中的一种特殊 问题。由于病人们已经接受的治疗，他们对于金黄色葡萄球菌的感染更加容 易受到伤害。近年来出现了金黄色葡萄球菌的抗性菌抹。二曱氧基苯青霉素 的抗性菌林开始流行起来，并且这些抗性菌株中的许多是也对若干其它抗生 素具有抗性。目前尚无针对金黄色葡萄球菌的有效的免疫程序。
本发明涉及有效的疫苗成分和治疗剂，其针对避免或降低直接抗性的病 原菌抹的问题。
在土壤革兰氏阳性细菌枯草芽胞杆菌(^^7/wwMfc)的染色体的大约 4100个基因中，271个基因对于其生长是必要的("必需的")，并且其中23个 在所述生物的生理学中的作用不明确(gcp， 。6g, /少"C-:Ky6g-, frm [/, wcX, yaciV/， _y<i/B，少(i/C, j^'WV, yA:《C, y/"iV, y/og，少/gi7, _yw<i^， ywe51, J^/ C, j^ei/", y(3^Z, y^/K，3;rvO，:^jcC，ytoG,戸/C)(Kunst等人，1997)。迄今为止，由这些基因编 码的同源蛋白^tt现于另 一种革兰氏阳性细菌，即人病原体金黄色葡萄球菌 的各种菌抹中。其中，Gcp和YneS的直向同源物被预测为膜蛋白(参见附录 I )，而其余的则被预测为细胞质蛋白(数据未予显示)。不过，Obg已经显示 出在枯草芽胞杆菌中是部分地与膜结合的(Kobayashi等人，2001)。
本发明人已经分离得到了 一些多肽，所述多肽为该病原体枯草芽孢杆菌 和金黄色葡萄球菌生长的必需成分，并且已经得到了抗这些多肽的抗血清。 本发明人发现抗所述枯草芽孢杆菌多肽而产生的的抗血清会导致所述金黄
色葡萄球菌祐:极其有效地杀灭。该作用是不能预测到的。
这些发现促进了疫苗和抗体治疗剂的开发，所述疫苗和抗体治疗剂能够 减轻当前治疗剂中的一些问题，例如抗生素的抗性问题。
本发明公开内容的简短说明
本发明提供抗原性多肽，所述多肽对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和金 黄色葡萄球菌的生长是必需的，并且被用于治疗或预防微生物的感染。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种用作药物的抗原性多肽，或该 多肽的部分，其通过分离的核酸序列编码，该分离的核酸序列选自
i )如

图1到6所示的核酸序列；
ii )(i)中的核S吏序列，其编码通过病原生物表达的多肽；
iii) 杂交到上述(i)或(ii)中定义的序列上的核酸序列；和
iv) 由于在(i)、 (ii)或(iii)中定义的核酸序列的遗传密码而简并的核酸序列。 在本发明的一个优选的方面，所述药物是疫苗。
编码本发明第一方面的抗原性多肽的核酸可以在严谨杂交条件下退火为 图1至6中所示的核酸序列或退火为其互补链。
严谨杂交/洗涤的条件是所属技术领域中众所周知的。例如，在0.1xSSC, 0.1%SDS中于60。C下洗涤后，核酸的杂交物是稳定的。本领域中众所周知 的是，如果核S吏序列是已知的，则其最佳的杂交条件是可以计算的。例如， 杂交条件可通过要进行杂交的核酸的GC含量来确定。请参见Sambrook等 人(1989 ), Molecular Cloning; A Laboratory Approach。用于计算实现在^见定
同源性的核酸分子之间杂交所要求的严谨条件的常用^^式的为
Tm = 81.5° C + 16.6 Log [Na+] + 0.41[ 0/。 G + C] —0.63 (%曱酰胺)。
编码本发明第一方面的抗原性多肽的核酸可以包括图1至6列出的序列， 或者与图1至6的序列在核酸残基水平上至少60°/。、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%，例如98%或99%同源的序列。
"同源性"，如同本领域中已知的，是指两个或多个多肽序列，或是两个 或多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较所述的序列而确定。本领域中， 同源性还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，视情况可通过这些 序列的链之间的匹配来确定。同源性可以容易地计算而得出(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. ed.， Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I， Griffin, A.M., AND Griffin, H.G" eds" Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G" Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)。尽管存在许多的方法来tf量两个多核苦酸或两个多 肽序列之间的同源性，-f旦该术语对于本领域:忮术人员是7>知的(Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.， Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991;和Carillo， H.， and Lipman, D.， SI雄J. Applied Math., 48: 1073 (1988)。 通常用于测定序列之间同源性的方法包括，但不限于公开在Carillo: H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)中的方法。优选的 测定同源性的方法#皮*没计为，给出测试序列之间的最大匹配。测定同源性的 方法用计算机程序编辑成典。优选的测定两个序列之间同源性的计算机程序 方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux, J.等人,Nucleid Acids Research 12(1): 387 (1984》、BLASTP、 BLASTN和FASTA (Atschul, S.F.等人，J. Molec. Biol. 215: 403 (1990))。
编码本发明第一方面的抗原性多肽的核酸可以包括根据该第一个方面的 序列的片段，该片段至少具有30个碱基的长度，例如，具有40、 50、 60、 70、 80或90个》威基长度。
编码本发明第一方面的抗原性多肽的核酸可以是基因组DNA、 cDNA或 RNA，例如是mRNA。
本发明第 一方面的抗原性多肽可以是细胞膜蛋白，例如膜内在蛋白或胞 质蛋白。
优选地，本发明第一方面的抗原性多肽通过病原生物表达，病原生物例 如是细菌、病毒或酵母。该病原生物优选为细菌。该细菌可以是革兰氏阳性 或革兰氏阴性细菌，优选为革兰氏阳性细菌。
所述细菌可以选自
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、结核分枝 杆菌、B群链球菌、肺炎链球菌、幽门氏杆菌、淋病奈瑟氏球菌、A群链球
菌、伯氏疏螺:旋菌、粗J求3包子菌、组织月包浆菌属sa/ww/a^附^fetop/os附fl 犯/ww/a^m乂 B型脑月莫炎奈瑟氏球菌、弗氏志贺菌<^S7H'ge//ai/Ze;c"en'义大肠 杆菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、炭疽杆菌、Cc^"eZjacteWwm 却Aen'ae、破伤风杆菌、鼠类霉浆菌^A^cop/os,卿.J和梅毒螺旋体。 优选地，所述细菌为葡萄球菌属。更优选地，所述细菌是金黄色葡萄球菌。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明第一方面的抗原性多肽与在 此定义的生物感染致病性有关。
在本发明一个进一步优选的方面，所述抗原性多肽包括全部或部分的如 图7至12所示的氨基酸序列。
这里使用的"部分的"可以包括至少具有10、 15、 20或30个氨基酸长度 的多肽片段。
本发明第 一方面的抗原性多肽可以包括非蛋白抗原，例如一种多糖抗原。
用于此处的术语"多肽"概括地说是指，由氨基酸残基通过肽键连接在一 起的多个氨基酸残基。它与肽、蛋白、寡肽或低聚物可以互换使用并且含义 相同。所述术语"多肽"也意在包括多肽的片段、类似物和衍生物，其中所述 片段、类似物或衍生物基本上保留与参照蛋白相同的生物活性或功能。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种包括编码根据本发明第一方面 的多肽的核酸序列的载体。
本发明第二方面的载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。该载体可以包括转
录控制序列(启动子序列)，该序列介导细胞的特异性表达，例如，细胞特异 性的、诱导型或组成型的启动子序列。该载体可以是适合于原核或真核基因 表达的表达载体，例如，该载体可以包括一种或多种选择性标记和/或自主复 制序列，该自主复制序列能够促进所述载体在真核细胞或原核宿主中的维持 (Sambrook等人(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,冷泉港实 验室，CoW Spring Harbour, NY和其中的参考文献；Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994))。能够自主维持的载体被称为游离型载体。
启动子是所属领域中已知的术语，其可以包括增强子元件，该元件是顺 式作用的核酸序列，经常被发现于基因的转录起始位点的5，端(增强子也可 以在基因序列的3'端甚至是在内含子序列中找到，因此其是非位置依赖性
的)。增强子的活性应答于反式作用的转录因子(多肽)，该因子显示为特异性
地结合于增强子元件。所述转录因子的结合/活性(请参见Eukaryotic Transcription Factors, David S Latchman著，Academic Press Ltd, San Diego)应
答于许多环境因素，所述环境因素包括中间代产谢产物(例如葡萄糖、脂类)、 环境效应(例如光、热)。
启动子元件还包括通常所说的TATA盒与RNA聚合酶起始选择(RIS)序 列，该序列的功能是选择转录的起始位点。所述序列也结合功能性多肽，特 别是，该多肽可促进RNA聚合酶对转录起始位点的选择。
本发明第二方面的载体可以包括一种转录终止序列或多聚腺香酸化序 列。所述载体还可以包括内部核糖体进入位点(IRES)。该载体可以包括排 列于双顺反子或多顺反子表达盒中的核酸序列。
根据本发明的第三方面，本发明提供一种用于制备根据本发明任何前述 方面的重组抗原性多肽的方法，所述方法包括
(i) 提供用根据本发明第二方面的载体来转化/转染的细胞；
(ii) 使所述细胞在适合产生所述多肽的条件下生长；和
(iii) 从所述细胞或其生长环境中纯化所述多肽。 在第三方面方法的一个优选的方面，所述载体编码一种分泌信号来促进
所述多肽的纯化，从而所述的重组多肽具有所述分泌信号。
根据本发明的第四方面，本发明提供一种用根据本发明第二个方面的载
体来转化或转染的细胞或细胞系。
在本发明一个优选的实施方案中，所述细胞是原核细胞，例如，酵母或
细菌如大肠杆菌。或者，所述细胞是真核细胞，例如真菌细胞、昆虫细胞、
两栖动物细胞、哺乳动物细胞，例如COS细胞、CHO细胞、博韦黑素瘤(Bowes
Melanoma)细胞以及其它合适的人细胞，或植物细胞。
根据本发明的第五方面，本发明提供一种包括至少一个根据本发明第一
个方面的抗原性多肽或其部分的疫苗。所述疫苗优选进一步包括载体和/或佐剂。
这里使用的"其部分，，可以包括所述抗原性多肽的片段或其亚单位，其中 所述片段或亚单位足以在受者中诱发抗原性反应。
根据该第五方面的疫苗可以是亚单位疫苗，其中所述疫苗的免疫原性部 分是根据本发明第 一个方面的抗原性多肽的片段或其亚单位。
术语佐剂和载体以以下方式解释。某些多肽或肽抗原包含了 B细胞表位，
但未包含T细胞表位。通过在所述多肽/肽中包含T细胞表位或通过将所述
多肽/肽偶联到免疫原性载体蛋白上，可以大大增强免疫反应，该免疫原性载
体蛋白是例jo钥孑L虫戚血蓝蛋白(key hole limpet haemocyanin )或石皮伤风类 毒素，该免疫原性载体蛋白包含多个T细胞表位。所述偶耳关物被抗原呈递细 胞吸收，由人类白细胞抗原(HLA，s ) II类分子来加工和呈递的。其允许T细 胞帮助将T细胞特异性的载体衍生表位给予所述B细胞，该B细胞针对原 始的抗原性多肽/肽具有特异性。这可以导致抗体产生、分泌和同种型转换的 增力口。
佐剂是通过调节免疫细胞的活性来增强针对抗原的特异性免疫反应的物 质或方法。佐剂的例子包括，仅仅是举例，共刺激分子的对抗抗体、弗氏佐 剂、胞壁酰二肽、脂质体。因此，佐剂是免疫调节剂。载体是免疫原性分子， 当其与第二种分子结合时，会增强对后者的免疫反应。
本发明更进一步的方面提供一种用于对动物进行免疫从而抵抗病原微生 物的方法，所述方法包括给予所述动物至少 一种根据本发明第 一方面的多肽 或其部分。优选地，所述多肽是根据本发明第五方面的疫苗的形式。
本发明一种优选的方法中，所述动物是人。
优选地，本发明第一方面的抗原性多肽，或第五方面的疫苗，可以通过 静脉内、肌肉、皮下的直接注射而递送。更进一步地，所述疫苗或抗原性多 肽可以口服。所述多肽或疫苗可以在一种药学上可接受的载体中给药，所述 载体是例如各种水溶液和脂类介质，例如用于制备可肌肉和皮下注射给药的 无菌盐水。可以使用常规的悬浮剂和分散剂。其它的给药方式，例如才l7v物， 举例来说一种生物上可观察的持续小剂量释放型颗粒，对于本领域的技术人 员是显而易见的。
所述疫苗可以抵抗的细菌种属包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、 肺炎链球菌、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、炭疽芽孢杆菌、单核细 胞增生李斯特菌。
同样明显的是，所述疫苗或抗原性多肽可有效预防或减轻除人之外的动 物中的疾病。所述动物是例如但不限于家庭宠物(例如猫和狗这样的家养 动物)、家畜(例如牛、羊、猪)和马。
本发明一个进一步的方面提供一种包括有效量的至少一种本发明的多肽 或本发明的疫苗的药物组合物。这些多肽还可以包括药学上可接受的载体或 稀释剂。
根据本发明的一个进一步的方面，本发明提供一种抗体，或其至少一个 有效结合部分，该抗体或其有效结合部分结合至少一种根据本发明的抗原性 多肽或其部分。
由于抗体可以通过多种方式进行修饰，术语"抗体，，应理解为覆盖了任何
具有所要求的特异性的结合结构域的结合部分或物质，所要求的特异性是针 对所述抗原性多肽。因此，该术语覆盖了抗体片段、衍生物、功能等效物和 同源抗体，包括任何含有免疫球蛋白结合结构域的多肽，不论是天然的还是 完全或部分被合成的。因此，含有融合到另一个多肽上的免疫球蛋白结合结
构域或等效物的嵌合分子也被包括在内。EP-A-0120694和EP-A-0125023中
描述了嵌合抗体的克隆和表达。
在本发明的一个优选的方面，所述抗体是多克隆或单克隆抗体。 在本发明的一个进一步优选的方面，所述抗体是通过重组方法将所述抗
体的可变区与人抗体的不可变区或恒定区结合而制备的嵌合抗体。
在本发明的一个进一步优选的方面，通过重组方法将所述抗体人源化，
源于人抗体可变(V)区域的框架区结合。
优选地，将所述抗体提供为带有包括一种常规的标签或标记的标识物， 例如一种》丈射性和/或荧光和/或表位标签或标记。
优选地，将针对所述多肽的人源化单克隆抗体制备为融合多肽，所述融 合多肽存在于适合于原核或真核细胞转染或转化的表达载体中。
抗体，也称为免疫球蛋白，是对于外来分子(抗原)具有特异性的蛋白 分子。免疫球蛋白(Ig)是一类在结构上相关联的蛋白，其由两对多肽链组成， 一对轻(L)(低分子量)链(K或X)，和一对重(H)链(Y, a, m S和s),全部四条 链通过二硫键连接在一起。H和L链都具有帮助抗原结合的区域，并且在Ig 分子之间是高度可变的。另外，H和L链还包含不可变或恒定的区域。
L链由两个结构域组成。在给定类型的L链之间，其羧基末端结构域基 本上是相同的，被称为"恒定"(C)区。其氨基末端结构域在L链彼此之间 不同，形成所述抗体的结合位点。由于其可变性，它被称为"可变"(V)区。
Ig分子的H链具有若干种类，a、 |a、 (j、 a和y (其中又有若干亚类)。组 装后的Ig分子由两根相同的H和L链的一个或更多个单元组成，其名称源 自于其所具有的H链。因此，有五种Ig同种型IgA、 IgM、 IgD、 IgE和 IgG(基于H链的差异，又分为四个亚类，即，IgGl，IgG2,IgG3和IgG4 )。
有关抗体结构及其各种功能的进一步详细描述可见Using Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press。
嵌合抗体是重组抗体，其中全部小鼠或大鼠抗体的V-区域被结合到人抗
体的c-区。人源化抗体是重组杂交抗体，其将啮齿动物抗体v-区的互补决 定区与人抗体V-区的框架区融合。也使用来源于人抗体的c-区域。所述互
补决定区(CDRs)是同时存在于抗体的重链和轻链的N末端结构域中的区域， 该区域中V-区的大多数变化受到限制。这些区域在抗体分子的表面形成环状 物。这些环状物提供抗体和抗原之间的结合表面。
来源于非人动物的抗体会激发对于外源抗体的免疫反应，并使其排除在 循环之外。当将其注射到人受试者中时，嵌合抗体和人源化抗体均P争低了其 抗原性。这是因为在重组杂交抗体中存在降低量的啮齿动物(即，外源)抗体， 而人抗体的区域则不？ 1起免疫反应。这导致免疫反应的减弱和抗体清除的降 低。显然，这是在使用治疗性抗体来治疗人类疾病时所希望的。将人源化抗 体设计为具有更少的"外源，，抗体区域，因此认为其具有比嵌合抗体更低的免 疫原性。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述抗体是其活性通过补体 介导的抗体，例如，所述抗体的活性可以通过补体激活。
在本发明的另一个方面，提供一种载体，所述载体包括编码根据本发明 的人源化或嵌合抗体的核酸序列。
在本发明的一个进一步的方面，提供一种包括编码根据本发明的人源化 或嵌合抗体的载体的细胞或细胞系。所述细胞或细胞系可以用编码根据本发 明的人源化或嵌合抗体的载体转化或转染。
在本发明的一个进一步的方面，提供一种产生如前所述的单克隆抗体的 杂交瘤细胞系。
在本发明的一个进一步的方面，提供一种制备本发明单克隆抗体的方法， 所述方法^f吏用本发明的杂交瘤细胞系。
在本发明的一个进一步的方面，提供一种制备本发明的人源化或嵌合抗
体的方法，该方法包才舌
(i)提供用载体转化或转染的细胞，所述载体包括编码本发明的人源化或嵌
合抗体的核酸分子；
(ii)使所述细胞在适宜于产生所述抗体的条件下生长；和 从所述细胞或其生长环境中纯化所述抗体。
在本发明的一个进一步的方面，提供用于制备本发明的杂交瘤细胞系的
方法，所述方法包^^舌以下步骤
i) 使用免疫原对免疫活性的哺乳动物进行免疫，所述免疫原包括至少一个具
有如图7-12所示的氨基酸序列的多肽，或其片段；
ii) 将免疫后的免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞融合到骨髓瘤细胞上，从而形 成杂交瘤细胞；
iii) 筛选由步骤(ii)的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，所述抗体具有对(i)中的 氨基酸序列的结合活性； -
iv) 培养该杂交瘤细^^以增生和/或到分泌所述的单克隆抗体；和
v) 从所述培养物上清液中回收所述单克隆抗体。 所述免疫活性的哺乳动物可以是小鼠、大鼠或兔。
使用杂交瘤细胞来制备单克隆抗体是本领域中众所周知的。用于制备单 克隆抗体的方法由Kohler和Milstein公开于Nature 256, 495-497 (1975),同 时由 Donillard 和 Hoffman 公开于"Basic Facts about Hybridomas"， CompendiumofImmunologyV.il ， Schwartz编，1981, 上述文献引入本发明 作为参考。
在本发明的一个进一步的方面，提供根据本发明第一方面的抗原性多肽 在制备用于治疗或预防微生物感染或微生物相关障碍的药物中的用途。
优选地，所述孩i生物感染是细菌感染，所述细菌感染由细菌性病原体所
引起，该细菌性病原体是来源于选自如下的细菌菌种葡萄球菌菌属(spp)，
例如，金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌"tap/^/ococcwpyragewM 乂表皮 葡萄球菌；肠球菌属，例如粪肠球菌；李斯特氏菌属；假单胞菌属，分枝杆 菌属，例如结核分4支杆菌；肠杆菌属；弯曲杆菌属；沙门氏菌属；链球菌属， 例如A群或B群链球菌，肺炎链球菌；螺旋杆菌属，例如幽门氏螺旋杆菌； 奈瑟氏球菌属，例如淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌；伯氏疏螺旋体属； 志贺氏菌属，例如弗氏志贺菌；大肠杆菌属；嗜血杆菌属，例如流感嗜血杆 菌，衣原体属，例如沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鵡热衣原体；土^立弗朗西 斯菌(？>朋"'"//" m/awra^;杆菌属，例如炭疽杆菌；梭状芽孢杆菌属，例 如肉毒杆菌；耶尔森氏菌属，例如鼠疫耶尔森氏菌；梅毒菌属；伯克霍尔德 菌属，例如鼻疽伯克霍尔德菌和假鼻疽伯克霍尔德菌。
所述细菌相关障碍可以是金黄色葡萄球菌相关障碍。金黄色葡萄球菌相 关障碍可以包括，例如，败血症(septicaemia )、肺结核、细菌相关性食物中
毒、血液感染、劇莫炎、心内膜炎、骨髓炎、脓毒症(sepsis )、皮肤病，脑 膜炎、肺炎、胃溃疡、淋病；链球菌性喉炎(strepthroat)、链球菌相关中毒性 休克、坏死性筋膜炎(necrotizing fasciitis )、脓疱病、组织胞浆菌病、莱姆 病(Lyme disease)、胃肠炎、痢疾、志贺氏菌病。
在本发明的一个进一步的方面，提供根据本发明的抗体在制备用于治疗 微生物感染的药物中的用途。
在本发明的一个进一步的方面，提供治疗患者的方法，所述方法包括向 该患者给药予才艮据本发明第 一方面的抗原性多肽、根据本发明第五方面的疫 苗或根据本发明的抗体。
贯穿于权利要求书和说明书的表述始终，用词"包括"和"包含"以及上述用 词的变形，是指"包括但不限于"，并且不意在(也并没有)排除其它的部分、 添加剂、组分、完整物或步骤。
贯穿于权利要求书和说明书的表述始终，单数包括其复数形式，除非其 上下文有另外的要求。特别地，对于其中使用的不定冠词，在说明书中应被 理解为包括复数和单数，除非其上下文有另外的要求。
与本发明具体的方面、实施方案或实施例结合描述的特征、整体物、特 性、化合物、化学部分或基团应被理解为可应用于在此描述的任何其它方面、 实施方案或实施例，除非存在矛盾。
现在，仅仅是通过举例来描述本发明的实施方式，并以下面的材料、方 法和附图作为参考
附图的简要说明
图1显示来自于枯草芽孢杆菌的yphC多肽的DNA序列；
图2显示来自于枯草芽孢杆菌的ysxC多肽的DNA序列；
图3显示来自于枯草芽孢杆菌的ywlC多肽的DNA序列；
图4显示来自于金黄色葡萄球菌的yneS同源多肽731的DNA序列；
图5显示来自于金黄色葡萄球菌的yneS同源多肽733的DNA序列；
图6显示(a)编码推定暴露于膜外的gcp区域的DNA序列；和(b)gcp直向
同源多肽的DNA全序列，两种序列均来自于金黄色葡萄球菌； 图7-11显示分别对应于图1-5所示的DNA序列的氨基酸序列； 图12 (a)和(b)显示分别对应于图6 (a)和(b)所示的DNA序列的氨基
断列；
图13和14显示膜蛋白yneS和gcp的亲水性图。根据在服务器 http://bioinfo.si.hirosaki-u.ac.jp/~ConPred2/上携带的ConPredII方法，计算 上面所述的蛋白质亲水性图并且确定预测跨膜拓朴学模型的相应图示；
图15的图表表明对于来自于人患者的血清(口)、来源于非免疫的兔(O) 或来源于抗拟芥南亲环素蛋白产生的血清(厶)进行热处理，不导致金黄色葡 萄球菌SJF741的死亡。当使用来源于从金黄色葡萄球菌感染中康复病人的 天然血清(園)(A组)或使用来源于非免疫兔的血清(參)(B组)时，均未观 察到对金黄色葡萄球菌SJF741的杀灭。当抗拟芥南亲环素蛋白的(A)产生的 的天然血清(C组)、抗枯草芽孢杆菌蛋白Obg(T)与YdiB(+)的天然血清(D 组)和抗金黄色葡萄球菌SA1387 (令)的天然血清(E组)时，在最初的6小时内， 观察到金黄色葡萄球菌SJF741数目上的小幅减少，其随后被后续回收。
图16的图表表明抗枯草芽孢杆菌蛋白YsxC(參)、YphC (B)和YwlC (▲) 产生的天然血清(A组和B组)明显地杀死金黄色葡萄球菌SJF741，在2到 4小时之内有5 log的降低。当使用抗金黄色葡萄球菌肽YneS-731 (Y)和 YneS 733 ( )与金黄色葡萄球菌蛋白Gcp (+)产生的天然血清(C-E组)时， 也观察到类似的作用。相比之下，热处理抗枯草芽孢杆菌YsxC蛋白(O)或 金黄色葡萄球菌肽YneS-731 (▽)和YneS-733 (O)产生的血清(A、 C、D组)， 则丧失了这些血清的杀灭能力，如同上面所指出的，天然形式(未经热处理 过的)的所述血清是能够杀死金黄色葡萄球菌SJF741的。因此，所述血清 的杀灭能力是由于一种热不稳定组分，其在热处理的样品中被失活。在该图 中，没有显示使用热处理的抗枯草芽孢杆菌蛋白YphC (B)与YwlC (A)或抗 金黄色葡萄球菌gcp蛋白(+)产生的血清的实验，并且，使用其相应的天然 血清的实验(B和E组)，如同上所指出的，说明了所述血清对金黄色葡萄球 菌的杀灭能力。
实施例
材料和方法 菌林
用于进行目标基因序列的PCR扩增的染色体DNA是枯草芽孢杆菌枯草 亚属菌抹168("及sw6"fe s& MS 乂金黄色葡萄球菌NCTC 8325、
金黄色葡萄球菌N315和金黄色葡萄球菌COL (关于DNA序列的相关位置的
信息见表I ，)。用于试验的菌株是来源于金黄色葡萄球菌SH1000(金黄色 葡萄球菌SJF741 )的红霉素抗性的^W::/acZ转录融合衍生菌林(Horsburgh 等人，2002)。
表I
用作抗原的DNA序列、蛋白序列和肽序列
提到的所述基因和所述基因的蛋白序列可在以下出处找到
枯草芽孢杆菌枯草亚属菌林168 (及swto'fc swZ^/ . http:〃genolist.pasteur.fr/SubtiList/
http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/framik.cgi db=Genome&gi=27
金黄色葡萄球菌8325 (51. awm^S325,此为未有记录的序列；包含目的基因 的金黄色葡萄球菌的等价的有记录的序列可在以下出处找到) Iandolo等人，2002; Novick， 1967; University of Oklahoma Norman Campus, Advanced Center for GenomeTechnology
(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/framik.cgi db=Genome&gi=610)
其它金黄色葡萄球菌菌抹
金黄色葡萄球菌金黄色亚属菌林N315 (S. awre船rafep m^ews sfr. N315): Kuroda, 2001;
http://b-yahiko.bio.nite.go .jp/dogan/MicroTop GENOME—ID=n315G1 http:〃www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.spl database=ntsa01
金黄色葡萄;求菌金黄色亚属C(9丄f^rew s raz'M wfep. The Center for Genomic Research
http:〃www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/GenomePage3.spl database=gsa http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi id=93062
说明由于在所述序列内存在噬菌体插入物，不同金黄色葡萄球菌菌株 对于相同的基因具有不同的基因座名称。在本文中，用于金黄色葡萄球菌基
因的基因座名称对应于所述的金黄色葡萄球菌N315序列。
抗原制剂
将编码选自来源于枯草芽孢杆菌lM(Obg、 YdiB、 YphC(图1)、 YsxC(图 2)、 YwlC (图3),和金黄色葡萄球菌N315 (SA1387， Gcp/SA1854 (图6))蛋白 的基因进行PCR扩增。将得到的产物克隆到质粒pETBlue-l上，并且根据 制造商的说明，将所述基因在大肠杆菌TunerTM(DE3) pLacI感受态细胞 (Novagen )中过表达。所述过表达的蛋白是通过一种3个步骤的方案来纯化 的，所述方案是以阴离子交换、疏水和凝胶过滤色谱法为基础的。所述蛋白 的过表达水平通过SDS-PAGE确认，并且其具有平均90%的纯度。另外，将 在金黄色葡萄球菌N315蛋白SA1187(YneS隱731 (图4)和YneS-733 (图5)) 之中的选择肽段在一种Milligen 9050肽合成仪上合成，所述合成仪使F-moc 化学处理。激活F-moc氨基酸(Novobiochem/Merck)，然后立即在10%过量 摩尔量的HOBt的存在下，使用等摩尔量的HCTU或HBTU来进行偶合。 在两种情况下，半胱氨酸结合在所述肽段的C-末端上，从而使得其在 Fmoc-L-Cys(Trt)-PEG-PS树脂(Applied Biosystems)组装所述肽时，能够连接 到载体蛋白上。所述肽段是通过一种C18 Vydac柱(22x250 mm)使用乙腈梯 度在0.1%三氟乙酸(TFA)中纯化的。所述肽段通过质谱技术而被印证。将 所述的纯化肽段偶联到KLH(Sigma)(载体蛋白)上，从而提高所述半抗原在兔 中的免疫原性。偶联是在10xPBS中使用MBS(Sigma)而进行的。
血清
血清获得自谢菲尔德大学的抗体资源中心(Antibody Resource Center at the University of She伍eld)，其具体来源于i)抗来自枯草芽孢杆菌(Obg, YdiB, YphC, YwlC与YsxC )和金黄色葡萄球菌(Gcp, SA1387)的蛋白的免疫 兔；ii )抗KLH轭合的选自金黄色葡萄球菌蛋白SA1187的蛋白(YneS-731, YneS-733)的免疫兔；iii)抗来自于拟南芥的胞质蛋白的KLH偶联肽的免疫 兔；iv)天然(非免疫性的)兔血清；和，v)来自感染金黄色葡萄球菌的康复病 人的人血清。
如下所述进行免疫过程。将每一份兔的200-500吗的抗原(于250^1的最 大体积磷酸盐緩沖液盐水，PBS中)与相同体积的弗氏完全佐剂(complete Freund，s adjuvant )混合。将所述溶液通过23G的针状物过滤，直至形成静置 不分离的乳剂。以500(xl的最大体积对于每只兔进行皮下接种。在第22、 43 和64天重复所述注射操作，但使用弗氏不完全佐剂(incomplete Freund，s
adjuvant )。在第53天和第64天后收集血样。注射的日期在3到6星期之内 是可以弹性变化的。当在被测试的血清中确定了适宜的滴度时，在渗血后10 天可以计划最后的加强。
将血清冷冻储存，融冻并通过0.2微米孔径的过滤器(Minisart High Flow, Sartorius )过滤，然后立即用于杀灭实-险。
通过蛋白质印迹分析(westem blot analysis,数据未显示)，表明抗枯草芽 孢杆菌YdiB的抗体会识别在金黄色葡萄球菌YdiB同源物中的对应尺寸的 带，提示了这些抗体的物种交叉反应性。
介质和生长条件
为了制备用于所述血清实验的接种物，使金黄色葡萄球菌SJF741于37°C 下在脑心浸液介质(Bffl; Oxoid)中生长，并补充红霉素(Sigma)直至最终浓度 为5吗/毫升(BHI-Ery)。
所述接种物的制备
使来自于实验室冷冻贮存的金黄色葡萄球菌SJF741的单个菌落在 BHI-Ery平板上新鲜生长，并将其接种到30毫升包含5毫升的BHI-Ery的通 用介质中，并且于37 °C下在定轨摇床(250 rpm)中孵化过夜(孵化时间为12 到16小时)。制备所得培养物在磷酸盐盐水緩冲液(PBS)中的10倍稀释液， 然后立即接种到血清中。
血清实验
将来自不同血清的20(Hil等分样品置于1.5毫升微离心管中，接种到以 PBS稀释的金黄色葡萄球菌SJF741中(参见所述接种物的制备)，至最终的细 胞密度为lxl()S到lxl(^个细胞/毫升，然后于37。C下，在旋转振荡器中孵
化。周期性地从这些血清培养物中取10h1样彔系列稀释^r^、且从涂覆在
BHI-Ery平板上的每一稀释液中取10pl样品，随后于37。C下孵化过夜。此 外，另 一个来自于每个血清培养物的lO(il样品直接涂覆在Bffl-Ery平板上。 仅仅计数1到40个菌落的稀释液并且测定其每毫升中的活细胞数(菌落形成 单位，CFU)。
结果
为了评价所述各种血清的葡萄球菌杀灭能力，以所述各种兔抗血清攻击
金黄色葡萄球菌并评价其存活时间。结果表明，与包含抗Gcp和YneS以及 其它表面蛋白的抗体的血清(图16)接触，能在2到3小时内显著地杀灭金黄 色葡萄球菌。与此相对应地，抗来源于枯草芽孢杆菌胞质蛋白(Obg和YdiB) 的抗体、来源于拟南齐(亲环素)的膜蛋白以及各种正常的家兔血清则不显示 细菌杀灭的表现型(图15)。非常明显地，来源于免疫兔的抗来自于枯草芽孢 杆菌其它推测的胞质蛋白(YsxC和YphC和YwlC)的血清也显示出一种类 似于在Gcp和YneS (731和733)抗体中观察到的杀灭表现型。这是意想不到 的，因为YsxC、 YphC和YwlC是推测的胞质蛋白，所以上述蛋白并不暴露 于表面，因此不会预见到所述抗血清能够识别它们。
这一工作提示YsxC位于金黄色葡萄球菌的膜部分。这一工作已经更进一 步地证明，所述杀灭作用是通过存在于血清中的热不稳定成分(经热处理而 失活，参见材料和方法)来介导的，可能对应于所述补体(图16 )中的一些成 参考文献
Horsburgh et al"丄Bacteriol. 184(9):5457-67 (2002) Iandolo et al.， Gene 289 109-118 (2002). Ikeda et al.， In Silico Biol" 2, 19-33 (2002). Ikeda et al" Nucleic Acids Res" 31, 406-409 (2003). Karavolos et la., Microbiology Oct; 149(Pt 10):2749-58 (2003). Kobayashi et al., Mol Microbiol. Sep;41(5): 1037-51 (2001). Kobayashi et al.Proc Natl Acad Sci U S A.100(8):4678画83 (2003). Kunst et al.， Nature Nov 20;390(6657):249-56 (1997). Kuroda, M.， et al. Lancet. 357:1225-1240 (2001).
Lao and Shimizu In Valafar， F. (ed.), Proceedings of the 2001 International Conference on Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences (METMBS，Ol), CSREA Press, USA, pp. 119-125 (2001). Lao et al" Bioinformatics, 18, 562-566 (2002).
Lao， D. M., Ok,， T. and Shimizu, T. 2002. In Silico Biol" 2, 485-494. Moszer I, Jones LM, Moreira S, Fabry C, Danchin A.2002. Nucleic Acids Res. 30(1):62画5.
Novick, R. R 1967 Virology 33:155-156
Xia， J,X., Ikeda， M. and Shimizu, T. 2004 Comput. Biol. Chem., 28, 51-60. Zalacain M， et al. 2003. J Mol Microbiol Biotechnol. 6(2): 109-2权利要求
1、一种用作药物的抗原性多肽，或该多肽的部分，其通过分离的核酸序列编码，所述分离的核酸序列选自i)如图1到6所示的核酸序列；ii)(i)中的核酸序列，其编码通过病原生物表达的多肽；iii)杂交到上述(i)或(ii)中定义的序列上的核酸序列；和iv)由于(i)、(ii)或(iii)中定义的核酸序列的遗传密码而简并的核酸序列。
2、 按照权利要求1所述的抗原性多肽，其中所述药物是一种疫苗。
3、 按照权利要求1所述的抗原性多肽，其中编码所述抗原性多肽的核酸在 严谨杂交条件下退火为图1至6中所示的核酸序列或退火为其互补链。
4、 按照权利要求1所述的抗原性多肽，其中所述抗原性多肽通过病原生物 来表达。
5、 按照权利要求4所述的抗原性多肽，其中所述病原生物是细菌。
6、 按照权利要求5所述的抗原性多肽，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。
7、 按照权利要求5所述的抗原性多肽，其中所述细菌选自枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、结核分枝杆菌、B群链球菌、 肺炎链球菌、幽门氏杆菌、淋病奈瑟氏球菌、A群链球菌、伯氏疏螺旋菌、 4且J求孑包子菌、纟且织月包浆菌属sa;ww/a似m fi/Jsto/ /oswa 义B型月亩月莫 炎奈瑟氏球菌、弗氏志贺菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯 特菌、炭疽杆菌、Co ^"ek^en'ww fi^Aen'ae、石皮伤风杆菌、鼠类霉浆菌和 梅毒螺旋体。
8、 按照权利要求5所述的抗原性多肽，其中所述细菌是葡萄球菌属细菌。
9、 按照权利要求8所述的抗原性多肽，其中所述细菌是金黄色葡萄球菌。
10、 按照权利要求1所述的抗原性多肽，其中所述抗原性多肽包括全部或部 分的如图7至12所示的氨基酸序列。
11、 一种载体，所述载体包括一种编码权利要求1所述的抗原性多肽的核酸 序列。
12、 一种用于制备权利要求1所述的重组抗原性多肽的方法，所述方法包括(i) 提供用根据权利要求11的载体转化/转染的细胞；(ii) 使所述细胞在适合产生所述多肽的条件下生长；和 (iii)从所述细胞或其生长的环境中纯化所述多肽。
13、 一种使用根据权利要求11的载体转化/转染的细胞或细胞系。
14、 一种包括至少一种权利要求1所述的抗原性多肽或其部分的疫苗。
15、 权利要求14所述的疫苗，其中所述疫苗进一步包括载体和/或佐剂。
16、 权利要求15所述的疫苗，其中所述疫苗是亚单位疫苗，所述疫苗的免 疫原性部分是根据权利要求1的抗原性多肽的片段或亚单位。
17、 一种用于抵抗病原微生物的免疫动物的方法，所述方法包括给予所述动 物至少一种根据权利要求1的抗原性多肽或其部分。
18、 权利要求17所述的方法，其中所述多肽是根据权利要求14的疫苗的形 式。
19、 一种药物组合物，所述药物组合物包括有效量的至少一种权利要求1所 述的抗原性多肽或权利要求14所述的疫苗，以及药学上可接受的载体或稀 释剂。
20、 一种抗体，或其至少一个有效的结合部分，该抗体或其有效的结合部分 结合至少一种根据权利要求1的抗原性多肽或其部分。
21、 权利要求20所述的抗体，其中所述抗体是多克隆或单克隆抗体。
22、 权利要求20所述的抗体，其中所述抗体是通过重组方法将所述抗体的 可变区与人抗体的不可变区或恒定区结合而制备的嵌合抗体。
23、 权利要求20所述的抗体，其中所述抗体是通过重组方法将所述抗体人域和来源于人抗体可变(V)区域的框架区均结合。
24、 一种载体，所述载体包括编码权利要求22的嵌合抗体或权利要求23的 人源化抗体的核酸序列。
25、 一种使用权利要求24的载体转化或转染的细胞或细胞系。
26、 一种制备人源化抗体或嵌合抗体的方法，所述方法包括i) 提供用权利要求24的载体转化或转染的细胞；ii) 使所述细胞在适宜于产生所述抗体的条件下生长；和 从所述细胞或其生长环境中纯化所述抗体。
27、 一种用于制备杂交瘤细胞系的方法，所述方法包括以下步骤i) 使用免疫原对免疫活性的哺乳动物进行免疫，所述免疫原包括至少一个具 有如图7-12所示的氨基酸序列的多肽，或其片段；ii) 将免疫后的免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞融合到骨髓瘤细胞上，从而形 成杂交瘤细胞；iii) 筛选由步骤(ii )的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，所述抗体具有对(i)中的 氨基酸序列的结合活性；iv) 培养该杂交瘤细胞，以增生和/或分泌所述的单克隆抗体；和v) 从所述培养物上清液中回收所述单克隆抗体。
28、 权利要求1所述的抗原性多肽在制备用于治疗或预防微生物感染或微生 物相关障碍的药物中的用途。
29、 权利要求28所述的用途，其中所述微生物感染是细菌感染，所述细菌 感染由细菌性病原体所引起，该细菌性病原体是来源于选自如下的细菌菌 种葡萄球菌菌属，例如，金黄色葡萄球菌、化脓性葡萄球菌"to/ /ococcws表皮葡萄球菌；肠球菌属，例如粪肠球菌；李斯特氏菌属；假 单胞菌属，分枝杆菌属，例如结核分枝杆菌；肠杆菌属；弯曲杆菌属；沙门 氏菌属；链球菌属，例如A群或B群链球菌，肺炎链球菌；螺旋杆菌属， 例如幽门氏螺旋杆菌；奈瑟氏球菌属，例如淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏 球菌；伯氏疏螺旋体属；志贺氏菌属，例如弗氏志贺菌；大肠杆菌属；嗜血 杆菌属，例如流感嗜血杆菌；衣原体属，例如沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦 鹉热衣原体；土拉弗朗西斯菌(7>"""'化//" fw/a/^MW;杆菌属，例如炭疽杆 菌；梭状芽孢杆菌属，例如肉毒杆菌；耶尔森氏菌属，例如鼠疫耶尔森氏菌； 梅毒菌属；伯克霍尔德菌属，例如鼻疽伯克霍尔德菌和假鼻疽伯克霍尔德菌。
30、 权利要求28所述的用途，其中所述微生物相关障碍是金黄色葡萄球菌 相关障碍，所述金黄色葡萄球菌相关障碍选自败血症(septicaemia)、肺结 核、细菌相关性食物中毒、血液感染、腹膜炎、心内膜炎、骨髓炎、脓毒症(sepsis )、皮肤病、脑膜炎、肺炎、胃溃疡、淋病、链球菌性喉炎(strep throat).、 链球菌相关中毒性休克、坏死性筋膜炎(necrotizing fasciitis )、脓疱病、组 织胞浆菌病、莱姆病(Lymedisease)、胃肠炎、痢疾、志贺氏菌病。
31、 权利要求20的抗体在制备用于治疗微生物感染的药物中的用途。
32、 一种治疗患者的方法，所述方法包括向该患者给予权利要求1的抗原性 多肽、权利要求14的疫苗或权利要求20的抗体。
全文摘要
本发明涉及通过病原微生物表达的抗原性多肽、包括所述多肽的疫苗、针对所述多肽的治疗性抗体和制备所述多肽、疫苗和抗体的方法。
文档编号A61K38/00GK101184502SQ200680009568
公开日2008年5月21日 申请日期2006年3月8日 优先权日2005年3月23日
发明者J·加西亚-拉腊, S·J·福斯特 申请人:阿布辛西生物有限公司