专利名称：：hFSH水制剂的制作方法hFSH水制剂发明领域本产品是一种人卵泡刺激素(hFSH)的水制剂，所述hFSH被稳定以维持hFSH活性延长的时间段。更具体地，本发明涉及一种hFSH水制剂，包含稳定在含有甘氨酸、非离子表面活性剂和蛋氨酸的磷酸盐缓冲液中的治疗有效量的hFSH。发明背景,人卵泡刺激素(hFSH)是一种生育相关激素，它与促黄体生成素(LH)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)—起对生育功能起主要作用。结构上，hFSH是a和e-亚基非共价结合形成的异二聚体糖蛋白，ci-亚基由92个氨基酸残基组成，而3-亚基由lll个氨基酸残基组成，每个亚基有两个Asn-连接的糖基化位点(HumanReproductionUpdate1998,Vol4，No.6pp862-881)。直到1980年代，hFSH的主要来源是从育龄妇女的尿液中提取的尿液衍生FSH。1990年代引入了高纯度的尿液衍生FSH的进一步纯化形式，最后，从1998年以来，开发了重组FSH并广泛应用。FSH由垂体腺分泌。FSH刺激女性卵泡的发育和成熟。因此，FSH是负责女性排卵的关键激素，并用于无排卵性不育妇女的不育治疗以及人工受精中的吸卵/取卵(OPU)。总的来说，蛋白质的半衰期很短，并在暴露于各种因素例如不利于表达蛋白活性的温度、水-空气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂和微生物污染后，产生变性，例如单体聚集、二聚体解离、和吸附在血管壁上。因此，变性的蛋白丧失了固有的物理化学性质和生理活性作用。蛋白的变性是不可逆的，因此，蛋白一旦变性，它们的天然性质几乎不能恢复到初始状态。具体来说，具有两个不同亚基组成的异二聚体结构并且每次给药小于数百微克的微量的蛋白，例如hFSH，遭到的问题与蛋白的较高损失有关，包括由于二聚体在水溶液中解离和蛋白对血管内表面的吸附引起的蛋白的损失。解离的蛋白丧失了它们本身的生理活性，并且解离后的单体容易发生聚集。此外，吸附于血管内皮表面上的蛋白也通过变性过程而容易凝聚。当它们给入人体时，这样的变性蛋白可能起到引起形成对抗体内天然存在的蛋白的抗体的作用。因此，目标蛋白应当以充分稳定的状态给药。为此，对开发预防溶液中蛋白变性的方法，已经进行了大量的研究。一些蛋白药物通过冻干(冷冻-干燥)已经克服了稳定性的问题。例如，美国专利No.5270057公开了一种冻干制剂，其包括用聚羧酸或其盐、优选柠檬酸和非还原的二糖--蔗糖来稳定的促性腺激素(如LH，TSH，FSH和hCG)。美国专利No.56503卯公开了一种冻干制剂，包括借助于蔗糖和甘氨酸的组合稳定的FSH、LH或hCG。然而，冻干产品并不方便，因为它们在使用前必须在注射用水中溶解重构。另外，冻干产品的生产过程包括冷冻-干燥步骤，因此所患的是需要巨大的投资，例如使用大型冻干机。作为处理这些局限的替代方法，可以通过向溶液态的蛋白添加稳定剂来改善蛋白的稳定性。有用的蛋白稳定剂的例子，已知有表面活性剂、血清白蛋白、多糖、氨基酸、多聚体、盐类等(JohnGeigert,J.ParenteralSci.Tech.,43,No5,220-224,1989;DavidWong,Pharm.Tech.October,34-48,1997;andWeiWang，Int.J.Pharm.，185，129-188,1999)。然而，考虑到个体蛋白的独特生化性质，应当选择并使用最为合适的稳定剂，而联合使用不同的蛋白稳定剂则由于个体稳定剂之间的竞争作用和不利反应，可能带来与预期作用相反的不利副作用。另外，成功稳定溶液中存在的蛋白需要仔细的注意力和许多工作，因为个体蛋白稳定剂对稳定相应蛋白具有有利的特定浓度范围(WeiWang,Int.J.Pharm.185,129-188，1999)。同时，美国专利No.5929028公开了一种稳定的促性腺激素液体制剂，其通过将促性腺激素(如LH，TSH，FSH和hCG)溶解于由稳定量的多羧酸或其盐、稳定量的硫醚化合物、非还原糖和非离子表面活性剂构成的溶液中而制备。根据该技术，其中柠檬酸钠被描述为是最优选的聚羧酸或其盐的形式，并且该制剂含有1.47%的拧檬酸钠。1%的柠檬枸橼酸水溶液表现出pH2.2的强酸性(Handbookofpharmaceuticalexcipients2ndedition(药物赋形剂手册第二版)，pl24)。本领域公知的是柠檬酸或其盐在其注射时是一种引起给药部位剧烈疼痛的赋形剂。为了患者方便，限制本领域技术人员用柠檬酸或其盐。美国专利No.5929028描述的该技术则遭遇了患者不便的问题，因为药物制剂中包含1.47%柠檬酸钠，引起了给药部位疼痛。美国专利No.6706681公开了一种液体药物组合物，其包括用含有多元醇或非还原糖、优选甘露醇作为稳定剂的磷酸盐缓冲液(pH7.0)稳定的hCG。该技术的适用性被限制于每次使用超过10，000IU高剂量的hCG液体制剂，并且对于以75至250IU作为日剂量使用的FSH液体制剂没有进行试验。从上述现有技术可以看出，目前急需开发新型液体制剂，其能稳定地维持hFSH活性延长的时间段。发明概述因此，鉴于上述问题做出了本发明，本发明的目的是提供一种人卵泡雌激素(hFSH)的水制剂，所述hFSH被稳定以维持hFSH活性延长的时间段。具体实施方式下面详细介绍本发明。根据本发明的一个方面，上述和其它目的能够通过提供人卵泡雌激素(hFSH)的水制剂实现，包括治疗有效剂量的hFSH、以及甘氨酸、蛋氨酸、非离子表面活性剂和磷酸盐缓冲液作为稳定剂。艮卩，根据本产品的制剂，hFSH在含有甘氨酸、蛋氨酸和非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液中得到稳定，使得hFSH的活性维持延长的时间段。作为hFSH的来源，本发明的水制剂可以使用体内天然存在的hFSH，或使用重组技术从动物细胞中表达、分离和纯化的重组FSH(rFSH)。因此，能够用于本发明的hFSH包括所有种类的hFSH，包括天然和合成的类型。本发明的水制剂包括甘氨酸作为稳定剂的成分。溶液态的甘氨酸能够在hFSH周围聚集大量水分子，从而在构成hFSH的众多氨基酸中，进一步稳定最外层的亲水性氨基酸，并由此稳定hFSH(Wang,Int.J.Pharm.185(1999)129-188)。甘氨酸的含量为0.01~50%(w/v)，优选0.1~10%(w/v)，最优选1~5%(w/v)。本发明的制剂包括蛋氨酸作为稳定剂的另一个成分。蛋氨酸通过防止水制剂中hFSH的氧化而起到稳定hFSH的作用(Wang,Int.J.Pharm.185(1999)129-188)。蛋氨酸的含量为0.001~2%(w/v)，优选0.01~1%(w/v),最优选0.05~0.5%(w/v)。本发明的制剂还包括非离子表面活性剂，通过令hFSH稳定以防止其吸附于血管表面。在此，非离子表面活性剂降低了蛋白溶液的表面张力，从而阻止了蛋白对疏水表面的吸附和聚集。能够用于本发明的非离子表面活性剂的优选实例包括基于聚山梨醇酯的非离子表面活性剂和基于泊洛沙姆的非离子表面活性剂。这些非离子表面活性剂可单独或以其任何组合使用。尤其更优选基于聚山梨醇酯的非离子表面活性剂。基于聚山梨醇酯的非离子表面活性剂的具体实例可以包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。更为特别优选的是聚山梨醇酯20。聚山梨醇酯20具有相对低的临界胶束浓度。因此，聚山梨醇酯20不仅在甚至很低的浓度下即可减少或防止蛋白的表面吸附，而且还抑制蛋白的化学降解。水制剂使用高浓度的非离子表面活性剂是不当的。这是因为使用高浓度的非离子表面活性剂导致干扰作用，从而当釆用例如紫外线分光光度法或是等电点聚焦法的分析方法进行蛋白的浓度测定或稳定性评价时，使得难以准确评价蛋白的稳定性。因此，本发明的水制剂含有低浓度的非离子表面活性剂，低于0.1%(w/v)，更优选0.001~0.02%(w/v)。本发明的水制剂含有磷酸盐缓冲液。构成缓冲溶液的磷酸盐浓度优选为lmM~50mM，更优选5mM~10mM。缓冲溶液的pH范围优选为6.0~8.0，更优选6.57.5。除了上面列举的甘氨酸、蛋氨酸、非离子表面活性剂和磷酸盐缓冲液，本发明的制剂还可任选包含本领域已知的其它成分或材料，只要它们无损于本发明所需的效果。例如，制剂可进一步任选包含常规用作蛋白药物防腐剂的苯甲醇、甲酚、对羟基苯甲酸垸基酯等。适当的情况下，本制剂还可以包含等张剂。等张剂的具体例子可包括如氯化钠和氯化钙的水溶性无机盐，以及如甘露醇、山梨醇、乳糖、甘露糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、棉籽糖、蔗糖的糖醇。这些材料可单独或以其组合使用。实施例现在，将参照下面的实施例更加详细地介绍本发明。这些实施例仅用于说明本发明，不应解释为限制本发明的范围和实质。实施例1-3:制备hFSH水制剂将甘氨酸、蛋氨酸和聚山梨醇酯20加入lOmM的磷酸盐溶液中，然后加入hFSH至浓度为150IU/mL，从而制备hFSH的水制剂。这样制备的溶液以lmL/瓶等份放入3mL玻璃瓶中，然后密封并分别存放于4'C和25°C。相应实施例中制备的水制剂的组成配方在表1中表示。比较例l:制备无添加剂的hFSH水制剂向lOmM的磷酸盐溶液中加入hFSH，浓度为150IU/mL。这样制备的溶液以lmL/瓶等份放入3mL玻璃瓶中，然后密封并分别存放于4。C和25。C。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*单位mg/mL试验例l:hFSH水制剂的稳定性测试实施例1-3和比较例1的水制剂在4'C存放0、3和6个月和在25'C存放0、2、4禾卩6个月之后，分别在相应的时间点通过SEC-HPLC测定hFSH的回收率、和hFSH解离成单体的。/。和hFSH的纯度，并通过RP-HPLC测定hFSH的a亚基氧化％。所得结果分别在下表2-表5中给出。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*:以零时间为基准**m:月[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*m:月[表4:]<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*m:月从表2可见，实施例1到3的制剂在制剂于4'C和25'C下存放6个月之后，表现出95。/。以上的hFSH回收率，而比较例1的制剂在相同条件下，表现出回收率％低(约60%)。另外，从表3可以看出，在上述条件下，实施例1到3的制剂在在制剂于4'C和25'C下存放6个月之后，表现出不到5%的hFSH解离为单体，而比较例1的制剂在相同条件下，表现出hFSH解离为单体的。/。明显增加(超过10%)。另外，从表4的数据可见，实施例1到3的制剂在制剂于4'C和25'C下存放6个月之后，表现出95y。以上的hFSH纯度，而比较例l的制剂在相同条件下，表现出hFSH的纯度降低(降到80%-范围)。由这些结果可见，根据本发明包含了甘氨酸、蛋氨酸和聚山梨醇酯20的hFSH水制剂防止了由于蛋白吸附在血管内皮表面上而导致的蛋白损失和变性，并防止了蛋白解离成组成单体，以及使hFSH稳定延长的时间段。[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表5可见，实施例1到3的制剂在制剂于4°C和25'C下存放6个月之后，表现出接近8^-范围的a亚基氧化率，而比较例l，即无添加剂的制剂在制剂于25'C下存放6个月之后，表现出高％的a亚基氧化率(约15%)。从这些结果可见，根据本发明加入了甘氨酸、蛋氨酸和聚山梨醇酯20的水制剂是稳定的水制剂，防止了hFSH长时间储存而可能发生的hFSH氧化。实施例4和5:制备高浓度hFSH水制剂向10mM的磷酸盐溶液(pH7.0)中加入甘氨酸、蛋氨酸、聚山梨醇酯20、苯甲醇、氯化钠和乳糖，然后加入hFSH配成浓度为833IU/mL，从而制备hFSH的水制剂。这样制备的溶液以0.5mL/注射器注入lmL预充式玻璃注射器(Becton-Dickinson)中，然后于25"储存。这样制备的水制剂的组成配方在下表6表示。比较例2-4:制备高浓度hFSH水制剂向10mM的磷酸盐溶液(pH7.0)中加入甘氨酸、聚山梨醇酯20和苯甲醇，然后任选加入氯化钠或乳糖，而不添加蛋氨酸，从而制备hFSH的水制剂。这样制备的溶液以0.5mL/注射器注入lmL预充式玻璃注射器(Becton-Dickinson)中，然后于25'C储存。这样制备的水制剂的组成配方在下表6表示。[表6]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*单位mg/mL试验例例2:高浓度hFSH水制剂的稳定性测试实施例4和5以及比较例2至4的水制剂在25'C下存放0、2、4和6个月后，分别在相应的时间点用SEC-HPLC测定hFSH的纯度。/。，并用RP-HPLC测定hFSH的a亚基氧化率％。这样得到的结果分别在下表7给出。表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表7可见，包括甘氨酸、苯甲醇和聚山梨醇酯20作为稳定剂成分的实施例4和5直到在室温(25°C)下存放6个月后，经SEC-HPLC测定显示出hFSH的纯度仍在90%以上，以及用RP-HPLC测得的a亚基氧化率低于10%，由此说明这些制剂是hFSH稳定的制剂。另外，加入苯甲醇作为防腐剂对hFSH的稳定性没有显著作用。虽然，比较例2至4的制剂表现出超过卯％的出色纯度，但是a亚基氧化率。/。却高，明显超过10%，从而表明这些制剂不稳定。工业实用性从以上介绍可以明显看出，本发明的水制剂可以稳定地维持人卵泡刺激素(hFSH)活性延长的时间段。虽然为了说明的目的公开了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将体会到，在不背离所附权利要求公开的本发明的范围和实质的情况下，进行各种修改、添加和替换是可能的。权利要求1.一种人卵泡刺激素(hFSH)的水制剂，包括治疗有效量的hFSH，以及甘氨酸、蛋氨酸、非离子表面活性剂和磷酸盐缓冲液作为稳定剂。2.权利要求1的制剂，其中hFSH是天然存在的hFSH和重组FSH(rFSH)。3.权利要求l的制剂，其中非离子表面活性剂选自基于聚山梨醇酯的非离子表面活性剂、基于泊洛沙姆的非离子表面活性剂、和其任何组合。4.权利要求3的制剂，其中非离子表面活性剂为聚山梨醇酯20。5.权利要求l的制剂，其中甘氨酸的含量为0.1~10%(w/v)。6.权利要求l的制剂，其中蛋氨酸的含量为0.01~2.0%(w/v)。7.权利要求1的制剂，其中非离子表面活性剂的含量为0.001~0.02%(w/v)。8.权利要求1的制剂，其中磷酸盐缓冲液的盐浓度为lmM50mM，pH为6.57.5。9.权利要求1的制剂，其中所述制剂进一步包括防腐剂和/或等张剂。10.权利要求9的制剂，其中防腐剂为苯甲醇、甲酚、对羟基苯甲酸烷基酯或其混合物，而等张剂为水溶性无机盐和/或糖醇。全文摘要本发明提供一种人卵泡刺激素(hFSH)的水制剂，所述hFSH被稳定以维持hFSH活性延长的时间段。本发明的制剂是水制剂，包含治疗有效量的hFSH，所述hFSH在含有甘氨酸、蛋氨酸和非离子表面活性剂(优选聚山梨醇酯20)的磷酸盐缓冲液中得以稳定，所述制剂能够维持hFSH活性延长的时间段。文档编号A61K9/08GK101272764SQ200680035583公开日2008年9月24日申请日期2006年9月25日优先权日2005年9月27日发明者崔淑荣,齐勋升申请人:株式会社Lg生命科学