专利名称：作为fgf抑制剂的嘧啶基芳基脲衍生物的制作方法
作为FGF抑制剂的嘧咬基芳基脲衍生物发明概述本发明涉及新的化合物、制剂、方法和用途。具体地，本发明涉及新 的杂芳基芳基脲类化合物，和/或使用可以被定义为杂芳基芳基脲类化合物 的化合物在治疗蛋白激SI^赖性疾病中的用途或方法，或在制备治疗蛋白 激S^l赖性疾病的药物制剂中的用途或方法。本发明还涉及使用这类化合 物治疗所述疾病的方法、包含杂芳基芳基脲类化合物的药物制剂以及制备 所述的新杂芳基芳基脲类化合物的方法。本发明涉及如下所公开的其他主 题。技术背景蛋白激酶(PK)是催化细胞蛋白质中特定的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残 基磷酸化的酶。这些底物蛋白质的翻译后修饰充当了调控细胞增殖、活化 和/或分化的分子开关。在许多疾病阶段、包括良性和恶性增殖病症中，已 经观察到了异常或过度的PK活性。通过利用PK抑制剂，已经可以在许 多情况下体外和体内治疗疾病，例如增生性病症。这些激酶大致分为两类，特异性磷酸化丝氨酸和苏氨酸的激酶以及特 异性磷酸化酪氨酸的激酶。此外， 一些称为"双特异性"的激酶能够磷酸化 酪氨酸和丝氨l苏氨酸残基。蛋白激酶还可以通过其在细胞内的位置来进行表征。 一些激酶是能够 连接细胞外配基的跨膜受体蛋白质。与配基的连接改变了受体蛋白激酶的 催化活性。其他激酶是没有跨膜结构域的非受体蛋白质，其他另一些激酶 是具有位于跨膜蛋白质细胞外部分的催化结构域的外激酶或者是作为可溶 性细胞外蛋白质分泌的外激酶。许多激酶涉及调控性级联反应，其中它们的底物可以包含活性通过其磷酸化状态进"f亍调节的其他激酶。因此，下游区效应子的活性通过由通道 激活所引致的磷酸化来进行调控。受体蛋白酪氨酸激酶(RPTK)是跨膜受体的一个亚类，其具有内在 的配体刺激的酪氨酸激酶活性。RPTK活性受到严密的控制。当其突变或 结构改变时，RPTK可以变成有效的癌蛋白，造成细胞转化或至少是失控。 大体而言，对于所有涉及癌症的RPTK来说，致癌性的失控源于一种或多 种确保催化结构域正常抑制的自动控制机制的解除或混乱。数次发现超过 一半的已知RPTK的人类恶性肿瘤(包括一些歉^L病例；Blume-Jensen等 人，；Va似"411: 355-365(2001))相关的突变或^^达形式。RPTK的超表达通过增加二聚体浓度导致组成型激酶活化。例如 Neu/ErbB2和表皮生长因子受体(EGFR)，其通常在乳腺癌和肺癌中增加， 以及骨骼疾病和增生性病症相关的成纤维细胞生长因子(Blume-Jensen等 人，2001).血管发生是一种从现有血管形成新毛细血管的机制。在需要时，血管 系统有能力产生新的毛细血管网络，以维持组织和器官的正常功能。但是， 在成人中血管发生受到适当的限制，仅在伤口愈合和月经期间子宫内膜的 新血管形成中才出现。参见Merenmies等人，Cell Growth & Differentiation, 8,3-10(1997)。另一方面，不期望的血管生成是一些疾病如视网膜病变、银 屑病、类风湿性关节炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)和癌症(实体瘤)的标 志。Folkman， Nature Med.， 1,27-31(1995)。已经表明参与血管发生过程的 蛋白激酶包括生长因子受体酪氨酸激酶家族的三个成员VEGF-R2(血管 内皮生长因子受体2，也称为KDR(激酶插入结构域受体)和FLK-1; FGF-R(成纤维细胞生长因子受体)；和TEK(也称为Tie-2)。TEK(也称为Tie-2)是仅在内皮细胞上表达的受体酪氨酸激酶，已表明 其在血管发生中具有作用。与血管生成素-1因子的结合导致TEK激酶结 构域的自身磷酸化，引起信号转导过程，其表现为介导内皮细胞与内皮周 围的支持细胞间的相互作用，由此促进新形成的血管成熟。另一方面，血 管生成素-2因子表现为拮抗血管生成素-1对TEK的作用并且中断血管生成。Maisonpierre等人，Science, 277， 55-60(1997).在外科手术切除原发肿瘤的同时，将Ad-ExTek(—种可溶的、腺病毒 表达的Tie-2细胞外结构域)递送施用给瘤转移的临^目关的小鼠模型，可 抑制瘤转移(Lin等人，Proc Natl Acad Sci美国95， 8829-8834(1998))。 ExTek抑制Tie-2的功能可能是隔离血管生成素配体和/或阻止天然Tie-2 受体异二聚化的结果。该研究证明，首先，阻断Tie-2信号通路在健康有 机体中是耐受良好的，其次，可以提供治疗益处。费城染色体是慢性骨髓性白血病(CML)的标志且携带包含bcr基因N-端外显子和c-abl基因主要的C-端部分(外显子2-ll)的杂合基因。该基因 产物是210 kD的蛋白质(p210 Bcr-Abl)。 Bcr-Abl蛋白质的Abl部分包含 abl-酪氨酸激酶，其受到野生型c-abl的严格调控，但是在Bcr-Abl融合蛋 白质中组成型激活。该失控的酪氨酸激酶与多个细胞信号通路相互作用， 导致细胞的转化与增殖失控(Lugo等人，Science 247， 1079 [l990)。Bcr-Abl蛋白质的突变型也已被鉴定。Bcr-Abl突变型的详细综述已经 发表(Cowan-Jones等人，Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, 4 285-299)。EphB4(也称为HTK)及其配体，肝配蛋白B2(HTKL)在构建和决定血 管网络中具有重要作用。EphB4特异性表达在静脉上皮细胞上，而在血管 发育早期阶段，肝配蛋白B2特异性地并相反地表达在动脉内皮细胞上。 在肝配蛋白B2或EphB4缺陷的情况下，功能失调的基因引起小鼠胚胎致 死，并且这些胚胎在形成毛细血管连接时显示出相同的缺陷。它们都， 胎发育期间在血细胞生成和血管发育的最初位点表达。确定了其对于正常 的造血发育、内皮发育、成血管细胞发育和原始中胚层发育的重要作用。 EphB4缺陷导致胚胎干细胞的中胚层分化结果的改变。在乳房组织中 EphB4的异位表达造成结构紊乱、组织功能异常和恶性肿瘤的易感性(参 见，例如N. Munarini等人，J. Cell. Sci. 115, 25-37(2002))。从这些数据和 其他数据可以得出结论，不恰当的EphB4表达可以涉及恶性肿瘤的形成， 因此预期EphB4的抑制可以成为对抗恶性肿瘤如癌症等的手段。c-Src(也称为p60 c-Src)是胞质非受体酪氨酸激酶。c-Src参与了许多有丝分裂信号的转导。c-Src在乳房癌、胰腺癌、或成神经细胞瘤和其他癌 症中超表达。在人类结肠癌中已经鉴定了突变的c-Src。 c-Src磷酸化多种cSrc活性可以涉及与细胞增殖、分化和死亡相关的疾病。参见Bjorge， J. D. 等人(2000) Oncogene 19(49): 5620-5635; Halpern， M. S.等人(1996)， Proc. Natl. Acad. Sci， U. S. A. 93(2)， 824-7; Belsches， A. P.等人(1997) Frontiers in Bioscience [电子出版物2: D501画D518; Zhan， X.等人(2001) Chemical Reviews 101: 2477-2496; Haskell, M. D.等人(2001) Chemical Reviews 101: 2425-2440。现在，fms-样酪氨酸激酶3(FLT3)受体酪氨酸激酶被视为骨髓样白血 病和一些淋巴样白血病发病机制的重要介质。FLT3配体激活白血病细胞 上的FLT3，导致受体二聚化和促进细胞生长并抑制凋亡的途径中的信号 转导(Blood，第98巻，第3期，885-887页(200")。酪氨酸激酶抑制剂在AML治疗中的用途由于在激酶催化结构域中获 得突变而受到阻碍，在BCR-ABL的情况下，这些突变导致了对伊马替尼 的抗性。FLT3在AML和某些急性淋巴性白血病的病例中广泛表达。FLT3中 的激活突变导致了 AML病人的中度危险。因此，FLT3是用于治疗干预的 有希望的靶点。血d、板衍生生长因子受体(PDGFR)酪氨酸激酶在多种肿瘤中表达，所 述肿瘤例如小细胞肺癌、前列腺癌和成胶质细胞瘤以及许多在基质肿瘤和 血管间隙胂瘤。在胰腺癌中已经观察到PDGF和PDGF受体(PDGFR)的 表达(EbertM等人，Int J Cancer, 62: 529-535(1995))。Raf丝氨l苏氨酸激酶是Ras/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号模 块(signaling module )的主要成分，该模块响应细胞外刺激而调控复杂的 转录程序。Raf基因编码了已知与ras癌基因结合的高度保守的丝氨^/苏氨酸特异性蛋白激酶。它们是信号转导通路的一部分，所述信号转导通路被认为包括受体酪氨酸激酶、p21ras、 Raf蛋白激酶、Mekl(ERK活化剂 或MAPKK)激酶和ERK(MAPK)激酶，其最终将转录因子磷酸化。在该 通路中，Raf激酶被Ras激活，并且磷酸化和激活了促分裂原活化蛋白激 酶的两个同种型(称作Mekl和Mek2),其属于双特异性丝氨^/苏氨酸激 酶。Mek的两个同种型激活了促分裂原活化蛋白激酶l和2(MAPK,也称 作细胞外信号配体激酶1和2，或Erkl和Erk2)。 MAPK磷酸化了包括转 录因子在内的多种底物并且由此启动它们的转录程序。参与Ras/MAPK通 路的Raf激酶影响和调节许多细胞功能，例如增殖、分化、存活、致癌性 转化和凋亡。式生物的生化和遗传技术的研究，证实了 Raf在多个信号通路中的重要作 用和位置。在很多情况下，通过刺激细胞酪氨酸磷酸化的受体来活化Raf 取决于Ras的活性，表明Ras在Raf的上游起作用。Raf-l被激活后接着 磷酸化和激活Mekl，导致信号传导至下游的效应子，例如MAPK(促分裂 原活化蛋白激酶)(Crews等人，(1993) Ce//74: 215)。 Raf丝氨^/苏氨酸激 酶被认为是参与动物细胞增殖的主要的Ras效应子(Avruch等人，(1994) r柳A肠*附.19: 279)。Raf激酶有三种不同的同种型，Raf-l(c-Raf)、 A-Raf和B-Raf，通过 与Ras相互作用而激活MAPK激酶通路的能力、組织分布和亚细胞定位 来区分它们(Marias等人，J /0c/1e附./. 351: 289-305, 2000; Weber等人， Ortco^fie 19: 169-176， 2000; Pritchard等人，A^/. C"/. 5"/. 15: 6430-6442， 1995)。最近的研究已表明在皮肤痣中B-Raf突变是黑色素瘤形成的关键步骤 (Pollock等人，AW"" Gew"/cs 25: l画2， 2002)。此夕卜，最新研究已显示B-Raf 激酶结构域的激活突变发生在约66%的黑素瘤、12%的结肠癌和14%的肝 癌中(Davies等人，7V"m" 417: 949-954, 2002)(Yuen等人，Z "e"/rA 62:6451-6455， 2002)(Brose等人，CV/w"r及"ewc/1 62: 6997-7000， 2002)。在Raf激酶水平上的Raf/MEK/ERK通路的抑制剂可作为有效的肿瘤 治疗剂，对抗具有^4达的或突变的受体酪氨酸激酶、被激活的胞内酪氨 酸激酶的肿瘤、具有Grb2(经Sos交换因子刺激Ras的衔接蛋白)异常表达 的肿瘤以及含有Raf自身活化突变的肿瘤。在早期临床诊断中，Raf-l激 酶抑制剂(其也抑制B-Raf)已预示在癌症治疗中作为治疗剂(Cmmp， CYwrewf尸/rar附acew《/ca/Z)es/gfi 8: 2243-2248， 2002; Sebastien等人，Oiirew/ /^a/"廳固rica/Z)es/gw 8: 2249-2253， 2002)。通过应用RNA反义技术在细胞系中中断Raf的表达已显示出抑制由 Ras和Raf介导的致肺瘤性(Kolch等人，Nature 349: 416-428， 1991; Monia 等人，Nature Medicine 2(6): 668-675, 1996)。成纤维细胞生长因子正常的生长以及组织修复和重构需要对于激活生长因子及其受体的特 异和精巧的控制。成纤维细胞生长因子(FGFs)包括超过20种结构上相关 的多肽的家族，其受到发育的调控并且在多种组织中广泛表达。FGF刺激 增殖、细胞迁移和分化在骨骼和四肢发育、伤口愈合、组织修复、血细胞 生成、血管发生和肿瘤形成中起到重要的作用(综述于Ornitz， Novartis Found Svmp 232: 63-76;讨论76-80， 272-82(2001)).FGF的生物学作用通过属于RPTK蛋白激酶家族的特异性细胞表面 受体来介导。这些蛋白质包括胞外配体结合结构域、单跨膜结构域和在结 合FGF后发生磷酸化胞内酪氨酸激酶结构域。迄今已经鉴定了四种 FGFR: FGFR1(也称为Flg、 fms-样基因、flt-2、 bFGFR、 N誦bFGFR或 Cekl)， FGFR2(也称为Bek-细菌表达的激酶-、KGFR、 Ksam、 Ksaml和 Cek3)， FGFR3(也称为Cek2)和FGFR4。所有成熟的FGFR均具有包括 氨基端信号肽、三个胞外免疫球蛋白样结构域(Ig结构域I、 Ig结构域II、 Ig结构域lII)以及在Ig结构域之间的酸性区域("酸性盒"结构域)、跨膜 结构域和胞内激酶结构域的共同结构(Ullrich和Schlessinger， Cell 61: 203,1990'， Johnson和Williams(1992) Adv. Cancer Res. 60: 1-41)。不同的 FGFR同种型具有对于不同的FGF配体的不同结合亲和性，因此，FGF8(雄激素诱导的生长因子)和FGF9(神经胶质活化因子)表现为具有对FGFR3 更强的选择性(Chellaiah等人J Biol. Chem 1994; 269: 11620)。另 一大类细胞表面结合位点包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的结 合位点，需要其高亲和性的相互作用和激活FGF家族的所有成员。硫酸乙 酰肝素结构变体的组织特异性表达赋予配体-受体特异性和FGF的活性。FGFR-相关的疾病近来的发现表明，由FGFR突变造成的骨骼畸形的数量增加，包括软 骨发育不全，这是人类侏儒症的最常见形式。在FGF-R1、 FGF-R2和FGFR3不同结构域中特定的点突变与被划分 为颅缝骨结合综合征和侏儒综合征的常染色体显性人类骨骼发育不良相关 (Coumoul和Deng, Birth Defects Research 69: 286-304(2003)。 FGF-R3突 变相关的骨骼发育不良包括软骨发育不良、与发育延W目关的重度软骨发 育不全以及黑棘皮症(SADDAN)和致死性发育不良(TD)(Webster等人， 7>w fc (7^i"/" 13(5): 178-182(1997); Tavormina等人，爿附./ 好m附.C7ew"" 64: 722-731(1999))。 FGFR3突变也被描述于两种颅缝早闭症的表型中 Muenke冠状颅缝早闭症(Bellus等人,A^"" GWi"/cs, 14: 174-176(1996); Muenke等人，爿附.丄H"附,G^"".， 60: 555-564(1997))和伴有黑棘皮症的克 鲁宗综合征(Meyers等人，A^we Ge""/"， 11: 462-464(1995))。克鲁宗综 合征与FGFR2特定的点突变相关，而且家族型的和散发型的斐弗综合征 都与FGFR1和FGFR2的突变相关(Galvin等人，/WAS美萄，93: 7894-7899(1996); Schdl等人，J7"附iWW ( e"， 4: 323-328(1995))。 FGFR 的突变导致了突变受体的组成型激活并增加受体蛋白酪氨酸激酶活性，引 起细胞与组织无法分化。特别是，软骨发育不全突变导致了突变受体的稳定性增强，抑制受体 激活而阻止下调，引起软骨细胞成熟受限并且抑制骨生长(综述于Vajo等 人，E"^CT7V^/^We將，21(1) : 23-39(2000))。有不断增加的证据表明在多种类型的癌症中存在突变激活的FGFR3。在两种常见的上皮癌即膀胱癌和宫颈癌以及多发性骨髓瘤中，组成性激活的FGFR3是FGFR3在癌症中致癌作用的首要证据。此外，最近的研 究报道了在大部分的良性皮肤肺瘤中存在FGFR3激活突变(Logie等人， Hum Mol Genet 2005)。 FGFR3目前在膀胱癌中是最常突变的癌基因，其 在大约50%的全部膀胱癌病例中和大约70%的具有表皮膀胱胂瘤的病例 中发生了突变(Cappdlen等人，Nature Genetics 1999， 23; 19-20; van Rhijn 等人，Cancer Research 2001， 61: 1265-1268; Billerey等人,爿附.丄 2001,158: 1955-1959， WO 2004/085676)。在膀胱癌中也才艮道了 FGFR3的 超表达(表皮的和侵入性的)(Gomez-Roman等人，Clinical Cancer Research 2005)。由于染色体易位t(4，14)造成的FGFR3异常^Ji在10-25%的多发性 骨髓瘤病例中均有报道(Chesi等人，Nature Genetics 1997， 16: 260-264; Richelda等人，Blood 1997， 90: 4061-4070; Sibley等人，BJH 2002， 118: 514-520; Santra等人，Blood 2003， 101: 2374-2476)。 FGFR3激活突变在 5-10%的具有t(4，14)的多发性骨髓瘤中可以见到，并且与进行性肿瘤g 相关(Chesi等人，Nature Genetics 1997， 16: 260-264; Chesi等人，必Wrf， 97(3): 729-736(2001); Intini， et al， BJH 2001， 114: 362-364)。在本文中，FGFR3信号传递的后果通常表现为细胞类型特异性的。在 软骨细胞中，FGFR3的高活性导致生长抑制(综述于Omitz， 2001)，而在 骨髓瘤细胞中，其促进肿瘤ii^(Chesi等人，2001)。现已发现，抑制FGFR3活性代表了一种治疗T细胞介导的炎症或自 身免疫性疾病的方法，例如用于治疗T细胞介导的炎症或自身免疫性疾病 包括但不限于类风湿关节炎(RA)、 II型胶原关节炎、多发性硬化症(MS)、 系统性红斑狼疳(SLE)、银屑病、幼年型糖尿病、舍格伦病、甲状腺病、 结节病、自身免疫性葡萄膜炎、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、乳 糜泻和重症肌无力。参见WO 2004/110487。FGFR3突变导致的病症还描述于WO 03/023004和WO 02/102972。在由FGFR3和其他FGFR引起的疾病中(特别是与例如异常的FGF23 血清水平相关的)，还提及了常染色体显性的血磷酸盐过少的佝偻病(ADHR)、 X-染色体连锁的血磷酸盐过少的佝偻病(XLH)、胂瘤诱导的骨软 化病(TIO)、骨纤维异样增生症(FH)(也参见X. Yu等人，Cytokine & Growth Factor Reviews 1^， 221-232(2005)，和X. Yu等人，Therapeutic Apheresis and Dialysis 2(4)， 308-312(2005))。在乳腺癌中涉及FGFR1、 FGFR2和FGFR4的基因扩增和/或超表达 (Penault-Llorca等人，Int J Cancer 1995; Theillet等人，Genes Chrom. Cancer 1993; Adnane等人,Oncogene 1991; Jaakola等人，Int J Cancer 1993; Yamada等人，Neuro Res 2002)。 FGFR1和FGFR4的^A达也与 胰腺癌和星形细胞瘤相关(Kobrin等人，Cancer Research 1993; Yamanaka 等人，Cancer Research 1993; Shah等人，Oncogene 2002; Yamaguchi等 人，PNAS 1994; Yamada等人，Neuro Res 2002)。前列腺癌也与FGFR1 的^^W目关(Giri等人，Clin Cancer Res 1999)。FGFs/FGFR还参与血管发生。因此，靶向FGFR系统也被预测为治 疗原发性肿瘤和瘤转移的抗血管生成疗法(参见，例如Presta等人， Cytokine & Growth Factors Reviews M， 159-178(2005))。特别是FGFR3的突变(如FGFR3b)还被描述为在口腔扁平细胞癌病 例中造成这类受体组成型激活的原因(参见，例如Y. Zhang等人，Int. J. Cancer 112， 166-168(2005)。FGFR的表达增强，特别是FGFR1的表达增强，已被报道为与慢性 梗阻性肺疾病(COPD)(尤其是支气管)相关(参见，例如A. Kranenburg 等人，J. Pathol.巫，28-38(2005))。涉及FGF-R1基因座并造成FGR-R1的激活形式的染色体易位已被报 道为造成8pll骨髓增生综合征嗜酸性骨髓增生综合征(EMS)的原因(参见 D. Macdonald等人，Cross NCP(2002) Acta Haematologica巡101-107)。拮抗FGFR、特别是FGFR1或FGFR4的方法也被描述用于治疗肥胖 症、糖尿病和/或其相关疾病，例如代谢综合征、心血管疾病、高血压、异 常的胆固醇和甘油三酯水平、皮肤病(如皮肤感染)、静脉曲张、黑棘皮症、 湿渗、运动不耐受、2型糖尿病、胰岛素耐受、高胆固醇血症、胆石病、矫形外科损伤、血栓栓塞疾病、冠脉或血管狭窄(如动脉粥样^埂化)、日间 嗜睡、睡眠呼吸暂停、晚期肾病、胆嚢疾病、痛风、心脏病、免疫应答受 损、呼吸功能受损、受伤后感染、不育症、肝病、下腰痛、产科与妇科并 发症、胰腺炎、中风、手术并发症、压迫性尿失禁和/或胃肠道病症(参见，例如WO 2005/037235 A2)。酸性成纤维细胞生长因子(特别是FGF-1)和FGFR1也被描述为参与 成视网膜细胞瘤的异常信号传递，导致结合FGF-1后增生(参见，例如S. Siffroi-Fernandez等人，Arch. Ophthalmology里,368-376(2005))。长(参见，例如T. Ishibe等人，Clin. Cancer Res. U(7)， 2702-2712(2005))。 还可以证明FGFR参与了甲状腺癌。表皮生长因子家族和相关疾病表皮生长因子受体(EGF-R)和ErbB-2激酶是蛋白质酪氨酸激酶受体， 其与它们的家族成员ErbB-3和ErbB-4 —起在大量的哺乳动物细胞包括人 类细胞、特别是上皮细胞、免疫系统的细胞，以及中枢与外周神经系统的 细胞的信号转导中起到关键作用。例如，在多种细胞类型中，受体相关的 蛋白质酪氨酸激酶的EGF诱导的激活是细胞分裂的必要M，因此对于 细胞群体的增殖是必要的。最重要的是，在许多人类肿瘤的基本组分中观 察到了 EGF-R(好E/ -7)和/或ErbB-2(iM:及-2)的超表达。例如，发现EGF-R 在非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(头和颈部)、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠 癌和前列腺癌以及神经胶质瘤中*达。发现ErbB-2在鳞状细胞癌(头和 颈部)、乳腺癌、胃癌和卵巢癌以及神经胶质瘤中超表达。在所有上述情况中，涉及蛋白激酶异常活性的调节(特别是抑制这类激 酶的活性)的那些，可以合理地预期对所述疾病有效。因此，需要能够阻断异常的組成型受体蛋白酪氨酸激酶活性、特别是 FGFR活性，从而治疗与上述突变相关的临床表现并调节多种生物学功能 的高亲和性和/或选择性的分子。考虑到大量的蛋白激酶抑制剂，众多的增生性疾病和其他PK-相关疾 病，现在有必要提供用作PK抑制剂的新型化合物，并由此用于治疗这些 蛋白质酪氨酸激酶(PTK)相关疾病。所需要的是新型的具有药学优点的PK 抑制性化合物。本发明的一般性描述现在已经发现在下文中更加详细给出的定义为属于杂芳基芳基脲类的 化合物显示对许多蛋白质酪氨酸激酶的抑制作用，特别是对本文提到的任 意此类激酶(更加特别是FGFR)的抑制作用。可以提到的本文的化合物抑制的激酶的实例具体是FGFR1、 FGFR2、 FGFR3和FGFR4。其他被抑制的激酶是受体酪氨酸激酶VEGF-R，具体 而言是VEGF受体KDR(VEGF-R2)。爿>开的化合物适用于抑制一种或多 种这些和/或其他蛋白质酪氨酸激酶和/或抑制这些酶的变异体。考虑到这 些活性，所述化合物特别可用于治疗涉及此类型激酶(特别是提到的那些 激酶)错乱或过度活性的疾病。本文公开的化合物可以以不同的形式，例如游离酸、游离碱、酯类和 例如其他前药、盐和互变异构体的形式存在，且本文包含所有不同形式的 所述化合物。保护范围包括赝品或欺诈品，其包含或声称包含本发明化合物，不考治疗有效量。因此保护范围包括包装，包含表明其包含了本发明的种类或 药物制剂或组合物的描述和说明书，以及作为或包含或声称包含此类制剂、 组合物或种类的产品。本说明书和权利要求书全文，除非上下文另有需要，单数形式都包含 复数。具体而言，除非上下文另有需要，任何所使用的不确定的冠词在本 说明书中都理解为考虑了复数和单数。除非与本文所述的内容不相容，与本发明的具体方面、实施方案或实施例相关的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应当理解为可用于本文描述的任何其他的方面、实施方案或实施例。本说明书和权利要求书中，词语"包含"和"包括"及其不同的变体是才i "包含但不限于"，其不意味着(并且不)排除其他部分、添加物、成分、 整体或步骤。本文的其他方面和实施方案将在以下的描述和权利要求中进行说明。 发明详述现在已经发现式IA的新化合物，X、 Y和Z中的两个是N(氮)，第三个是CH或N(优选地，Y和Z是 N，且Z是CH);并且 或者其中，R1是被羟基、苯基-C广CV烷氧基、哌溱-l-基或4-(苯基-d-C"烷基)画 哌溱-l-基所取代的苯基；或者被(i)卤素或C厂C7-烷氧基以及除此之外被(ii) 羟基、苯基-d-CV烷氧基、N-单-或N，N-二-(C广C7-烷基)-^J^C广C"烷基、 吡咯烷子基(pyrrolidino)-C广C7-烷氧基、l-(C广CV烷基)-哌啶4-基、吗啉代 -d画C7画烷氧基、硫吗啉代-d-CV烷緣、哌溱画l-基、4-(苯基-C广C7-烷基)-哌嗪-l-基、4-(d-Cr烷基)-哌嗪-l-基、[4-(d-C7-烷基)-哌嗪-l-基卜d-C7-烷基、N-单-或N，N-二-(d-C7-烷基)-氨基-C，-C7-烷基、N-单-或N,N-二 -(d-Cr烷基)-氨基-CrC7-烷氧基、[4-(d-C"烷基)-哌溱-l-基-CVC7-烷氧 基4-(Q-C7-烷基)-哌^l-基l-羰基所取代的苯基；R2是氢、d-C"烷基、d-CV烷氧基或卤素；其中R3是氢、CVCV烷基或苯基-CVCT烷基，R4各自独立地是C厂CV烷基、S素-d-CV烷基、自素或c,-cv烷氧基，且n是0、 1、 2、 3、 4或5j 或者R1是被羟基、苯基-d-CV烷氧基、哌溱-l-基、4-(苯基-d-C7-烷基)-哌嗪-l-基所取代的苯基；N-单-或N，N-二-(C,-CT烷基)-氨基-d-CV烷基、 吡咯烷子基-C,-C7-烷氧基、l-(C,-CV烷基)-哌啶-4-基、吗啉代-C,-CV烷氧 基、硫吗啉代-C广CV烷氧基、4-(d-Cr烷基)-哌溱-l-基、[4-(C广C7-烷基)-哌溱-l-基-CVC7-烷基、N-单-或N，N-二-(d-C7-烷基)-氨基-C广C7-烷基、 N-单-或N，N-二-(C「C7-烷基)-tJ^CVC7-烷氧基、[4-(<:1-0烷基)-旅噪誦1-基卜OC"烷氧基、[4-(C,-C7-烷基)-p底溱-l-基卜羰基所取代的苯基；或者带 有一个本段中提到的取代基和除此之外的选自卣素和C,-Cr烷氧基的取代基的苯基；R2是氢、d-Cr烷基、CVCV烷氧基或卤素； R3是氢、d-CV烷基或苯基-d-C7-烷基， R5是氢(优选)、d-C7-烷基或苯基-C,-C7-烷基， 并且或者n是3、 4或5且R4选自d-O烷基、d-CV烷氧基和囟素，条 件是C厂Cr烷基、d-CV烷氧基和囟素中各自至少存在一个；或者n是2且一个1^是卣素-d-C7-烷基，另 一个R"是C厂CV烷氧基;或者n是3、 4或5且R4选自卤素、碘代和d-Cr烷氧基，M是卤 素、碘代和d-CV烷氧基中各自至少存在一个；或者n是3、4或5且R"选自卣素、鹵素画C广Cr-烷基和CVC7-烷氧基， 条件是卤素、卤素-d-CV烷基和d-C「烷氧基中各自至少存在一个；或者Y和Z是N(氮)且X是CH， 或者其中R1是被N-C广C"烷基-哌溱-l-基单取代的3-吡錄，R2是氢， R3是氢，R4各自独立地是CKV烷基、卣素-d-CV烷基、卣素或Q-CV烷氧基，R5是氢且n是l、 2、 3、 4或5; 或者式IA的化合物，其中W是4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基絲，W是 氢，R3是氢，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， R5是氢，Y和Z 是N且X是CH;或者式IA的化合物，其中Ri是3-(4-甲基-哌唤-l-基甲基)-苯基氨基，R2 是氢，RS是曱基，W是2-和6-氯及3-和5-曱氧基，n是4， RS是氢，Y和 Z是N且X是CH,或者式IA的化合物，其中R'是3-(4-乙基-旅瘵-l-基)-苯基氨基，W是氢， Rs是曱基，W是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， R5是氢，Y和Z是N 且X是CH，或者式IA的化合物，其中R!是4-(2-吗啉4-基-乙氧基)-苯基氨基，R"是 氢，RS是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，议5是氢，Y和Z 是N且X是CH,或者式IA的化合物，其中R，是4-(l-乙基-哌咬4-基)-苯基氨基，W是氢， W是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，议5是氢，Y和Z是N 且X是CH，或者式IA的化合物，其中W是4-(4-乙基-哌溱-l-基)-苯基氨基，W是氢， Rs是乙基，W是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， R5是氢，Y和Z是N且X是CH，和/或 或者式IA的化合物，其中Ri是4-(4-乙基-哌溱-l-羰基)-苯基氨基，W是 氢，Rs是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， R5是氢，Y和Z 是N且X是CH;或者两个或多个式IA化合物的混合物；或者各种情况的式IA化合物(如上下文提到的)的盐、其前药、N-氧 化物或酯，其对于治疗与蛋白激酶活性相关的病症，特别是与可以通过蛋白质酪 氨酸激酶调节化合物进行治疗的疾病相关的病症，更加特别地是FGFR调 节化合物进4于治疗的疾病相关的病症是有用的。因此，本发明涉及一种或多种此类的式IA化合物、其盐、前药、N-氧化物或酯，以及上文提到的用途、方法和药物制剂。具体而言，本发明涉及式IA的化合物，其中X、 Y和Z中的两个是N(氮)，第三个是CH或N(优选地，Y和Z是 N且Z是CH);并且 或者(A) W是被羟基、被苯基-C广C7-烷緣(特别是苄氧基)、被哌溱-l-基 或被4-(苯基-d-C7-烷基)-旅臻-l-基(特别是4-苄基-哌溱-l-基)所取代的苯 基；或者(i)(一次)被卣素(特别是氟或氯)或d-CV烷氧基(特别是甲氧基) 以及另外(ii)(一次)被羟基、苯基-C,-CV烷氧基(特别是苄氧基)、N-单-或 N，N-二-(C,-C7-烷基)-氨基-CVCV烷基(特别是二甲基氨基甲基)、吡咯烷子 基-d-CV烷氧基(特别是2-吡咯烷子基-乙氧基)、l-(d-CV烷基)-哌咬-4-基 (特别是l-乙基-哌啶-4-基)、吗啉代-d-CV烷氧基(特别是2-吗啉代-乙氧 基)、硫吗啉代-C广CV烷氧基(特别是2-硫吗啉代-乙氧基)、哌，秦-l-基、4-(苯基-<:广<:7-烷基)-派溱-1-基(特别是4-苄基哌溱-1-基)、4-(<:1-0烷基)-旅"秦画1-基(特别是4-(甲基、乙基或异丙基)-哌嗪-l-基)、[4-(Q-C7-烷基)-哌嗪-l-基卜d-Cr烷基(特别是2-[4-(甲基或乙基)-哌溱-l-基-乙基)、N-单-或N，N-二-(C广CV烷基)-氨基-CVC7-烷基(特别是二甲基氨基甲基)、N-单-或N，N-二-(C广CV烷基)-氨基-CVC7-烷氧基(特别是2-(二甲基氨基)-乙氧基)、 [^(C广C7陽烷基)画派溱-l-基-C广0烷氧基(特别是2-(4-甲基哌唤-l曙基)-乙氧 基)或4-(C广CV烷基)-哌溱-l-基-羰基(特别是4-乙基哌唤-l-羰基)所取代的苯基；W是氢(优选)、C广CV烷基、C,-CV烷氧基或(较不优选)卤素；R3是氢(优选)、d-C7-烷基(优选)或苯基-d-C7-烷基，R"各自独立地是d-C7-烷基、卣素-d-C7-烷基、卣素或C广CV烷氧基， R5是氢(优选)、d-C7-烷基或苯基-C广0烷基， 且n是0、 1、 2、 3、 4il5; 或者(B)其中R1是4皮以下基团所取代的苯基，所述基团包括羟基、苯 基-d-C7-烷氧基(特别是节氧基)、哌,-l画基、4-(苯基-d誦C7-烷基)-哌溱醫l-基(特别是4-苄基誦哌溱-l画基)、N-单画或N，N陽二陽(C厂C7-烷基)-iJ^CVC"烷 基(特别是二甲基氨基甲基)、吡咯烷子基-d-CV烷氧基(特别是2-吡咯烷子 基-乙氧基)、l-(d-CV烷基)-哌啶-4-基(特别是l-乙基-哌啶斗基)、吗啉代-C广CV烷氧基(特别是2-吗啉代-乙氧基)、硫吗啉代-c广cv烷氧基(特别是2-硫吗啉代-乙氧基)、4-(C广Cr烷基)-哌溱-l-基(特别是4-(甲基、乙基或异 丙基)-旅溱-l-基)、[4-(d-C7-烷基)-哌唤-l-基-C广C7-烷基(特别是2-[4-(甲 基或乙基)-哌溱-l-基I-乙基)、N-单-或N，N-二-(d-C「烷基)-氨基-C广C7-烷 基(特别是二甲基氨基甲基)、N-单-或N，N-二-(d-Cr烷基)-氨基-C广CV烷氧 基(特别是2-(二甲基#^)-乙氧基)、[4-(C广C7-烷基)-哌溱-l-基卜C广C"烷氧 基(特别是2-(4-甲基哌嗪-1-基)-乙氧基)或[4-(C广C7-烷基)-哌嗪-l-基-羰基 (特别是4-乙基p底溱-l-羰基)；或者带有一个a中提到的W的取代基和除 此之外选自卣素和d-C"烷氧基的取代基的苯基；W是氢(优选)、C,-CV烷基、OCr烷氧基或(较不优选)卤素； R3是氢(优选)、C广C7-烷基(优选)或苯基-C广C7-烷基，R5是氢(优选)、C广C7画烷基或苯基-C广C7-烷基，且或者n是3、 4或5且R4选自C广C7-烷基、C广Cr烷氧基和囟素，条 件是C，-C7-烷基、d-CV烷氧基和卣素中各自至少存在一个；或者n是2且一个！^是卣素-d-C7-烷基，另 一个R"是d-CV烷l^;或者n是3、 4或5且R4选自卤素、碘代和C广CV烷I^， M是卣 素、碘代和d-C7-烷氧基中各自至少存在一个；或者n是3、4或5且I^选自卣素、卣素-C广C7-烷基和C广CV烷lL&， 条件是卤素、卤素-Q-CV烷基和d-CV烷氧基中各自至少存在一个；(C)或者式IA的化合物，其命名为l-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-3-{6誦[4-(2画吗啉國4-基-乙氧基)國苯基氨 基卜嘧咬-4-基}-脲(其中，对于式IA， R，是4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨 基，W是氢，R"是氢，W是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，且n是4且R5是氢)，3-(2，6-二氯-3，5-二曱氧基-苯基)-l-甲基-1-{6-[3-(4-甲基-哌嗪-l-基甲 基)-苯基氨基-嘧吱-4-基}-脲(其中，对于式IA， Ri是3-H-甲基-P底溱-l-基 甲基)-苯基氨基，W是氢，Rs是甲基，114是2-和6-氯及3-和5-甲氧基， 且n是4，且R5是氬)，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-3-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯基氨基]-嘧咬-4-基}-1-曱基-脲(其中，对于式IA， R1是3-(4-乙基-哌溱-l-基)-苯基氨 基，W是氢，RS是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，且n是4，且 R5是氢)，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-l-甲基-1-{6-[4-(2-吗啉-4_基-乙氧基)-苯基氨基]-嘧咬画4画基}-脲(其中，对于式IA， W是吝p-吗啉4-基-乙氧基)國 苯基氨基，W是氢，Rs是甲基，议4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，且ii是 4，且R5是氢)，3陽(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(1-乙基-哌啶-4-基)-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲(其中，对于式IA， W是4-(l-乙基-哌咬-4-基)-苯基氨 基，W是氢，RS是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基且n是4，且R5是氬)，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-l-乙基-1-{6-[4-(4-乙基-哌嘸-l-基)-苯 基氨基-嘧咬-4-基}-脲(其中，对于式IA， R1是4-(4-乙基-哌溱-l-基)-苯基氨 基，W是氢，RS是乙基，W是2-和6-氯及3-和5-甲氧基且n是4，且R5是氢)或者3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-l-羰基)-苯基氨 基卜嘧啶-4画基}-1-甲基画脲(其中，对于式IA， R'是4-(4画乙基-哌溱-l-絲)画 苯基氨基，R2是氢，R3是甲基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，且n是 4，且R5是氬)，(其中这些化合物中对应于式IA中的R1、 R2、 R3、 R4、 R5、 X、 Y和Z的部分以及n是通过给出的这些化合物各自的含义来分别 进行定义)；其中这些化合物中各自的Y和Z是氮且X是CH; 以及各种情况的式IA的化合物(如上下文所述)的盐、前药、N-氧化物 或其酯。在一个实施方案中本发明提供了式IA化合物，其中Y和Z是N(氮)且X是CH，或者其中R1是被N-d-CV烷基-哌溱-l-基单取代的3-吡#，R2是氢，R3是氢，R"各自独立地是C厂CV烷基、囟素-C广C7-烷基、卣素或d-CV烷氧基， R5是氢，且n是l、 2、 3、 4或5。在该实施方案中，优选R"各自独立地是fi素或d-CV烷氧基，且n 优选地是3、 4或5，最优选4。 优选的定义除非另外指明，本文中所用的一般术语优选地具有本文中所公开的下 列含义字首"低级"或"d-C7"是指具有直至7 (含最大值7)个链原子、特别是直至4 (含最大值4 )个链原子的基团。烷基和脂肪族的具体类别包含1、 2、 3或4个碳原子。所讨论的基团是直链或者具有单个或多个分支的支链。低级烷基或d-CV烷基优选地是包含1-7(含1和7 )个碳原子的烷基， 优选l、 2、 3或4个碳原子，并且是直链或支链；例如，低级烷基是丁基， 如正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基；丙基，如正丙基或异丙基；乙基或 甲基。举例的烷基是甲基、乙基或异丙基。当化合物、盐等使用复数形式时，其也用来表示单个化合物、盐等。当苯基在式IA中作为连接R，和NRS的环存在于R1中时，取代基羟 基、苯基-d-CV烷氧基、哌唤-l-基、4-(苯基-d-C7-烷基)-哌嗪-l-基；N-单-或N，N-二-(C广C7-烷基)-^J^-C广CV烷基、吡咯烷子基-C广CV烷氧基、 HCVCV烷基)-哌咬-4-基、吗啉代-d-CV烷氧基、硫吗啉代-C厂CV烷氧基、 4-(d-CV烷基)-哌唤-l-基、[4-(d-C7-烷基)-哌嗪-l-基-d-CV烷基、N-单-或N，N-二-(d-CV烷基)-氨基-d-Cr烷基、N-单-或N,N-二-(d-CV烷基)-氨 基-C-C厂烷氧基、[4-(C广C7-烷基)-哌嗪-l-基画d画C7-烷氧基、[4-(d陽C7画烷 基)-旅，秦-l-基l-羰基优选位于相对于连接NR3的苯环的3-或4-位。任何不对称碳原子都可以以(R)-、 (S)-或(R，S)-构型存在，优选以(R)-或(S)-构型存在。任何不饱和基团都以顺-、反-或(顺，反)形式存在。因此这 些化合物可以以异构体混合物或纯异构体的形式存在，优选以对映异构体-纯非对映异构体形式存在。本发明还涉及所公开化合物的可能的互变异构体。如果没有另外指明，游离形式及其盐形式的式IA化合物，包括那些 例如在纯化或鉴定新化合物中可以用作中间体的盐，考虑到其与互变异构 体或互变异构混合物及其盐的亲密关系，本文中任何这些化合物适当且便的盐。例如，在各自连有至少一个氢的氮基或羟基与通过双键与相邻原子相 连的碳原子连接的情况中，可以存在互变异构体(如酮-烯醇或亚胺-烯胺 互变异构体)。当提到"化合物......，其互变异构体；或其盐，，或类似的话时，其含义是"化合物......，其互变异构体；或该化合物和/或该互变异构体的盐"。卤素具体而言是指氟、氯、溴或碘，特别是(优选在式I化合物中)氟、氯或硪o卤素-d-C7-烷基的含义是C厂CV烷基，其中一个或多个氢原子被卤素原子取代，如三氟甲基。4-((:1-<:7-烷基)-哌嗪-1-基1-羰基的含义是[4-(<:1-<:7-烷基)-哌溱-1-基l-c(-o)画。本发明涉及如上文所述的式IA化合物及其盐、酯、N-氧化物或前药。 因此，在一方面本发明提供了作为式IA化合物和/或盐、酯、N-氧化物或前药的产物。盐具体是式IA(或其例举的式)化合物的可药用盐，特别是当其形成 成盐基团时如此。成盐基团是具有碱性或酸性特性的基团。具有至少 一个碱性基团或至 少一个碱性原子团的化合物，例如碱性氮，如氨基、没有形成肽键的仲氨 基或叔氨基，可以例如与无机酸(如盐酸、硫酸或磷酸)或合适的有机羧 酸或磺酸，例如脂肪族单-或二羧酸(如三氟乙酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸 (glycolic acid)、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、 柠檬酸或草酸)或氨基酸(如精氨酸或赖氨酸)、芳香羧酸(如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙氧基苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸)、芳香-脂肪族 羧酸(如扁桃酸或肉桂酸)、杂芳香族羧酸(如烟酸或异烟酸)、脂肪族磺 酸(如甲-、乙-或2-羟基乙磺酸)或芳香族磺酸(如苯-、对甲苯-或萘-2-磺酸)形成酸加成盐。当存在几个碱性基团时，可以形成单-或多-酸加成 盐。具有酸性基团、羧基或酚羟基的化合物可以形成金属或铵盐，例如碱 金属或碱土金属盐，如钠、钾、镁或钙盐，或者与氨或合适的有机胺如叔 单胺(如三乙胺或三-(2-羟基乙基)-胺)，或者杂环碱，如7V-乙基-哌啶或 yV，7V'一二甲基派，秦所形成的铵盐。同时可能形成盐的混合物。同时具有酸性和碱性基团的化合物可以形成内盐。出于分离或纯化的目的，以及进一步用作中间体的化合物，也可能使 用非可药用盐，例如苦味酸盐。然而，仅可药用的、无毒的盐才可用于治 疗目的，因此优选使用这些盐。考虑到新化合物或其N-氧化物的游离形式及其盐形式，包括那些例如 在纯化或鉴定新化合物中可以用作中间体的盐的亲密关系，本文中任何游 离化合物(包括式IA化合物、中间体和原料)适当且便利地都将理解为 也涉及其所对应的N-氧化物和/或盐、水合物、溶剂合物和/或此类化合物 或其N-氧化物的结晶形式。式IA化合物(或其例举的式)如上下文所述具有有价值的药理特性。生物学作为Bcr-Abl、 c画KIT、 EphB4、 EGF-R、 VEGF-R2(KDR)、 FGF-R、 Tie-2(Tek)、 Ret、 PDGFR、 raf、 FLT3、 c-src和/或FGFR3受体酪氨酸激 酶活性抑制剂的本发明化合物的功效可以证明如下在下文中，"抑制剂"、"活性化合物"等是指式IA的化合物。抗Bcr-Abl活性的试验p210 Bcr-Abl表达载体pGDp210Bcr/Abl(32D-bcr/abl)转染的鼠骨髓 祖细胞系32Dcl3获自J Griffin(Dana Faber癌症研究所，Bosten， MA，美 国)。该细胞表达具有组成型激活的abl激酶的融合bcr-Abl蛋白质并且进 行非生长因子依赖性的增殖。该细胞在RPMI 1640(AMIMED)、 10%胎牛 血清、2 mM谷氨酰胺(Gibco)("完全培养基，，)中扩增，并通过在冷冻培养 基(95%胎牛血清、5%DMSO (SIGMA))中冷冻的每小瓶2xl06个细胞的 整分试样来制备工作储备液。解冻后，在最多10-12代内采用该细胞进行 实验。使用来自Upstate Biotechnology的抗abl SH3结构域的抗体(目录 号06-466)进4亍ELISA。采用标记了来自ZYMED(目录号03-7722)的碱 性磷酸酶(PY10(AP))的抗-磷酸酪氨酸的抗体Ab PY20测定bcr-abl的磷酸 化。使用(N-{5-4-(4-甲基-哌嗪子基-甲基)-苯曱酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的甲磺酸盐(单甲磺酸盐)(STI571)(市售为Gleevec⑧或 Glivec , Novartis)作为对比和参考化合物。在DMSO中制备10 mM的储 备液并将其存放于-2(TC。对于细胞试验，将储备液在完全培养基中进行两 步稀释(1:100和1:10)得到10|nM的初始浓度，然后在完全培养基中制备系 列的3倍稀释液。应用该方法没有遇到溶解度的问题。对待测的化合物进 行类似的处理。将200,000 32D-bcr/abl细胞以每孔50 的量接种于96 孔的圆底组织培养板中进行分析。将每孔50 nL测试化合物的系列3倍稀 释液加入细胞中， 一式三份。测试化合物的终浓度范围为例如5 pM至0.01 ILiM。未处理的细胞用作对照。将化合物与细胞一起于37。C、 5V。C02中温 育90分钟，随后以1300转/分钟离心组织培养板(Beckman GPR离心机)， 并小心抽吸除去上清液，注意不要移出任何沉淀的细胞。加入150pL裂解 緩冲液(50mM Tris/HCl pH 7.4、 150 mM氯化钠、5mM EDTA、 lmM EGTA 、 1% NP画40(非离子型去污剂，Roche Diagnostics GmbH ， Mannheim,德国)、2mM原钒酸钠、1 mM苯曱基磺酰氟、50 |ig/mL抑 肽酶和80吗/mL亮抑酶肽)使细胞沉淀裂解，或者将其直接用于ELISA或 者冻存于-20。C备用。将抗-abl SH3结构域的抗体以每孔SO PBS中200 ng的量包被黑色ELISA板(Packard HTRF-96黑色板，6005207)，于4°C 过夜。用含有0.05% Tween20(PBST)和0.5 %TopBlock(Juro，目录号TB 232010)的200 juL/孔PBS洗涤三次后，将剩余的蛋白质结合位点用200 pL/ 孔的PBST、 3% TopBlock于室温下封闭4小时，随后与50 未处理的 或测试化合物处理的细胞的裂解物(每孔总蛋白质20照)一起于4'C温育 3-4小时。洗涤三次后，以50nL/孔的量。加入在封闭緩冲液中稀释至0.5 iLig/mL的PY20(AP)(Zymed)并培养过夜(4。C)。对于所有的培养步骤，均采 用平板密封器(Costar，目录号3095)将平板密封。最后，用洗涤緩冲液将 平板再洗涤三次，并在以90 ^L/孔的量加入含有Emerald II的AP底物 CPDStar RTU前用去离子水洗涤一次。现在将采用Packard Top SealTM-一种平板密封器(目录号6005185)密封的平板在黑暗中于室温下温育45分 钟，用Packard Top Count微孔板闪烁计数器(Top Count)测定每秒计数(CPS)来对发光进行定量。对于最终的优化形式的ELISA，将50pL在96 孔组织培养板中生长、处理和裂解的细胞的裂解物直接从这些平板转移到 预先用来自Upstate的兔抗-abl-SH3结构域的多克隆抗体AB 06-466包被 的ELISA板上。抗-磷酸酪氨酸的抗体AB PY20(AP)的浓度可以降低到0.2 pg/mL。如上所述洗涤、封闭以及与发光底物一起温育。采用如下的方法 完成定量计算从未处理的32D-bcr/abl细胞的裂解物得到的ELISA读数 (CPS)与试验背景(含有所有成分，但没有细胞裂解物)的读数之间的差异并 以此作为100% ，以反映这些细胞中存在的組成型磷酸化的bcr-abl蛋白质。 化合物在bcr-abl激酶活性中的活性以bcr-abl磷酸化降低的百分率来表 示。通过图解的内插法或外推法从剂量效应曲线测定ICs。的值。本发明的 化合物优选ICs。值范围是从15nM至500|iM之间，最优选是从15nM至 200 |iM之间。在细胞试验中，在DMSO中溶解化合物并用完全培养基稀释以获得 10pM的起始浓度，然后在完全培养基中制备系列的3倍稀释液。将表达 'wt，-Bcr-Abl或Bcr-Abl突变体的32D或Ba/F3细胞(例如T-315-I)以50|iL 完全培养基中200000个细胞/孔的量接种于96孔的圆底组织培养板中。 将每孔50 juL的测试化合物的系列3倍稀释液加入细胞中， 一式三份。未 处理的细胞用作对照。将化合物与细胞一起于37°C、 5% C02中温育卯 分钟，随后以1300转/分钟离心组织培养板(BeckmanGPR离心机)，并小 心抽吸除去上清液，注意不要移出任何沉淀的细胞。加入150pL裂解緩冲 液(50mMTris/HClpH7.4、 150mM氯4匕钠、5mM EDTA、 lmM EGTA、 1% NP-40、 2 mM原钒酸钠、lmMPMSF、 50pg/mL抑肽酶和80|iig/mL 亮抑酶肽)使细胞沉淀裂解，或者将其直接用于ELISA或者冻存于-20。C备 用。将来自Upstate的兔抗-abl-SH3结构域的多克隆抗体06_466以每孔 50jiL PBS中50ng的量包被黑色ELISA板(Packard HTRF-96黑色板， 6005207)， 于4。C过夜。用含有0.05% Tween20(PBST)和0.5% TopBlock(Juro)的200 iaL/孔PBS洗涤三次后，将剩余的蛋白质结合位点用200 pL/孔的PBST、 3% TopBlock于室温封闭4小时，随后与50L未处 理的或测试化合物处理的细胞的裂解物(每孔总蛋白质20吗)一起于4°C wy3-4小时。洗涤三次后，以50ixL/孔的量加入在封闭緩冲液中稀释至0.2 Hg/mL的用碱性磷酸酶(Zymed)标记的抗-磷酸酪氨酸的抗体PY20(AP)并 温育过夜(4。C)。对于所有的培养步骤，均采用平板密封器(Costar)将平板 密封。最后，用洗涤緩冲液将平板再洗涤三次，并在以90nL/孔的量加入 含有Emerald II的AP底物CPDStar RTU前用去离子水洗涤一次。现在 将采用Packard Top SealTM-—种平板密封器密封的平板在黑暗中于室温下 温育45分钟，用Packard Top Count微孔板闪烁计数器(Top Count)测定 每秒计数(CPS)来对发光进行定量。计算未处理的32D-Bcr/Abl细胞的裂解物得到的ELISA读数(CPS)与 试验背景(含有所有成分，但没有细胞裂解物)的读数之间的差异并以此作 为100%,以反映这些细胞中存在的组成型磷酸化的Bcr-Abl蛋白质。化 合物在Bcr-Abl激酶活性中的活性以Bcr-Abl磷酸化降低的百分率来表示。通过图解外推法从剂量效应曲线测定IC50 (和IC90)的值。在抑制自身磷酸化作用和抑制在Ba/F3转染的细胞、特别是T3151中 Bcr-Abl突变体的IL-3非依赖的增殖方面，本发明的化合物优选ICso值范 围是从50nM至500nM之间。32D c13细胞可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC CRL11346)获 得，Ba/F3细胞从德国孩i生物和细胞培养物收藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ， Braunschweig和DSMZ No. ACC 300)获得。户"/""V 爭人7Vfl似"，3"6，户"6Af^/ 7Z> 749。 爭人C"/，乾.渭5， 727, P"Mfe"Z) M2"跌Ba/F3.p210细胞和鼠造血32D c13细胞(32D p210 cells)通过用包含 p210BCR-ABL(B2A2) cDNA的pGD载体转染IL-3依赖的鼠造血Ba/F3 细胞系而获得。<formula>formula see original document page 35</formula>。抗c-KIT活性的试验使用杆状病毒供体载体pFbacG01(GIBCO)产生表达人c-Kit胞质激酶 结构域的第544-976位氨基酸的氨基酸区域的重组杆状病毒。通过PCR从 人子宫c-DNA文库(Clontech)中扩增C-Kit胞质结构域的编码序列。通过 用BamH I和EcoR I消化使扩增的DNA片段和pFbacGOl载体相容连接。 这些DNA片段的连接产生杆状病毒供体质粒c-Kit。病毒的产生、sf9细 胞中蛋白质的表达和GST融合蛋白质的纯化如下进行病毒的产生将含c-Kit激酶结构域的转移载体pFbacG01-c-Kit转染 DH10Bac细胞系(GIBCO)并将转染的细胞涂布选择性琼脂平板。没有在病 毒基因组中插入融合序列(由细菌携带)的菌落为蓝色。挑取单个白色菌 落并通过标准的质粒纯化程序从细菌中分离病毒DNA (杆状病毒穿梭栽 体)。然后在25cm2摇瓶中使用Cellfectin试剂将病毒DNA转染Sf9或Sf21 细胞(美国典型培养物保藏中心)。Sf9细胞中小^f莫蛋白质表达的测定从转染的细胞培养物中收集含 病毒的培养基并用于感染以增加其滴度。两轮感染之后获得的含病毒的培 养基用于大规模的蛋白质表达。为大规模的蛋白质表达，用5xl(f个细胞/ 平板接种100cm2的圆形组织培养板并用1 mL含病毒的培养基(大约5MOI )感染。3天后从平板上刮下细胞并500转/分离心5分钟。将来自10-20 个100cm2平板的细胞沉淀重悬于50 mL水冷的裂解緩沖液(25mM Tris國HCI， pH7,5， 2mM EDTA， 1% NP画40， 1 mM DTT， 1 mM PMSF )中。 冰上搅拌细胞15分钟然后5000转/分离心20分钟。GST标记的蛋白质的纯化将经离心的细胞裂解物上样到2 mL谷胱 甘肽-琼脂糖柱(Pharmacia)上并用10mL 25 mM Tris-HCI， pH 7.5， 2 mM EDTA， 1 mM DTT， 200 mM NaCl洗涤3次。然后通过25mM Tris-HCI， pH7.5, lOmM还原型谷胱甘肽，100mMNaCl， lmMDTT， 10%甘油洗 脱GST标记的蛋白质10次(每次1 mL)并存于-70X:。酶活性的测量在30^1终体积中进行纯化GST-c-Kit的酪氨酸蛋白激 酶测定，其中所述的30^1终体积中含200-1800ng酶蛋白质(取决于比活 性)，20 mM Tris-HCl， pH 7.6， 3 mM MnCl2， 3 mM MgCl2， 1 mM DTT， IOHM Na3V04， 5 ng/mL聚(Glu， Tyr) 4: 1， 1 % DMSO， 1.0 nM ATP和 0.1nCi[ 3PATP。在存在或不存在抑制剂条件下通过测量[,PATP的33P 至聚(Glu， Tyr)4: 1底物的掺入来测定活性。在如下所述的条件下在96孔 板中室温20分钟进行测定(30nL)并通过加入20nl的l25 mM EDTA终止。 随后将40^L反应混合物转移到预先用甲醇浸泡5分钟的 Immobilon-PVDF膜上(Millipore， Bedford, MA，美国)，用水漂洗，然后用 0.5% H3P04浸泡5分钟并且将其置于断开真空源的多头真空抽吸装置上。 点上所有的样品后，连接真空并用200nL0.5。/。H3PO4漂洗每一个孔。移出 膜并在摇床上用1.0% H3P04洗涤4次，用乙醇洗涤一次。在环境温度下 干燥并置于Packard TopCoimt 96孑L架上，加入10 pL/孔的Microscint TM(Packard)后，对膜进行计数。通过一式两份的每一种化合物的四个浓 度(通常为0.01、 0.1、 1和10nM)的抑制百分比的线性回归分析计算ICso 值。 一个蛋白激酶活性单位定义为37。C下每分钟1纳摩尔33PATP从[Y"P
ATP转移到每毫克底物蛋白质。本发明式IA化合物的ICs。值优选为 50nM-500nM。抗EDhB4活性的试验式IA的化合物作为肝配蛋白B4受体(EphB4)激酶抑制剂的功效证明 如下Bac-to-BacTM (Invitrogen Life Technologies,巴塞尔，瑞士) GST-融合 表达载体的生成借助PCR从来自人胎盘或脑的cDNA文库扩增EphB 类的完整胞质编码区。产生重组杆状病毒，它们表达人EphB4受体 (SwissProt数据库，登记号P54760)的第566 - 987位氨基酸区域。将GST 序列克隆入pFastBacl⑧栽体(Invitrogen Life Technologies,巴塞尔，瑞士) 并进行PCR扩增。将可读框3'端连有GST序列的编码EphB4受体结构 域的cDNA分别克隆到这种经修饰的FastBacl载体，生成pBac-to-BacTM 供体载体。接种转化产生的单一菌落，得到过夜培养物，用于小,的质 粒制备。质粒DNA的限制酶分析揭示了若干菌落含有预期大小的插入片 段。借助自动测序，在两条链上都证实有插入片段和约50bp的侧翼栽体 序列。病毒的产生除非另行说明，按照由GIBCO提供的方案制备用于各 激酶的病毒。简言之，将含有激酶结构域的转移载体转染DH10Bac细胞 系(GIBCO)，涂布选择性琼脂平板。融合序列未插入病毒基因组(由细菌携 带)的菌落是蓝色的。挑取单一的白色菌落，借助标准质粒纯化程序从细菌 中分离病毒DNA(杆状病毒穿梭载体)。然后按照该方案，使用Cellfectin 试剂，用有病毒DNA的25 112培养瓶中转染Sf9细胞或Sf21细胞。GST标记的激酶的纯化将经离心的细胞裂解物上样到2 mL谷胱甘 肽-琼脂糖柱(Pharmacia)上并用10mL 25 mM Tris-HCI， pH 7.5， 2 mM EDTA， 1 mM DTT， 200 mM NaCl洗涤3次。然后通过25mM Tris-HCI， pH7.5， lOmM还原型谷胱甘肽，100mMNaCl， lmMDTT， 10%甘油洗 脱GST标记的蛋白质10次(每次1 mL)并存于-70。C。蛋白激酶测定通过测定"P从[y"P]ATP向谷氨酸与酪氨酸的聚合物 (poly(Glu，Tyr))底物的掺入，在有或没有抑制剂的存在下测定蛋白激酶的 活性。环境温度下在最终体积30pL中用纯化GST-EphB (30ng)进行激酶测定达15-30min，所述最终体积30^L含有20mM Tris,HCl， pH 7.5， 10mM MgCl2， 3-50mM MnCl2， O.OlmM Na3V04， 1% DMSO， ImM DTT, 3pg/mL聚(Glu，Tyr) 4:1 (Sigma; St. Louis, Mo"美国)和2.0-3.0|iiM ATP (H33PI-ATP0.1nCi)。加入20nL125mMEDTA终止测定。随后将40nL反 应混合物转移到预先用甲醇浸泡5分钟的Immobilon-PVDF膜上(Millipore， Bedford, MA,美国)，用水漂洗，然后用0.5% 11^04浸泡5分钟并且将其 置于断开真空源的多头真空抽吸装置上。点上所有的样品后，连接真空并 用200fiL0.5。/oH3PO4漂洗每一个孔。移出膜并在摇床上用1.0。/oH:jP04洗 涤4次，用乙醇洗涤一次。室温干燥后对膜计数并置于Packard Top Count 96孔支架中，加入10 jiL/孔的Microscint TM (Packard)。通过一式两份的 每一种化合物的四个浓度(通常为0.01、 0.1、 l和10jiM)的抑制百分比 的线性回归分析计算ICs。值。 一个蛋白激酶活性单位定义为37'C下每分钟 1纳摩尔33P ATP从[y"PATP转移到每毫克底物蛋白质。本发明式IA化 合物的ICs。值优选为50nM-500nM。 抗EGF-R活性的试验可以使用已知方法证明EGF-R酪氨酸激酶活性的抑制，例如使用 EGF-受体的重組细胞内结构域EGF-RICD;参见，例如E.McGlynn等 人，Europ. J. Biochem. 207， 265-275(1992)。与没有抑制剂的对照相比，式 IA化合物抑制酶活性达到50%(1(:5())的浓度为例如0.05-500pM。除了抑制EGF-R酪氨酸激酶活性外，式IA化合物还抑制该受体家族 的其他成员，如ErbB-2。抑制活性(ICso)约为0.01-5(%iM。可以测定ErbB-2 酪氨酸激酶(/f^ -2)的抑制，例如类似用于EGF-R蛋白质酪氨酸激酶的方 法[参见C. House等人，Europ. J. Biochem. 140， 363-367(1984)。ErbB-2 激酶可以通过本身已知的方法^皮分离并测定其活性，例如按照T. Akiyama 等人的方法Science 232， 1644(1986)。抗VEGF-R2(KDR)活性的试验VEGF-诱导的受体自身磷酸化的抑制可以采用另一细胞中的体外试验证实，例如将转染的CHO细胞(其永久性表iiA VEGF-R2受体(KDR)) 接种于6-孔细胞培养板中的完全培养基(含有10。/。胎牛血清-FCS)中，于 37。C在5% C02中培养直到它们显示约80%汇合。然后将待测化合物在培 养基(不含FCS，含有0.1。/。牛血清白蛋白)中稀释并加入细胞中。(对照含 有培养基但不含受试化合物)。在37'C下培养2小时后，加入重组VEGF， 使VEGF的终浓度为20 ng/mL。再于37。C温育5分钟后，将细胞用冰冷 的PBS(磷酸盐緩沖液)洗涤两次，立即在每孔IOO !xL的裂解緩冲液中裂解。 然后将裂解物离心除去细胞核，上清液中蛋白质的浓度采用商业化的蛋白 质分析法(BIORAD)进行测定。然后，裂解物可以立即使用，或者如果需 要的话，存放于-2(TC。进行夹心ELISA以测定VEGF-R2的磷酸化作用将VEGF-R2的单 克隆抗体(例如Mab 1495.12.14，由H. Towbin， Novartis制备，或类似的 单克隆抗体)固定在黑色的ELISA板(OptiPlateTM HTRF-96，得自Packard) 上。然后洗涤平板，剩余的游离蛋白质结合位点在含有Tween20⑧(聚氧乙 烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯，ICI/Uniquema)(PBST)的磷酸盐緩冲液中 用3% TopBlock (Juro，目录号TB232010)进行饱和。然后将细胞裂解物 (每孔20吗蛋白质)和与碱性磷酸酶偶联的抗磷酸酪氨酸抗体(PY20:AP, 得自Zymed)—起在这些板中于4。C温育过夜。将平板再次洗涤后，采用发 光AP底物(CDP-Star，即开即用型，含有Emerald II， Applied Biosystems) 证明抗磷酸酪氨酸抗体与捕获的磷酸化受体的结合。在Packard Top Count Microplate闪烁计数器中测定发光。阳性对照(采用VEGF刺激)的信号和 阴性对照(没有采用VEGF刺激)的信号的差异对应于VEGF-诱导的 VEGF-R2磷酸化(=100%)。受试物质的活性以VEGF-诱导的VEGF-R2 磷酸化的抑制百分率进行计算，其中诱导产生最大抑制的一半的物质浓度 定义为ICs。(达到50。/。抑制的抑制剂量)。可以发现本发明的式IA化合物优 选的IQ。值的范围为20pM至500|liM之间。抗重组蛋白激酶Ret(Ret-Men2A)、 Tie-2(Tek)和FGFR3-K650E活性 的试验重组蛋白激酶的克隆和表达(Ret);采用杆状病毒供体栽体 pFB-GSTX3产生重组杆状病毒，其表iiA RET-Men2A的胞质激酶结构 域的第658-1072位氨基酸区域，该激酶结构域对应Ret的野生型激酶结构 域。使用获自 Dr. James Fagin， College of Medicine, University of Cincinnati(Novartis 7>司)的质粒pBABEpuro RET曙Men2A经PCR扩增 Ret胞质结构域的编码序列。使所扩增的DNA片段和pFB-GSTX3载体适 于通过Sail和Kpnl消化的连接。这些DNA片段的连接产生杆状病毒供 体质粒pFB-GX3-Ret(-Men2A)。(Tie曙2/Tek): 4吏用杆状病毒供体载体pFbacGOl产生表i^A Tek胞质 激酶结构域第773-1124位氨基酸的氨基酸区域、N-末端融合了 GST的重 组杆状病毒(由Marm6博士根据研究协作提供，Institute of Molecular Medicine, Frdburg，德国)。将Tek通过EcoRI切割并与被EcoRI消化的 pFbacG01(FBG-Tie2/Tek)连接，重新克隆到pFbacGOl转移载体中。(FGFR-3-K650E):使用杆状病毒供体载体pFastBacGST2产生表iiA FGFR-3胞质激酶结构域第411-806位氨基酸的氨基酸区域、N-端融合了 GST的重组杆状病毒(由Jim Griffin博士根据研究协作提供，Dana Farber Cancer Institute, Boston,美国)。通过PCR扩增编码第411-806位氨基酸 的DNA，插入pFastBac-GT2载体，得到pFB-GT2-FGFR3-wt。随后通过 使用Stratagene XL-Site定点突变试剂盒，用该质粒产生在K650有突变， 编码FGFR3(411-806)的载体，即pFB-GT2-FGFR3-K650E。病毒的生产、 sf9细胞中蛋白质的表达和GST融合蛋白的纯化按照下述部分进行。病毒的制备将含有激酶结构域的转移载体转染DH10Bac细胞系 (GIBCO),并将转染的细胞涂布选择性的琼脂平板。病毒基因组(由细菌携 带)中未插入融合序列的菌落为蓝色。挑取白色的单菌落，通过标准的质粒 纯化方法从细菌中分离病毒DNA(杆状病毒穿梭栽体)。然后在25cm2培养 瓶中，使用Cellfectin试剂以病毒DNA转染Sf9细胞或SOI细胞。Sf9细胞中小规^f莫蛋白质表达的测定从转染的细胞培养物中收集含 病毒的培养基并用于感染以增加其滴度。两轮感染之后获得的含病毒的培养基用于大M的蛋白质表达。为大,的蛋白质表达，用5xl(f个细胞/ 平板接种100cm2的圆形组织培养板并用1 mL含病毒的培养基(大约5 MOI )感染。3天后从平板上刮下细胞并500转/分离心5分钟。将来自10-20 个100cm2平板的细胞沉淀重悬于50 mL冰冷的裂解緩冲液(25mM Tris-HCI， pH7.5， 2mM EDTA， 1% NP-40， 1 mM DTT， 1 mM PMSF )中。 冰上搅拌细胞15分钟然后5000转/分离心20分钟。GST标记的蛋白质的纯化将经离心的细胞裂解物上样到2 mL谷胱 甘肽-琼脂糖柱(Pharmacia)上并用10mL 25 mM Tris國HCI， pH 7.5， 2 mM EDTA， 1 mM DTT， 200 mM NaCl洗涤3次。然后通过25mM Tris-HCI， pH7.5, lOmM还原型谷胱甘肽，100mM NaCl， lmMDTT， 10%甘油洗 脱GST标记的蛋白质10次(每次1 mL)并存于-70X:。酶活性的测量在30nl终体积中进行用纯化的GST-Ret、 GST-Tek或 GST-FGFR-3-K650E的酪氨酸蛋白激酶测定，其中所述的30jU终体积中 含有15ng GST-Ret的Ret、 20mM Tris國HCl pH 7.5、 lmM MnCl2、 10 mM MgCl2、 lmM DTT、 3|Lig/mL聚(Glu，Tyr) 4:1、 1% DMSO和2.0 pM ATP(0.1pCi的Y-[33p-ATP)的终浓度。Tek包含150 ng GST-Tek、 20mM Tris-HCl pH 7.5、 3mM MnCl2、 3 mM MgCl2、 lmM DTT、 O.OlmM Na3V04、 250 ng/mLPEG20，000、 10 pg/mL聚(Glu，Tyr) 4: 1、 1% DMSO和4.0 ATP(0.1|uCi 的y-[33P]-ATP) 。
FGFR-3-K650E 包含 10 ng GST-FGFR-3-K650E、 20mM Tris画HCl pH 7.5、 3mM MnCl2、 3 mM MgCl2、 lmM DTT、 O.OlmM PEG 20，000、 10 jtg/mL多聚(Glu，Tyr) 4: 1、 1% DMSO和4.0 ATP(0.1|nCi的Y-卩3p-ATP)。在存在或不存在抑制剂条件 下通过测量[Y"P]ATP的33P至聚(Glu， Tyr)4: 1底物的掺入来测定活性。 试验在环境温度下按下述条件于96孔板中进行30分钟，通过加入50 的125mM EDTA终止试验。随后将60^L反应混合物转移到预先用甲醇浸 泡5分钟的Immobilon-PVDF膜上(Millipore， Bedford, MA，美国)，用水 漂洗，然后用0.5% H3P04浸泡5分钟并且将其置于断开真空源的多头真 空抽吸装置上。点上所有的样品后，连接真空并用200nL0.5。/oH3PO4漂洗每一个孔。移出膜并在摇床上用1.0%11^04洗涤4次，用乙醇洗涤一次。 在环境温度下干燥并置于Packard TopCount 96孔架上，加入10 ^L/孔的 Microscint TM(Packard)后，对膜进行计数。通过一式两份的每一种化合 物的四个浓度(通常为0.01、 0.1、 l和10jiM)的抑制百分比的线性回归 分析计算ICso值。一个蛋白激酶活性单位定义为37'C下每分钟1纳摩尔33P ATP从[ 4ATP转移到每毫克底物蛋白质。本发明式IA化合物的IC50 值优选为50nM-500jiM。 FGFR3(酶试验)在^f^积为lOfiL的含有0.25|ng/mL酶的激酶緩沖液(30mM Tris-HCI pH7.5、 15mM MgCl2、 4.5mM MnCl2、 15pM Na3V04和50|ig/mL BSA) 和底物(5jig/mL生物素-聚-EY(Glu，Tyr)(CIS-US，Inc.)和3nM ATP)的溶液 中，使用纯化的FGFR3(Upstate)进行激酶分析。制备两种溶液首先将含 有在激酶緩沖液中的FGFR3酶的5pL的第一种溶液加入384-型 ProxiPlate⑧(Perkin-Elmer)板，随后加入溶于DMSO的50nL的化合物， 然后，将含有在激酶緩冲液中的底物(聚-EY)和ATP的5^1的第二种溶液 加入每一孔中。反应于室温下温育1小时，加入10pL的HTRF测试混合 物终止，所述HTRF测试混合物含有30mMTris-HClpH7.5、 0.5MKF、 50mMETDA、 0.2mg/mLBSA、 15|Hg/mL链霉抗生物素-XL665(CIS誦US， lnc.)和150ng/mL缀合穴合物的抗磷酸酪氨酸抗体(CIS-US， Inc.)。于室 温下温育1小时后，使链霉抗生物素-生物素相互作用，在Analyst GT(Molecular Devices Corp.)上读取随时间改变的荧光信号。根据每一化 合物在12个浓度下(从50|aM到0.28nM的1:3稀释)的抑制百分率的线性 回归分析计算ICso值。在该分析中，例如本发明化合物优选的ICs。的范围 是2nM至400pM之间，更加优选的范围是5 nM至100pM之间。FGFR3(细胞试验)测试本发明化合物(=式IA化合物)抑制转化的Ba/F3-TEL-FGFR3 细胞增殖(取决于FGFR3细胞激酶的活性)的能力。Ba/F3-TEL-FGFR3在 悬浮液中培养至多达800,000细胞/mL，用补充10%胎牛血清的RPMI1640作为培养基。将50pL培养基中的细胞以每孔5000个细胞的密度分别加入 384-孔板中。本发明化合物在二甲基亚砜(DMSO)中溶解和稀释。用DMSO 制备12个1:3的系列稀释液以产生范围通常在lOmM到0.05|iM的浓度 梯度。将50nL的稀释化合物加到细胞中，在细胞培养箱中培养48小时。 将AlamarBlue (TREK Diagnostic Systems)(可用于监测由增殖细胞产生 的还原性环境)加入细胞，终浓度达到10%。在37'C的细胞培养器中再培 养4小时后，在Analyst GT(Molecular Devices Corp.)上定量测定被还原的 AlamarBlue⑧的荧光信号(于S30nm激发，于580nm发射)。根据每个化合 物12个浓度的抑制百分率的线性回归分析来计算IC知值。可以发现本发 明的式IA化合物优选的IC5。的范围是2nM至400jiM之间。Upstate KinaseProfileTM-放射-誇波滤膜(filter)结合测定法 对本发明化合物抑制一组激酶的各成员(部分的非限定性的激酶名单 包括Abl、 BCR画Abl、 BMX、 FGFR3、 Lck、 JNK1、 JNK2、 CSK、 RAF、 MKK6和P38)的能力进行评价。按照常规方法两次测定终浓度为10pM 的化合物。需要注意的是激酶緩冲液成分和底物随"Upstate KinaseProfilerTM"组中包含的激酶的不同而变化。在置于水上的eppendorf 管中混合激酶緩沖液(2.5nL， 10x,必要时可含有MnCl2)、活化的激酶 (0.001-0.01单位；2.5pL)、在激酶緩冲液中的特异性或聚(Glu4-Tyr)的肽 (5-500jiM或0.01mg/ml)，以及激酶緩冲液(50pM; 5|Lil)。加入Mg/ATP混 合物(10pL; 67.5(或33.75) mM MgCl2、 450(或225) |iM ATP和ljuCi/pl [Y-"P]-ATP(3000Ci/mmol))并在约30。C下温育反应物约10分钟。将反应混 合物(20pl)点在2cmx2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电的肽底物)或 Whatman No.l(用于聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形纸上。用0.75%磷酸洗涤该 方形纸4次，每次5分钟，并用丙酮洗涤一次，洗涤5分钟。将该方形纸 转移到闪烁管中，加入5ml闪烁混合液并用Beckman闪烁计数器定量掺 入肽底物中的"P(cpm)。计算每个反应的抑制百分率。式IA化合物也可以抑制其他酪氨酸蛋白激酶，例如特别是c-Src激酶， 其在动物、特别是哺乳动物细胞(包括人类细胞)的生长调控和转化中起到一定作用。适宜的试验描述于Andrejauskas-Buchdunger等人，Cancer Res. 52， 5353-8(1992)。使用该检测体系，式IA化合物可以显示出抑制c-Src 的IC5o值的范围为例如0.05-500nM。另外，式IA化合物还可以用于抑制b-raf(V599E)。 B-Raf-V599E的 活性通过测量33P从[y"PATP向(His)-InB的掺入，在有或没有抑制剂的 存在下进行测定。将待测化合物溶于DMSO(10mm)并储存于-2(TC。新鲜 制备在DMSO中的系列稀释液，用纯水进一步稀释以获得在3% DMSO 中的3倍浓缩的测试溶液。试验的终体积(30 pl)包括10pL的待测溶液(1% DMSO)、 10|nl测试混合物(20 mM Tris画HCl， pH 7.5， 3 mM MnCl2， 3 mMmgCl2， 1 iiM DTT， 3 pg/ml的(His)-lKB、 1% DMSO和3.5 ^VI ATP |y33p_ATp o.i pCi)以及lOpl酶稀释液(600ng的GST-B-Raf-V599E)。在96-孔形式的MultiPROBE Iix、 MultiPROBE IILx或HamiltonSTAR自动装 置上进行程序性的移取步骤，按照文献所述进行试验(参见C. Garcia-Echeverria等人，Cancer Cel.. & 231-9(2004))，通过加入20 pi 125 mMEDTA来终止。通过如下的滤膜结合方法进行磷酸化的肽的捕获将 40fiL反应混合物转移到预先用甲醇浸泡5分钟的Immobilon-PVDF膜上， 用水漂洗，然后用0.5% H3P04浸泡5分钟并且将其置于断开真空源的多 头真空抽吸装置上。点上所有的样品后，连接真空并用200nL0.5%H3PO4 漂洗每一个孔。移出膜并在摇床上用1.0% H3P04洗涤4次，用乙醇洗涤 一次。在环境温度下干燥并置于Packard TopCount %孔架上，加入10 jnL/ 孔的MicroscintTM(Packard)后，对膜进行计数。最后密封平板并在微孔 板闪烁计数器(TopCount NXT， TopCount NXT HTS)中进行计数。在闪板 方法(flash plate method)的情况下，首先在聚苯乙烯基质的塑料平板上进 行激酶反应，随后于60分钟后加入20^1的125mM EDTA终止。为了捕 获(60分钟，RT)，将生物素化的底物转移至Nickel-包被的闪板上。将测试 平板用PBS洗涤三次，并在室温下干燥。随后，将平板密封，在微孔板闪 烁计数器(TopCount NXT， TopCount NXT HTS)中进行计数。通过每个化 合物四种浓度(通常为0.01、 0.1、 1和l(HiM)下(一式两份)的抑制百分率或按照从10^M开始、随后1: 3稀释度的8个单一点的抑制百分率的线 性回归分析来计算ICs。值。对于b-raf抑制，式IA化合物优选显示范围从 0.05到500|iiM的ICs。值。FLT3受体激酶为了寻找靶向于FLT3的化合物，可以采用两种不同类型的试验Flt3激酶活性测定如下使用杆状病毒供体载体pFbacG01(GIBCO) 产生重组杆状病毒，其表达人Flt3的细胞质激酶结构域的第563-993位氨 基酸的氨基酸区域。从人cDNA文库(Clontech)中通过PCR扩增Flt3胞质 结构域的编码序列。使所扩增的DNA片断和pFbacGOl栽体适于通过 BamHl和HindIII消化的连接。这些DNA片断的连接产生杆状病毒M 质粒Flt-3(1.1)。按照如下描述进行病毒的制备、在Sf9细胞中表达蛋白质 和纯化GST-融合蛋白病毒的制备将含有Flt-3激酶结构域的转染载体(pFbacG01-Flt-3)转 入DH10Bac细胞系(GIBCO)并将转染的细胞涂布于选择性的琼脂平板。 病毒基因组(由细菌携带)中未插入融合序列的菌落为蓝色。湘t取单个白色 菌落并通过标准的质粒纯化程序从细菌中分离病毒DNA(杆状病毒穿梭载 体)。然后在25cm2摇瓶中使用Cellfectin试剂将病毒DNA转染Sf9或Sf21 细胞(美国典型培养物保藏中心)。Sf9细胞中小^f莫蛋白质表达的测定从转染的细胞培养物中收集含 病毒的培养基并用于感染以增加其滴度。两轮感染之后获得的含病毒的培养基用于大^!^莫的蛋白质表达。为大M^莫的蛋白质表达，用5xl(T个细胞/ 平板接种100cm2的圓形组织培养板并用1 mL含病毒的培养基(大约5 MOI )感染。3天后从平板上刮下细胞并500转/分离心5分钟。将来自10-20 个100cm2平板的细胞沉淀重悬于50 mL冰冷的裂解緩冲液(25mM Tris-HCI， pH7.5， 2mM EDTA， 1% NP-40,1 mM DTT， 1 mM PMSF )中。 水上搅拌细胞15分钟然后5000转/分离心20分钟。GST标记的蛋白质的纯化将经离心的细胞裂解物上样到2 mL谷胱甘肽-琼脂糖柱(Pharmacia)上并用10mL 25 mM Tris-HCI， pH 7.5， 2 mM EDTA， 1 mM DTT， 200 mM NaCl洗涤3次。然后通过25mM Tris-HCI， pH7.5， 10mM还原型谷胱甘肽，lOOmMNaCl， lmMDTT， 10%甘油洗 脱GST标记的蛋白质10次(每次1 mL)并存于-70"C 。酶活性的测量在30^1终体积中进行纯化GST-Flt2的酪氨酸蛋白激 酶测定，其中所述的30pl终体积中含200-1800ng酶蛋白质(取决于比活 性)，20 mM Tris誦HCl， pH 7.6， 3 mM MnCl2， 3 mM MgCl2， 1 mM DTT， 10nM Na3V04， 3 jig/mL聚(Glu， Tyr) 4: 1， 1 % DMSO， 6.0 jiM ATP和 0.1nCi[ 3Pl ATP。在存在或不存在抑制剂条件下通过测量[ SpATP的33P 至聚(Glu， Tyr)4: 1底物的掺入来测定活性。在如下所述的条件下在96孔 板中室温20分钟进行测定(30nL)并通过加入20jd的125 mM EDTA终止。 随后将40jiL反应混合物转移到预先用曱醇浸泡5分钟的 Immobilon-PVDF膜上(Millipore， Bedford, MA，美国)，用水漂洗，然后用 0.5% H3P04浸泡5分钟并且将其置于断开真空源的多头真空抽吸装置上。 点上所有的样品后，连接真空并用200nL0.5。/。H3PO4漂洗每一个孔。移出 膜并在摇床上用1.0% H3P04洗涤4次，用乙醇洗涤一次。在环境温度下 干燥并置于Packard TopCount 96孑L架上，加入10 pL/孔的Microscint TM(Packard)后，对膜进行计数。通过一式两份的每一种化合物的四个浓 度(通常为0.01、 0.1、 1和10 nM)的抑制百分比的线性回归分析计算ICso 值。 一个蛋白激酶活性单位定义为37。C下每分钟1纳摩尔33PATP从Y"P
ATP转移到每毫克底物蛋白质。式IA化合物在此优选地显示ICso值范围 从0.05到500 ^M之间。替代地或另外地，基于细胞的试验可用于鉴定突变的FLT3酪氨酸激 酶受体的抑制剂。常规方法包括对依赖突变的FLT3进行增殖的细胞系与 不依赖突变的FLT3进行增殖的细胞系，将可能的抑制剂的作用进行比较。 使用表达两种不同类型突变的、激活的FLT3的细胞系在受体近膜结构域内表达具有"内部串联重复"(ITD)的FLT3突变体 的Ba/F3-FLT3-ITD细胞。表达含有第835位的天冬酰胺转变成酪氨酸突变的FLT3受体的 Ba/F3画FLT3画D835Y细胞。IC5o值在50nM至500|iM的式IA化合物优选显示出抑制 Ba/F3-FLT3-ITD和Ba/F3-D835Y细胞的增殖，另一方面，它们在高达 500nM的浓度下通常不抑制未转化的Ba/F3细胞的生长，且式IA化合物 对Ba/F3-FLT3-ITD细胞的生长抑制作用可通过加入高浓度的IL-3以提供 替代的生存信号而逆转。在抑制FLT3-依赖性细胞系增殖所需的浓度下， 式IA的化合物显示出对于一些不具有突变的FLT3受体(过度活化的激酶) 的人类白血病与淋巴瘤细胞系没有细胞毒性，提示该药物作为细胞毒的药 物具有意料不到的高度特异性。总体而言，这些结果说明式IA化合物可 以成为突变的FLT3受体酪氨酸激酶活性的有效抑制剂，是用于治疗具有 突变的FLT3受体的患者的有希望的候选物。具体而言，式IA化合物可以 在0.05到500|aM的浓度范围内显示出抑制FLT3受体酪氨酸激酶的活性。根据上文所述的抑制性研究，本发明的式IA(或其例举的式)化合物表 现出特别是对依赖(尤其是对蛋白激酶的调节有响应、更特别是抑制)蛋白 激酶的疾病的治疗功效，所述疾病尤其是增生性疾病，如上文在"发明背 景"中所述的疾病。还有一些试验证明式I化合物的体内抗肿瘤活性。例如，为了检测式 IA的化合物是否抑制膀胱癌的生长，可以采用以下检测系统使用RT-112人膀胱移行细胞癌细胞系作为检测本发明所述化合物体 内活性的体内模型。该细胞系源自在1973年具有未治疗的原发性膀胱癌的 女性患者(年龄未知)。该细胞系表达高水平的FGF-R3。将5 x106细胞与基质胶同时接种在雌性棵鼠的胁部(11=8)，并使肿瘤发 育。每2或3天使用卡尺手工测量肿瘤尺寸。将动物重量作为动物健康的 量度进行监测。当肺瘤体积达到约100mmS(约7天)时，开始用抑制剂治疗。将小鼠根 据肿瘤体积随机分配，用介质(NMP/PEG300)或待测化合物(i^8)处理14 天。给药途径为口腔管饲，时间表为每天l次/每周7次。将抗肿瘤活性计算为T/C %((处理组动物肿瘤体积的平均改变/对照动物肿瘤体积的平均改 变)x 100)。用卡尺手工测量异种移植物肿瘤的尺寸，并采用式(W x H x L) x 7t/6 估计肿瘤的体积，其中宽度(W)、高度(H)和长度(L)是三个最大直径。使用SigmaStat 2.03进行统计学评价。如果一项试验中包括了超过两 组动物，则在评价当天采用单因素方差分析检验，进行肿瘤绝对体积和体 重的统计学评价。当对照组与所有其他处理组比较时，使用Dunnett事后 检验法(Dunnett，s ad hoc post test)。当所有组相互之间进行评价时，使用 Tukey和SNK(Student-Newman曙Keuls)事后检验法。肿瘤样品被切碎并迅速在液氮中冷冻。在保持冷冻的同时将肿瘤粉末 化。将一小份冻干粉在包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1。/。Triton提取緩冲 液中裂解。通过离心^f吏裂解液澄清，测定蛋白质浓度。使用蛋白质裂解物 测定肿瘤中的FGFR受体和通路的抑制程度。本发明所述的式IA化合物可以在等于和大于10mg/kg的剂量上抑制 肿瘤生长和诱导消退。作为被公开的式IA化合物抑制的激酶例子可以是c-Abl和Bcr-Abl， 特别是Bcr-Abl。另一种被抑制的激酶是受体酪氨酸激酶VEGF-R，特别 是VEGF受体KDR(VEGF-R2)。本发明的化合物还抑制Bcr-Abl激酶的 突变形式。所公开的化合物适宜用于抑制一种或多种这类蛋白质酪氨酸激 酶和/或其他蛋白质酪氨酸激酶和/或非受体酪氨酸激酶Raf，和/或用于抑 制这些酶的突变体。考虑到这些活性，所述化合物可以用于治疗涉及这些 类型的激酶、特别是所述激酶的异常或过度的活性的疾病(特别是所提及 的那些疾病)。调节这类蛋白激酶活性的能力优选涉及抑制这类蛋白激酶的活性。 例如，作为VEGF-受体酪氨酸激酶活性抑制剂，本发明的化合物能基 本抑制血管的生长，并因此对于大量与血管发生失控相关的疾病有效，所 述疾病特别是由目艮部新生血管生成造成的疾病，特别是视网膜病变，例如 糖尿病视网膜病或年龄相关的黄斑变性、银屑病、成血管细胞瘤，例如血48管瘤、肾小球膜细胞增生性病症，如慢性或急性肾病，例如糖尿病肾病， 恶性肾硬化、血栓性fc&L管病综合征或移植排斥，或特别是炎性肾病如肾 小球肾炎，特别是肾小球膜增生性肾小球肾炎，溶血性尿毒症综合征、糖 尿病肾病、高血压肾硬化、粥样斑、动脉再狭窄、自身免疫性疾病、糖尿 病、子宫内膜异位症、慢性哮喘以及特别是肿瘤疾病(实体瘤，还有白血病和其他"液体肿瘤"，特别是那些表达c-kit、 KDR、 Flt-l或Flt-3的肺 瘤)，例如特别是乳腺癌、结肠癌、肺癌(特别是小细胞肺癌)、前列腺癌 或卡波西肉瘤。式IA(或其例举的式)的化合物(或其N-氧化物)抑制肿瘤的 生长并特别适于预防肿瘤的转移性传播和孩i转移灶的生长。本发明化合物的一类激酶靶点是Bcr-Abl的突变体。特别是突变体 Glu255—亮氨酸、Glu255—缬氨酸或Thr315—异亮氨酸，更特别的是 Thr315—异亮氨酸突变体。其他Bcr-Abl突变体包括Met244—Val、 Phe317—Leu、 Leu248—Val、 Met343—Thr、 Gly250—Ala、 Met351—Thr、 Gly250—Glu、 Glu355—Gly、 Gln252—His、 Phe358—Ala、 Gln252—Arg、 Phe359—Val、 Tyr253—His、 Val379—Ile、 Tyr253—Phe、 Phe382—Leu、 Glu255—Lys、 Leu387—Met、 Glu255—Val、 His396—Pro、 Phe311—Ile、 His396—Arg、 Phe311~>Leu、 Ser417—Tyr、 Thr315—Ile、 Glu459—Lys和Phe486—Ser。式IA化合物特别用于通过抑制Flt-3的酪氨酸激酶结构域来治疗 AML。本发明的另一个实施方案是治疗急性骨髓性白血病(AML)的方 法，其包括施用治疗有效量的所述化合物。式IA化合物(或其特别是可药用盐)，由于它们抑制FGFR的活性，尤 其可用于治疗(尤其是异常的)生长、组织修复、重构；细胞迁移、细胞 分化、骨骼肌和/或四肢发育、伤口愈合、信号转导、血细胞生成和/或血 管发生以及肿瘤发生，或者肿瘤或癌症，包括转移灶和转移灶的形成，特 别是用于治疗人类肿瘤，如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(头和颈部)、乳腺 癌、胃癌，例如胰腺癌、卵巢癌、结肠癌和/或前列腺癌以及星形细胞瘤、 神经胶质瘤、膀胱癌、上皮癌，例如膀胱或子宫内膜上皮癌，多发性骨髓瘤、鳞状细胞癌(头和颈部)，例如口腔鳞状细胞癌，成视网膜母细胞瘤，肉瘤，例如滑膜癌和/或皮肤肿瘤；8pl1骨髄增生综合征-嗜酸性骨髓增生 综合征(EMS);骨骼畸形、人类侏儒症，包括软骨发育不全、颅缝早闭综 合征和侏儒综合征、骨骼发育不良，包括软骨发育不良、伴有发育延迟的 重度软骨发育不全、黑棘皮症、致死性骨发育不全、颅缝早闭表型，例如 Muenke冠状颅缝早闭或伴有黑棘皮症的克鲁宗综合征，变弗综合征、软 骨细胞成熟受限、骨生长抑制；炎性或自身免疫疾病，例如类风湿关节炎 (RA)、 II型胶原关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疳(SLE)、银 屑病、幼年型糖尿病、舍格伦病、曱状腺疾病、肉瘤病、自身免疫性眼葡 萄膜炎、炎性肠病(克罗恩病或和溃痴性结肠炎)、乳糜泻和/或重症肌无力； 常染色体显性的血磷酸盐过少的佝偻病(ADHR)、 X-染色体连锁的血磷酸 盐过少的佝偻病(XLH)、肿瘤诱导的骨软化症(TIO)、骨纤维性结构不良 (FH);慢性梗阻性肺疾病(COPD);肥胖症、糖尿病和/或与其相关的疾病， 例如代谢综合征、心血管疾病、高血压、异常的胆固醇和甘油三酯水平、 皮肤病(例如感染)、静脉曲张、黑棘皮症、湿疹、运动不耐受、2型糖尿病、 胰岛素抗性、高胆固醇血症、胆石病、矫形外科损伤、血栓栓塞性疾病、 冠脉或血管狭窄(例如动脉粥样硬化)、日间嗜睡、睡眠呼吸暂停、晚期肾 病、胆嚢疾病、痛风、心脏病、免疫应答受损、呼吸功能受损、创伤后感 染、不育症、肝病、下腰痛、产科和妇科并发症、胰腺炎、中风、手术并 发症、压迫性尿失禁和/或胃肠疾病。在哺乳动物软骨中促进局部新生软骨生成的方法包括向软骨局部施用 某些激酶抑制剂，这种方法描述于WO2006/038U2。令人惊奇地是，发现 本文所定义的式IA化合物可以以同样方式使用。因此，本发明还涉及促 进哺乳动物软骨中局部新生软骨生成的方法，其包括以有效促进局部新生 软骨生成的量向软骨局部施用如上文所定义的式IA的脲衍生物或其可药 用盐、水合物、溶剂合物、酯、N-氧化物保护的衍生物、单一异构体和异 构体的混合物或其前药。式IA的化合物还用于治疗在新生软骨生成背景 下的骨关节炎。术语"治疗"也包括预防，其包括例如在发现有突变或改变的病人中 预防性的治疗，所述突变或改变说明它们易于或可能易于发展为疾病，或 者优选对所述疾病、尤其是上述的一种或多种疾病治疗性的(包括但不限于 緩和性的、治愈性的、减轻症状的、减緩症状的、抑制疾病或症状的、延迟i^艮的、调控激酶或抑制激酶的)治疗。优选治疗动物。动物优选温血动物，更优选哺乳动物。人(其通常也涵 盖于通用术语"动物"中)特别是指患者或(例如由于某些突变或其他特征) 易患上下文所定义的疾病风险的人。药物制剂、方法和用途本发明还涉及包含式IA(或其例举的式)的化合物或其N-氧化物作为 活性成分并且可以特别用于治疗上述疾病的药物组合物。本发明的可药用化合物可以用于，例如制备包含作为有效成分的药物 有效量的式IA(或其例举的式)化合物或其可药用盐，与一种或多种无机或 有机、固体或液体的可药用载体一起或混合的药物组合物。本发明还涉及适于对温血动物，特别是人(或者源自温血动物，特别是 人的细胞或细胞系，例如淋巴细胞)进行给药，以用于治疗(在本发明的广 义的方面还包括预防)对抑制蛋白激酶活性有响应的疾病的药物组合物，特 别是上文提到的疾病之一优选使用式IA(或其例举的式)化合物，其包含所 述抑制有效量的新的式IA(或其例举的式)化合物或其可药用的盐(其对所 述抑制有效)和至少一种可药用的载体。特别优选经肠给药例如鼻、口腔、直肠或特别是口服给药，胃肠外给 药，例如静脉内、肌内或皮下给药，对温血动物(特别是人)给药的药物组 合物。该组合物仅包含活性成分或者还优选地包含可药用的载体。活性成 分的剂量取决于所治疗的疾病及对象的种类、年龄、体重和个体情况、个 体的药代动力学数据和给药方式。本发明尤其涉及包含式IA(或其例举的式)化合物、互变异构体、N-氧 化物或其可药用盐或7JC合物或溶剂合物以及至少一种可药用载体的药物组合物。本发明还涉^A类或动物体的预防或特别是治疗方法中的药物组合物 的用途、其制备方法(特别是以肿瘤治疗的组合物形式)和治疗(特别是 肿瘤)疾病、特别是那些上文所提到的疾病的方法。本发明还涉及式IA(或其例举的式)化合物或其N-氧化物在制备包含 作为活性成分的式IA(或其例举的式)化合物或其N-氧化物的药物制剂的 方法和用途。该药物组合物包含约1%至约95。/。的活性成分，在优选的实施方案中 单剂量给药形式包含约20%至约90%的活性成分，在优选的实施方案中非 单剂量型给药形式包含约5%至约20%的活性成分。单位剂量形式是例如 包衣和非包衣的片剂、安瓿剂、小瓶、栓剂或胶嚢。其他剂型是例如软骨 剂、乳剂、贴剂、泡沫剂、酊剂、喷雾剂等。胶嚢的实例包含约0.05g至 约l.Og的活性成分。本发明的药物组合物采用自身已知的方法来制备，例如通过常规的混 合、制粒、包衣、溶解或冷干方法来进行制备。优选使用活性成分的溶液，还可以使用其混悬液或M液，特别是等 渗的水性溶液、分歉液或混悬液，在例如仅包含活性成分或者包含活性成 分和栽体的冷冻干燥组合物的情况中，可以在使用前进行配制。该药物组 合物可进行灭菌和/或可包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或 乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或緩沖剂，并且可以用本身已知 的方式进行制备，例如可以通过常规溶解和冷冻干燥方法制备。所述溶液 或混悬液可包含增加粘度的试剂或增溶剂，如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤 维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。油中的混悬液包含作为油性组分的植物油、常用于注射目的的合成或 半合成油类。可提及的特别是液体脂肪酸酯，其包含具有8-22个，特别是 12-22个碳原子的长链月旨肪酸(作为酸组分)，例如月桂酸、十三烷酸、肉 豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、正二十二烷酸 或相应的不饱和酸，例如油酸、反油酸、芥酸、brasidic acid或亚油酸，如果需要的话，可加入抗氧化剂，例如维生素E、 p-胡萝卜素或3，5-二-叔-丁基-4-羟基甲苯。 这些脂肪酸酯的醇组分具有最多6个碳原子并且是单-或多-羟基例如单-、二-或三-羟基醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇 或其异构体，但特别是乙二醇和甘油。因此，可提及的脂肪酸酯的实例如 下油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、"Labrafil M 2375"(聚氧 乙烯甘油三油酸酯，Gattefoss6，巴黎)、"Miglyol 812"(具有Q至C12的链 长度的饱和脂肪酸的甘油三酯，HtilsAG，德国)，但是特别是植物油，如 棉籽油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、t昧油、豆油且特别是花生油。注射组合物是以常规方式在无菌条件下制备的；也同样适用于无菌条 件下将该组合物引入安瓿或管形瓶中并将该容器密封。用于口服给药的药物组合物可以通过将活性成分与固体栽体组合来获 得，如果需要的话，将所得的混合物制粒并且如果需要或必需的话，在加 入适宜的赋形剂后将该混合物加工成片剂、糖锭剂核或胶嚢。还可以将其 混入到可以使得活性成分以可检测的量扩散或释放的塑性载体中。适宜的载体特别是填充剂，例如糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山 梨醇、纤维素制剂和/或磷酸钩类，例如磷酸三钙或磷酸氢钙；和粘合剂， 例如淀粉糊，例如使用玉米、小麦、7jc稻或马铃薯淀粉的淀粉糊、明胶、 西黄蓍胶、曱基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡 咯烷酮；和/或如果需要的话，崩解剂，如上述淀粉类、和/或羧甲基淀粉、 交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。赋形剂特别 是流动调节剂和润滑剂，例如硅酸、滑石粉、硬脂酸或其盐，如硬脂酸镁 或硬脂酸钓、和/或聚乙二醇。为糖锭剂核提供适宜的、任选为肠溶的包衣， 特别是，可采用可包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/ 或二氧化钛的浓缩的糖溶液，或者在适宜有机溶剂中的包衣溶液，或者， 为了制备肠溶包衣，可采用适宜的纤维素制剂溶液，例如邻苯二曱酸乙基 纤维素或邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素溶液。胶嚢有由明胶制得的干填充的胶嚢和由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的密封的软胶嚢。该干填充 的胶嚢可包含颗粒形式的活性成分，所说的颗粒形式例如可以具有填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉类，和/或助流剂如滑石粉或硬脂酸镁，并且如果需 要的话还可以具有稳定剂。在软胶嚢的情况中，优选将活性成分溶解或混 悬于适宜的油性赋形剂，如脂肪油、石蜡油或液体聚乙二醇中，还可以向 其中加入稳定剂和/或抗菌剂。可以向片剂或糖锭剂包衣或胶嚢壳中加入染 料或颜料，例如为了识别目的或表明活性成分的不同剂量。为片剂核提供适宜的、任选为肠溶的包衣，特别是，可釆用可包含阿 拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛的浓缩的糖溶 液，或者在适宜有机溶剂或溶剂混合物中的包衣溶液，或者，为了制备肠 溶包衣，可采用适宜的纤维素制剂溶液。用于口服给药的药物组合物还包括由明胶构成的硬胶嚢和由明胶和增 塑剂构成的密封的软胶嚢。硬胶嚢可包含颗粒形式的活性成分，所说的颗 粒形式例如可以具混有填充剂、粘合剂和/或助流剂，并任选地具有稳定剂。 在软胶嚢中，优选将活性成分溶解或混悬于适宜的液体赋形剂中，还可以 向其中加入稳定剂和去垢剂。适于直肠给药的药物组合物例如是由活性成分和栓剂基质组合构成的 栓剂。特别适宜用于胃肠外给药的是水溶形式的活性成分(例如水溶性盐) 的水溶液，或者包含增加粘度的物质(例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/ 或葡聚糖)，以及如果需要的话还包含稳定剂的水性注射混悬液。任选地具 有赋形剂的活性成分还可以以冷干的形式，并可以在胃肠外给药前通过加 入适宜的溶剂来将其配制成溶液。所用的溶液，例如用于胃肠外给药的溶液还可以用作输注液。 本发明同样涉及对本文提到的疾病(药理学病症)之一，特别是对酪 氨酸激酶抑制有响应的疾病，更加特别是如上文提到的疾病，更加特别是FGFR，特别是对应的肿瘤性疾病的治疗的过程和方法。式IA(或其例举的 式)的化合物或其N-氧化物(其还包括盐、酯或类似化合物)可以以所述形 式或特别是以药物组合物的形式，优选以对所述疾病有效的量来向动物、 优选是向温血动物，例如人类，优选需要此类治疗的人类来进行预防性或治疗性给药。对于具有约70kg体重的个体而言，每日给药剂量例如约 O.OOlg至约12g，优选例如约O.lg至约3g的本发明化合物。"大约"优选地 表示最多10%的偏差，更加优选分别少于所给数据l。/。的偏差。 "有响应的"疾病是指能够显示可发现的一些有益效果的疾病。 本发明还提供了治疗蛋白激S^赖性疾病的方法，其包括同时或分别 向温血动物(例如人类)联合施用一种或多种细胞生长抑制的或细胞毒的 化合物如Glivec⑧和本发明的化合物。术语"同时"的含义是快速连续地或 在一次给药后立即再次给药。本发明还特别涉及式IA(或其例举的式)的化合物或其N-氧化物、或其 可药用盐，特别是所述优选的式IA(或其例举的式)的化合物或其可药用盐 以所述形式或以与至少一种可药用载体形成的药物制剂形式，用于一种或 多种上文提到的疾病，优选对蛋白激酶抑制有响应的疾病、特别是肿瘤性 疾病、更特别是对Abl酪氨酸激酶抑制有响应的白血病的治疗和预防性处 理的用途。所用的药物制剂(药物)的优选的剂量、组合及其制备方法分别在上 文中描述。式IA(或其例举的式)的化合物还可以与advantage p49其他抗增殖药 物组合。这些抗增殖药物包括但不限于芳香酶抑制剂、抗雌激素药物、拓 朴异构酶I抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、；錄管活性药物、烷化剂、組蛋 白去乙酰酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、COX-2抑制剂、MMP抑制剂、 mTOR抑制剂、抗肿瘤的抗代谢物、铂化合物、降低蛋白激酶活性和ATP 酶活性的化合物、进而抗血管生成的化合物、戈那瑞林激动剂、抗雄激素 药物、bengamides、 二膦酸盐、抗增殖的抗体、替莫唑胺(TEMODAL⑧)、 甾类药物(如地塞米松)、蛋白酶体抑制剂(如万珂和/或反应停)。本文中所用的术语"芳香酶抑制剂"涉及抑制雌激素生成，即抑制底物 雄甾烯二酮和睾酮各自转化为雌素酮和雌二醇的化合物。该术语包括但不 限于甾类，特别是依西美坦和福美坦；以及特别是非甾类，特别是氨鲁米 特、氟氯唑、法倔唑、阿納托峻；且非常特别的是来曲唑。依西美坦可以例如以市售的形式(如商标名为aromasin )来给药。福美坦可以例如
以市售的形式(如商标名为lentaron )来给药。法倔喳可以例如以市 售的形式(如商标名为afema )来给药。阿纳托唑可以例如以市售的 形式(如商标名为arimidex )来给药。来曲唑可以例如以市售的形式 (如商标名为femara 或femar )来给药。来曲唑可以例如以市售 的形式(如商标名为femara 或femar )来给药。氨鲁米特可以例
如以市售的形式(如商标名为orimeten )来给药。
本发明的包含为芳香酶抑制剂的抗肿瘤药的组合对于激素受体阳性乳 腺肿瘤治疗特别有用。
如本文所用的术语"抗雌激素药物"涉及在雌激素受体水平对抗雌激素 作用的化合物。该术语包括但不限于它莫西芬、氟维司群、雷洛昔芬和雷 洛昔芬盐酸化物。它莫西芬可以例如以市售的形式(如商标名为
nolvadex )来给药。雷洛昔芬盐酸化物可以例如以市售的形式(如商 标名为evista )来给药。氟维司群可以如us 4,659,516中所公开的方 法来配制或者可以例如以市售的形式(如商标名为faslodex，)来给药。
如本文所用的术语"拓朴异构酶i抑制剂"包括但不限于托泊替康、依 立替康、9-硝基喜树碱和大分子喜树碱偶联物pnu-l66148 (WO99/17804 中的化合物Al)。依立替康可以例如以市售的形式(如商标名为 camptosar )来给药。托泊替康可以例如以市售的形式(如商标名为 hycamtin )来给药。
如本文所用的术语"拓朴异构酶ii抑制剂，，包括但不限于安曲非宁亚 得里亚霉素(包括脂质体制剂，例如caelyx )、表柔比星、去曱氧正 定霉素和奈莫柔比星、蒽醌类(米托蒽醌和洛索蒽醌)以及鬼臼毒素类(鬼
臼乙叉戒和鬼臼乙叉戒)。鬼臼乙叉甙可以例如以市售的形式(如商标名为 etopophos )来给药。鬼臼參呤甙可以例如以市售的形式(如商标名 为vm 26-BRISTOLtm )来给药。亚得里亚霉素可以例如以市售的形式(如 商标名为adriblastin顶)来给药。表柔比星可以例如以市售的形式(如 商标名为farmorubicin )来给药。去甲氧正定霉素可以例如以市售的形式(如商标名为ZAVEDOS )来给药。米托蒽醌可以例如以市售的 形式(如商标名为NOVANTRON )来给药。
术语"微管活性药物，，涉及微管稳定及微管去稳定药物，包括但不限于 紫杉烷类(紫杉醇和紫杉萜)、长春花碱类(例如长春喊、特别是硫酸长春 碱；长春新碱、特别是疏酸长春新碱；以及长春瑞滨)、discodermolide和 埃坡霉素类(例如埃坡霉素B和D)。紫杉萜可以例如以市售的形式(如 商标名为TAXOTERE )来给药。硫酸长^U5^可以例如以市售的形式(如 商标名为VINBLASTIN R.P. )来给药。硫酸长春新碱可以例如以市售的 形式(如商标名为FARMISTIN )来给药。
如本文所用的术语"烷化剂，，包括但不限于环磷酰胺、异磷酰胺和美法 仓。环磷酰胺可以例如以市售的形式(如商标名为CYCLOSTIN )来给 药。异磷酰胺可以例如以市售的形式(如商标名为HOLOXAN很)来给药。
术语"组蛋白去乙酰酶抑制剂，，涉及抑制组蛋白去乙酰酶且具有抗增殖 活性的化合物。
术语"法尼基转移酶抑制剂"涉及抑制法尼基转移酶且具有抗增殖活性 的化合物。
术语"COX-2抑制剂"涉及抑制环氧化酶2型(COX-2)且具有抗增殖活 性的化合物，例如塞来考昔(Celebrex⑧)、罗非考西(Vioxx⑧)和芦米考昔 (COX189)。
术语"MMP抑制剂"涉及抑制基质金属蛋白酶(MMP)且具有抗增殖活 性的化合物。
术语"mTOR抑制剂"涉及抑制雷怕霉素的哺乳动物靶点(mTOR)且具 有抗增殖活性的化合物，例如西罗莫司(Rapamune )、依维莫司 (Certican )、 CCI-779和ABT578。
术语"抗肿瘤的抗代谢物"包括但不限于5-氟尿嘧啶、喃氟啶、卡培他 滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧咬、吉西他滨、6-巯基 嘌呤、幾基脲、甲氨喋呤、依达曲沙以及这些化合物的盐，还有ZD 1694 (RALTITREXEDTM)、 LY231514 (ALIMTATM)、 LY264618(LOMOTREXOI/m)和OGT719。如本文所用的术语"賴化合物"包括但不限于碳鉑、顺柏和奥沙利柏。 碳铂可以例如以市售的形式(如商标名为CARBOPLAT )来给药。奥沙 利铂可以例如以市售的形式(如商标名为ELOXATIN )来给药。如本文所用的术语"降低蛋白激酶活性并进而抗血管生成的化合物，，包括但不限于降低蛋白激酶(例如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子 (EGF)、 c-Src、蛋白激酶C、血小板衍生的生长因子(PDGF)、 Bcr-Abl、 c-Kit、 Flt-3、胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)和细胞周期蛋白依赖性蛋 白激酶(CDK)、磷脂酰肌醇3激酶抑制剂(PI3K)和蛋白激酶B(PKB)抑制剂 (例如在WO 2005/054238和WO 2005/054237中所提到的)、热休克蛋白 卯(HSP90)抑制剂(一种ATP酶))和具有其他不同于降低蛋白激酶活性的 作用机制的抗血管生成的化合物。降低VEGF活性的化合物具体而言是抑制VEGF受体，特别是VEGF 受体的酪氨酸激酶活性的化合物，与VEGF连接的化合物、以及具体而言 是那些在WO 98/35958、 WO 00/09495、 WO 00/27820、 WO 00/59509、 WO 98/11223、 WO 00/27819、 WO 01/55114、 WO 01/58899和EP 0 769 947 中概括和具体公开的化合物、蛋白质和单克隆抗体；那些如M,Prewett等 人在Cancer Research ^2(1999) 5209-5218中、F. Yuan等人在Proc. Natl. Acad. Sci.美国，93巻，14765-14770页，1996年12月中、Z. Zhu等人在 Cancer Res. 58， 1998， 3209-3214中以及J. Mordenti等人在Toxicologic Pathology, 27巻，第1期，14-21页，1999中；在WO 00/37502和WO 94/10202中；AngiostatinTM ， M. S. O'Reilly等人在Cell 79， 1994， 315-328 中；以及Endostatin , M. S. O'Reilly等人在Cell 88， 1997， 277-285中所 描述的化合物、蛋白质和单克隆抗体；降低EGF活性的化合物具体而言是抑制EGF受体，特别是EGF受 体的酪氨酸激酶活性的化合物，与EGF连接的化合物、以及具体而言是 那些在WO 97/02266、 EP 0 564 409、 WO 99/03854、 EP 0520722、 EP 0 566 226、 EP 0 787 722、 EP 0 837 063、 WO 98/10767、 WO 97/30034、 WO97/49688、 WO 97/38983以及特别是在WO 96/33980中概括和具体公开的 化合物；降低c-Src活性的化合物包括但不限于如下文所定义的抑制c-Src蛋白 质酪氨酸激酶活性的化合物，以及SH2相互作用抑制剂例如那些在 WO97/07131和W097/08193中所公开的那些；抑制c-Src蛋白质酪氨酸激酶活性的化合物包括但不限于属于吡咯并 嘧啶类(特别是吡咯并[2，3-d嘧啶类)、嘌呤类、吡唑并嘧啶类(特别是吡 唑并3，4-dl嘧啶类)、吡啶并嘧啶类(特别是吡啶并2，3-dl嘧啶类)的结构 类型的化合物。优选地，该术语涉及那些在WO 96/10028、 WO 97/28161、 W097/32879和WO97/49706中所公开的化合物；降低蛋白激酶C活性的化合物具体而言是那些在EP 0 296 IIO(在WO 00/48571中所述的药物制剂)中所公开的作为蛋白激酶C抑制剂的星形孢 菌素衍生物；物是伊马替尼(Gleevec⑧/Glivec⑧)、PKC412、 IressaTM(ZD1839)、 PKI166、 PTK787、 ZD6474、 GW2016 、 CHIR-200131 、 CEP 7055/CEP-5214 、 CP-547632、 KRN-633和SU5416;包括但不限于例如反应停(THALOMID)、塞来考昔(Celebrex)和ZD6126。 如本文所用的术语"戈那瑞林激动剂"包括但不限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸高锡林。戈舍瑞林是在US 4,100,274中公开且可以例如以市售的形式(如商标名为ZOLADEX )来给药。阿巴瑞克可以如US 5，843，卯1中所7>开的方法来配制。如本文所用的术语"抗雄激素药物"包括但不限于比卡鲁胺(CASODEX ),其可以如US 4,636,505中所公开的方法来配制。术语"bengamides"涉及具有抗增殖特性的bengamides及其衍生物 如本文所用的术语"二膦酸盐"包括但不限于etridonicacid、氯甲双磷酸、替鲁膦酸、帕米膦酸、阿仑棒酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑来膦酸。"Etridonic acid"可以例如以市售的形式(如商标名为DIDRONEL )来 给药。"氯甲双磷酸，，可以例如以市售的形式(如商标名为BONEFOS顶) 来给药。"替鲁膦酸，，可以例如以市售的形式(如商标名为SKELID )来 给药。"帕米膦酸，，可以例如以市售的形式(如商标名为AREDIA )来给 药。"阿仑棒酸"可以例如以市售的形式(如商标名为FOSAMAX tm)来給 药。"伊班膦酸"可以例如以市售的形式(如商标名为BONDRANAT ) 来给药。"利塞膦酸，，可以例如以市售的形式(如商标名为ACTONEL ) 来给药。"唑来膦酸，，可以例如以市售的形式(如商标名为ZOMETA ) 来给药。如本文所用的"抗增殖的抗体"包括但不限于曲妥珠单抗(Herc印tin )、曲妥珠单抗-DMl、埃罗替尼(TarcevaTM)、贝伐单抗(Avasth^)、利妥 昔单抗(Rituxan⑧)、PRO64553(抗-CD40)和2C4抗体。为了治疗急性骨髓性白血病(AML)，式IA(或其例举的式)化合物可 以与标准的白血病疗法联合使用，特别是与用作AML治疗的疗法联合使 用。具体而言，式IA(或其例举的式)化合物可以与例如法尼基转移酶抑制 剂和/或其他对AML治疗有用的药物(例如柔红霉素、阿霉素、阿糖胞苷、 VP-16、鬼臼噻吩甙、米托蒽醌、去甲氧正定霉素、碳铂和PKC412)联 合给药。通过代号、通用名或商品名来识别表征的活性药物的结构可以从 "Merck索引，，的标准摘要的现行版本、或者从数据库如国际专利(如IMS 世界出版物)获得。可以与式IA(或其例举的式)的化合物联合使用的上文提到的化合物， 可以如本领域(例如上文引用的文献)中所描述的方法来制备和给药。如本文所用的术语"联合给药，，的含义是包括向单个患者施用所选择的 治疗药物，并期望包括不必要按照相同途径给药或同时给药的治疗用药方 法。由于适当且^f更利，如没有另外说明，随后或上文所提到(作为动词或 名词)的术语"用途"(涉及式IA的化合物或其(特别是可药用的)盐的用途)，其(如果上下文没有不同地指明或不同地建议)分别(如果没有另外说明)包括下述任何一个或多个本发明的实施方案在治疗蛋白(特别 是酪氨酸)激酶调控(特别是抑制)响应性疾病中的用途、制备用于治疗 蛋白激酶调控(特别是抑制)响应性疾病的药物组合物的用途、在治疗蛋 白激酶调控(特别是抑制)响应性和/或增生性疾病中使用一种或多种式IA 化合物的方法、包含一种或多种用于治疗所述蛋白激酶调控(特别是抑制) 响应性疾病的式IA化合物的药物制剂、以及一种或多种用于治疗所述蛋 白激酶调控(特别是抑制)响应性疾病的式IA化合物。具体而言，治疗 的疾病及因此优选用于"用途"的式IA化合物选自上文提到的蛋白(特别 是酪氨酸)激酶调控(特别是抑制)响应性(含义是不仅"依赖"，而且"支 持，，，包括疾病对蛋白激酶调控(特别是抑制)响应的情况，因此蛋白激酶 的活性支持或甚至引发疾病显现)疾病，或者特别是上文或下文提到的增 生性疾病。优选地，蛋白激酶调控(特别是抑制)响应性疾病是对上文和 下文提到的一种或多种激酶(更加优选FGFR)的抑制响应的疾病。制备方法式IA化合物采用类似于本领域公知的用于其他化合物的方法来制备，因此对于式IA的新化合物的制备作为类似方法而言是新方法，优选地通过在双反应性的碳酸衍生物的存在下将IIA化合物(苯胺)H。N、(HA)(R4)n其中W和n如式IA的化合物所定义，与式IIIA(胺)反应，<formula>formula see original document page 62</formula>其中R1、 R2、 R3、 R5、 X、 Y和Z如式IA化合物所定义。 并且，如果需要，将式IA化合物转化为不同的式IA化合物，将可获 得的式IA化合物的盐转化为游离化合物或不同的盐，将可获得的游离式 IA化合物转化为其盐，和/或将可获得的式IA化合物的异构体混合物分离 成单个异构体。在该反应中，双反应性的碳酸衍生物优选碳酸酸酐或更加优选碳酸二 面化物，特别是碳酰氯(光气)。该反应可以优选通过首先将式IIA化合物进行，随后向其加入其他化合物(分别为式IIIA或IIA化合物)。首个反 应优选在合适的溶剂，例如醚(如二嗜、烷)，在升高的温度下(如从20。C 至反应混合物的回流温度)进行，并可以优选随后通过浓缩所得的异氰酸 盐溶液以提供优选为固体或油形式的异氰酸盐。随后异氰酸盐的第二个反 应在加入合适的溶剂(特别是N-甲基吡咯烷酮(NMP)和/或甲苯)后，在 升高的温度下(如从20。C至反应混合物的回流温度)分别加入补充的式 IIIA或IIA的胺来进4亍。两个反应都优选在保护性气体、特别是氮气或氩气下进行。任选的反应和转化式IA的化合物可以转化为不同的式I化合物。例如，式IA化合物中，其中W是千氧基苯基M或4-节基-旅溱-1-基-苯基氨基，千基部分可以通过氢化作用去除，例如在贵金属催化剂(例 如把碳)的存在下，在合适的溶剂(例如醇类，如甲醇)中，在合适的温 度下(例如从0至50°C ),在额外的酸(如HC1)的存在下从哌溱的氮上去除以获得对应的化合物，其中的千基部分被氢代替。式IA化合物可以转化为对应的N-氧化物。该反应通过与合适的氧化 剂(优选过氧化物，例如间氯过氧苯甲酸)，在合适的溶剂(例如卣代烃， 通常为氯仿或二氯甲烷，或者低级烷羧酸，通常为乙酸)中，优选在0°C 和反应混合物沸点之间的温度下，特别是在大约室温下进行。非氧化形式的本发明化合物可以从本发明化合物的N-氧化物来制备， 通过将其用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、 三氯化磷、三溴化物等)在合适的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、水性 二W悉烷等)中在0-80'C下进行处理。具有至少一个成盐基团的式IA化合物的盐可以以其自身已知的方式 来制备。例如，具有碱性基团(如碱性氮)的式IA化合物的酸加成盐可 以以常规方式获得，例如通过用酸或合适的阳离子交换剂处理式IA化合 物。具有酸性基团的式IA化合物的盐可以通过用金属化合物，例如合适 的有机羧酸的碱金属盐(如2-乙基己酸的钠盐)，用有机碱金属或碱土金 属化合物，例如对应的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐(如钠或钾的氢氧化 物、碳酸盐或碳酸氢盐)，用对应的钙化合物或用氨或合适的有机胺处理该 化合物，所用的化学计算量优选仅相对成盐试剂少量过量。例如通过盐(例 如酸加成盐)的中和作用，例如用弱碱或通过用离子交换剂处理使之到达 等电点，可以形成包含酸性和碱性成盐基团(例如游离羧基和游离氨基) 的式IA化合物的内盐。式IA化合物(=本发明化合物)的盐可以以常规方式转化为游离化合 物；金属或铵盐例如通过用合适的酸和酸加成盐处理，例如通过用合适的 碱性试剂处理可以转化为不同的盐。在两种情况下，都可以使用合适的离 子交换剂。立体异构体混合物(例如非对映异构体混合物)可以通过合适的分离 方法以自身已知的方式分离成它们对应的异构体。例如非对映异构体混合 物可以通过分步结晶法、色语法、溶剂分配法以及类似的方法来分离成它 们的单一非对映异构体。该分离可以在一种原料化合物水平上或在式IA化合物自身的水平上进行。对映异构体可以通过形成非对映异构体的盐， 例如通过与对映异构体纯的手性酸成盐来进行分离，或者通过色镨法(例如HPLC)，使用具有手性配基的色语基质。将化合物的立体异构体从它 们的外消旋混合物中分离的适用技术的更加详细的描述可以在Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen， "Enantiomers， Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc.， 1981中找到。本发明化合物的前药衍生物可以通过本领域一般技术人员已知的方法 (例如进一步详见Saulnier等人，(1994)， Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 4巻，1985页)来制备。例如，合适的前药可以通过将 非衍生的本发明化合物与合适的氨甲酰化试剂(例如l，l-酰氧基烷基M 碳酰氯(l，l-acyloxyalkylcarbanochloridate)、对硝基苯基碳酸盐等)反应来 制备。本发明化合物被保护的衍生物可以通过本领域那些一般技术人员已知 的方法来制备。保护基团的建立及其去除的适用技术的详细描述可以在T. W. Greene, "Protecting Groups in Organic Chemistry",第3版，John Wiley and Sons, Inc., 1999中找到。作为本发明化合物的溶剂合物(例如水合物)可以在本发明的方法中 方便地制备或形成。本发明化合物的水合物可以通过从水/有机溶剂混合物 中用有机溶剂(例如二 恶英、四氢呋喃或甲醇)重结晶来方便地制备。中间体和终产物可以根据标准方法，例如使用色镨方法、分配方法、 (重)结晶法等来进行后处理和/或纯化。原料原料和中间体(两者均各自包含其盐)，特别是式IIA和HIA的原料 和中间体可以按照与实施例中所描述的类似的方法，根据或类似于本领域 已知的方法来制备，和/或其作为商品获得。例如，原料可以优选地按照以下方法来制备如果没有另外指明，在原料和中间体中所用的R1、 R2、 R3、 R4、 R5、X、 Y、 Z和n，这些符号优选地具有式IA的化合物所提供的含义。例如，带有一个或多个卣素基团的式IIA的化合物可以通过卣化作用， 例如与无机酸囟化物(如磺酰氯)，在合适的溶剂(如乙腈、二氯甲烷和/ 或四氢呋喃)中，优选地在-40至25。C范围内的温度下制备，对于式IIA 对应的化合物，其中存在至多4个其他基团R4 (选自d-CV烷基、卣素 -d-C7-烷基、卣素和CKV烷氧基)，且M被保护，例如通过乙酰基或 叔丁氧基羰基(保护基团的引入参见例如实施例中或下文的一般加工条 件)，随后去除保护基团(例如乙酰基通过在合适的溶剂(如乙醇)中，在 升高的温度(如从30'C至所述混合物的回流温度)下，用碱金属氢氧化物 (如氢氧化钾)处理来去除；叔丁氧基羰基通过在合适的溶剂(如二噁烷) 中，在温度如-20至30。C下与酸(如HC1)反应来去除)。j^-d—Cr烷基，特别是曱基，可以通过用d-CV烷基囟化物(如-碘 化物)在合适的溶剂(如四氢呋喃)中，在优选从-50'C至25。C的温度下 对也为式IIA (具有如前一段所述的氨基的保护和去保护)的对应的前体 化合物中的苯环(特别是已经存在d-Cr烷氧基部分R4)进行烷基化来引 入。以上反应在式IIA的化合物前体与强碱(如丁基或叔丁基锂)在合适 的溶剂(如戊烷和四氢呋喃)中，在优选的从-80。C至0。C范围的温度下反 应之后进行。例如，式IIIA化合物可以如下文通过将式IVA化合物其中Hal是卣素，特别是氯或溴，在酸(如乙酸或盐酸)的存在下， 在合适的溶剂(如水或二 悉烷)中，在升高的温度(如在50-160。C的范围 内)下(必要时在试管中)与式VA的胺反应。R1RNH(VA)或者，其中的W是被[4-(d-C7-烷基)-哌溱-l-基-羰基取代的苯基的式 iiia化合物可以通过将如上文定义的式iva化合物与式via化合物反应 来获得，COOHH。NA(VIA)其中A是氢、d-Cr烷氧基或卣素，优选在酸(如盐酸)的存在下， 在合适的溶剂(如二噁烷)中，在升高的温度(如在50-17(TC)下(例如在微波炉中)进行反应，！51^所得的式VIIA化合物，HOOC、1 R3(VIIA)其中各部分如式iva和via所定义，将其在偶合试剂(如丙基磷酸 酐)的存在下，在合适的溶剂(如dmf)中，在氮碱(如三乙胺和/或4-二甲基氨基-吡咬)的存在下，优选在0-50。C范围的温度下进行反应生成对 应的式IIIA4匕合物。例如，其中Rs是氢的式VA化合物可以通过还原其中氨基(NR"被硝 基替代的对应的化合物来获得，例如将其用铁粉在乙醇、水和乙酸中，在 升高的温度(如30-100。C)下，或者用氢气在催化剂(如拉尼镍)的存在 下，在甲醇中，在温度如0-50。C下进行反应。在两种情况下都可使用其他惯常的溶剂。其中RS是d-CV烷基所对应的式VA化合物可以通过例如用 对应的C,-CV烷基离化物的烷基化作用来获得。对应的原料和其他式VA化合物可以按照实施例中所描述的或与其类 似的方法，才艮据本领域已知的方法来制备或其作为商品获得。一般方法条件一般情况下，下文的内容适用于上下文所提到的所有方法，而上下文 所特别提到的反应条件是优选的反应条件在上下文所提到的任意反应中，尽管没有特别提到，如果适宜或需要 的话可以使用保护基团来保护不期望参加所给出反应的功能基团，并且它 们可以在适宜或需要的阶段引入和/或去除。因此在本说明书中任何可能没除非在上下文中另外指明，在本文公开范围之内仅作为容易离去的基 团，其不是具体所需的式IA的终产物的组成部分的基团命名为"保护基 团"。通过此保护基团对功能基团的保护，该保护基团自身以及适宜于它们 离去的反应例如在标准参考著作中有描述，例如J. F. W. McOmie，" Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973、 T. W. Greene和P. G， M. Wuts， " Protective Groups in Organic Synthesis",第三版，Wiley, New York 1999、 " The Peptides";第3巻(编辑 E. Gross和J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981 、 "Methoden der organischen Chemie"， Houben Weyl，第四版,15/1巻，Georg Thieme Verlag， Stuttgart 1974、 H.画D. Jakubke和H. Jeschkeit， "Amino-s5uren， Peptide, Proteine"， Verlag Chemie， Weinheim, Deerfidd Beach和 Basel 1982、 以及Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate"， Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974。特征性 的保护基团可以例如通过溶剂解、还原、光解或可选择地在生理条件(如 通过酶裂解)下容易地离去(即不发生不需要的二次反应)。所有上述方法步骤都可以在其自身已知的反应条件下进行，优选那些特别提到的反应条件，在没有或者惯常地有溶剂或稀释剂的存在下，优选地是对所用和溶解它们的试剂呈现惰性的溶剂或稀释剂；没有或存在催化 剂、浓缩或中和试剂，例如离子交换剂(例如阳离子交换剂，如以H+形式)， 取决于反应和/或反应物的性质；在降低的、正常的或升高的温度下，例如 在约-100。C至约190。C范围的温度下，优选在从约-80。C至约150。C下，例 如在从-80至-60。C下，室温下、在从-20至40。C下或者在回流温度下；在 大气压下或在封闭的容器中，酌情在压力下，和/或在惰性气体中，例如在 氩气或氮气中。除非在所述方法的描述中另外指明，来自那些适用于任何特殊反应的 溶剂可所选自包括那些特别提到的溶剂，或例如水、酯类(例如低级烷基-低级链烷基酯，如乙酸乙酯)、醚类(例如脂肪醚，如二乙基醚；或环醚， 例如四氢呋喃或二巧悉烷)、液态芳香烃(例如苯或甲苯)、醇类(例如曱醇、 乙醇或l-或2-丙醇)、腈类(例如乙腈)、卣代烃类(例如二氯甲烷或氯仿)、 酰胺类(例如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺)、碱类(例如杂环氮碱，如吡 啶或N-曱基吡咯烷-2-酮)、羧酸酐(例如低级链烷酸酐，如乙酸酐)、环、 直链或支链烃(例如环己烷、己烷或异戊烷)、或者这些溶剂的混合物(例 如水溶液)。该溶剂混合物还可以用于后处理，例如通过色谱法或分配法来 进行。本发明还涉及所述方法的那些形式，其中在该方法的任何阶段中作为 中间体可获得的化合物用作原料并进行剩余的方法步骤，或者其中的原料 在反应条件下形成或以衍生物的形式(例如已被保护的形式或盐形式)使 用，或者通过根据本发明的方法可获得的化合物是在方法条件下产生并进 一步就地进行反应。在本发明的方法中优选那些可获得所述优选的式IA 化合物的原料。本发明还涉及新的中间体和/或原料。特别优选的反应条件 和新中间体与实施例中所提到的那些一致或类似。本发明优选的实施方案在优选的实施方案以及更广泛范围的之前和之后的实施方案中，同样也在权利要求中，任何一种或多种或者所有的一般表达或符号，各自独立 地可以4皮对应的上下文提供的更加特异的定义所代替，因此产生本发明更 加优选的实施方案。优选的是权利要求中给出的实施方案，其因此引入本文作为参考。特别优选的是上文中A、 B或C任何一组所给出的式IA的化合物。非常优 选的是在实施例中给出的一种或多种式IA的化合物及其(特别是可药用 的)盐。实施例以下实施例是为了阐述本发明而不限制其范围。温度按照摄氏度计量。 除非另外指明，所述反应在室温下进行。表示各个物质移动的距离与洗脱 剂前沿移动的距离的比值的Rf值是在珪胶薄层板5 x 10cm的TLC板、硅 胶F254(Merck， Darmstadt,德国)上使用下文指定的溶剂系统通过薄层色语 法来确定。分析性HPLC条件 系统1线性梯度20-100% CH3CN CH3CN(0.1%TFA); 215nm下检测， Nucleosil 100-3 C18(70 x 4.0mm)。缩写与首字母缩写在5分钟 + 1.5分钟100% 流速在30。C下lmL/分钟。Column:AcOH 乙酸API-MS 大气压电离质^脊盐水 饱和NaCl水溶液硅藻土 0"^@(西莱特公司)=基于硅藻土的助滤剂CH3CN 乙腈DCM 二氯甲烷cone, 浓缩的DIEA 二异丙基乙基胺DM AP 4-二甲基^J^-吡咬DMF 二甲基甲酰胺DMP 1 ，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(lH)-嘧啶酮DMSO 二甲基亚砜equiv 当量ESI-MS电喷射离子化质镨Et20乙醚Et3N三乙胺EtOAc乙酸乙酯EtOH乙醇HN03辨酸H2S04硫酸h小时Hex己坑HC1盐酸H20水HPLC高压液相色镨升LiOH氢氧化锂Me甲基MeOH甲醇mL毫升min分钟m.p.熔点MPLC中压液相色"i普MS 质谱 NaH 氢化钠 Na2C03 碳酸钠 NaHC03 碳酸氢钠 Na2S04 硫酸钠 NH3aq 氨水NMP l-曱基-2-吡咯烷酮 NMR 核磁共振PdCl2(dppf)[l，l ，-联(二苯基膦基)二茂铁二氯钯(H)Pd(PPh3)4四(三苯基膦)钯(O)Pd(PhCN)2Cl2 二(千腈)氯化把(II)Ph 苯基Rf 比移值(TLC)RT 室温TBTU O-(苯并三唑-l-基)-N，N，N，，N，-四甲基脲错四氟硼酸盐TFA CF3COOH (三氟乙酸)THF 四氩呋喃TLC 薄层色i普TR 保留时间wt. S重量微波装置:Emrys优化器(Biotage) 反应方案实施例AcOH,H!O0 。xx +众实施例1: l-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-3-{6-『4-(2-吗啉-4-基-乙氣 基)-苯基氨基1-嘧啶-4-基}-脲将光气(在甲苯中20%， 0.8mL， 1.58mmo1, 2.4当量)在氩气中加 入2,6-二氯-3，5-二曱氧基苯胺(175mg， 0.79mmo1， 1.2当量)在二 悉烷(2.5mL) 的溶液中。将该混合物加热至回流，搅拌1小时，冷却至室温，并在真空 下浓缩。在75。C下在氩气中将所得异氰酸盐加入N-4-(2-吗啉-4-基-乙氧 基)-苯基-嘧咬-4，6-二胺(208.5mg， 0.66mmol)在NMP(2mL)的溶液。该反 应混合物在75。C搅拌2小时，冷却至室温，并随后将其用DCM和饱和 NaHC03水溶液稀释。分离水层并用DCM萃取。有机相用盐水洗涤，干 燥(Na2S04 )，过滤并浓缩。粗产物经硅胶柱色谱(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 96: 4)纯化，随后将所得材料在MeOH中研磨，提供为白色固体的标题化 合物ESI-MS: 562.9 / 564.9 [MH+; tR= 2.99分钟(纯度100%，系统 1); TLC: Rf = 0.36(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 93: 7)。步骤1.1: N-f4-(2-吗啉-4-基-乙猛V苯基l-嘧咬-4,6-二胺 将6-氯-嘧梵-4-基胺(194mg, 1.5mmo1, 1.3当量)、4-(2-吗#>4-基-乙 氧基)-苯基胺(256mg， 1.15mmol)在H20(lmL)和水醋酸(5mL)的混合物在 IO(TC下搅拌16小时。蒸干溶剂后，将残余物溶于DCM中并用饱和 NaHC03水溶液稀释。分离水层并用DCM萃取。有机相用盐水洗涤，干 燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物用EtOAc研磨以提供为灰色固体的标 题化合物ESI画MS: 316.MH+; tR= 1.00分钟(纯度95%，系统l); TLC: Rf = 0.22(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 93: 7)。步骤1.2: 4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基胺在氩气中将4-(2-氯-乙基)-吗啉盐酸化物(4.2g， 22mmo1， 1.2当量)一 次加入4-氨基苯酚(2g， 18.3mmol)和氢氧化钠细粉(1.87g, 45.8mmo1， 2.5 当量)在DMF(32mL)的混合物中。在室温下搅拌该反应混合物23.5小时。 过滤所得黑色混悬液。滤液用DCM(200mL)稀释并用盐水(2 x 60mL)洗涤。 干燥有机相(硫酸钠)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱(DCM/EtOH，9S: 5 4 7: 3)纯化以提供为黄褐色固体的标题化合物API-MS: 223.2 [MH广，TLC: Rf = 0.31(DCM/EtOH， 9: 1)。歩骤1.3: 2,6-二氯-3,5-二甲猛苯胺向A42，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-乙酰胺(34.5g，264mmol)在乙醇(1.3 L)的溶液中加入2M的KOH(0.72L)。然后，将该反应混合物加热至回流， 在回流下搅拌44小时，然后冷却至室温。将所得混悬液冷却至0。C搅拌1 小时并过滤。残余物用一小部分冷EtOH/H20(l: l)洗涤，并用冷1120洗 涤直至中和，干燥以提供为白色固体的标题化合物ESI-MS: 222.0 / 224.0 [MH〗+， TLC: Rf = 0.52(己烷/EtOAc， 1: 1)。步骤1.4: N-(2，6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-乙酰胺在氩气中将磺酰氯(26.9mL， 325mmol， 1.93当量)加入(在7分钟内) 冷却的(0°C) A43，5- 二甲氧基苯基)-乙酰胺(32.9g ， 169mmol)在 CH3CN(500mL)的混悬液中。将所得黄色混合物搅拌30分钟并通过逐滴加 入饱和碳酸氢钠水溶液(250mL)来淬灭反应。经真空过滤收集所得沉淀， 用H2O(300mL)洗涤并干燥以提供20g所需产物(第1批)。用饱和NaHC03 7K溶液(300mL)稀释并用EtOAc(2 x 300mL)萃取。用H20和盐水洗涤有机 相，干燥(Na2S04),过滤并浓缩。残余物经珪胶粗色i普(EtOAc/己烷，l: 1 ~> 2: l)纯化以提供8.8g产物(第2批)。将第1和2批合并并在己烷中搅拌。 通过过滤收集固体，用己烷洗涤并干燥以提供为白色固体的标题化合物。 ESI画MS: 264.0/266.0 [MH+， TLC: Rf = 0.15(己烷/EtOAc， 1: 1)。步骤1.5: N-(3,5-二曱氧基-苯基V乙酰胺将乙酸酐(13mL， 137mmo1, 1.05当量)加入(在15分钟内)3，5-二曱氧 基苯胺(20g， 131mmol)在甲苯(110mL)的混悬液中，保持内部温度在 35-45。C范围内。将该反应混合物在室温下搅拌20小时。用己烷(55mL)稀 释所得粘稠、灰色混悬液并过滤。将过滤器中的残余物用甲苯/己烷(2: 1, 70mL)和己烷洗涤，干燥以提供为白色固体的标题化合物。API-ES-MS: 196.1 [MH+， tR= 3.03分钟(纯度100%,系统1)。实施例2: 3-(2,6-二氯-3,5-二曱氧基-苯基)-l-甲基-H6-〖3-(4-甲基-哌 嗪-l-基甲基)-苯基氨基l-嘧咬-4-基V脲在氩气中将光气(在甲苯中20%, lmL， 2.0mmo1， 2.4当量)加入2，6-二氯-3，5-二甲氧基苯胺(221mg, l.Ommol， 1.2当量)在二 恶烷(2.5mL)的溶 液中。将该混合物加热至回流，搅拌1小时，冷却至室温，并在真空中浓 缩。在回流下在氩气中，将所得异氰酸盐加入N-甲基-N，-[3-(4-甲基-哌, -1-基甲基)-苯基]-嘧啶-4，6-二胺(步骤2.1)(259mg， 0.83mmol)在甲苯(5mL) 的溶液中。将该反应混合物在回流下搅拌3小时，冷却至室温，并用DCM 和饱和NaHC03水溶液稀释。分离水层并用DCM萃取。有才A^目用盐水洗涤，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。粗产物经珪胶柱色i普(DCM/MeOH + l %NH3aq，95: 5)纯化以提供为黄色固体的标题化合物ESI-MS: 560.0 / 562,0 [MHI+; tR= 3.26分钟(纯度99%,系统1); TLC: Rf = (U7(DCM/MeOH + 1 %冊3叫，9: 1)。步骤2.1: N-甲基-N，43-(4-甲基-哌唤-l-基甲基)-苯基l-嘧啶-4,6-二胺 将(6-氯-嘧咬-4-基)-曱基-胺(385mg， 2.68mmo1， 1.1当量)、3-(4-曱基-哌唤-l-基甲基)-苯基胺(500mg， 2.44mmol)和4N的HC1在二 悉烷(7mL) 中的混合物在封闭的试管中加热至150。C历经17.5小时。去除溶剂并将残 余物用DCM和饱和NaHC03水溶液稀释。分离水层并用DCM和 DCM/MeOH(95: 5)萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(Na2S04)，过滤并浓 缩。残余物经珪胶MPLC(DCM/MeOH + l %NH3aq， 95: 5)纯化以提供 为驼色固体的标题化合物ESI-MS: 313.MH+; tR= 1.00分钟(纯度 100%,系统l); TLC: Rf=0.05(DCM/MeOH + l %NH/q，9: 1)。歩骤2.2: 3-(4-曱基-哌唤-l-基甲基V苯基胺在氢气中将l-甲基-4-(3-硝基-苄基)-派溱(6.9g， 29.14mmol)和拉尼镍(2 g)在MeOH(150mL)的混悬液在室温下搅拌5小时。反应混合物经硅藻土 垫过滤并浓缩以提供为黄色固体的标题化合物ESI-MS: 206.1 [MH广。歩骤2.3: l-甲基-4-(3-硝基-爷基)-哌溱将3-硝基节基氯化物(5g,29.14mmol)、N-甲基旅噪(3.9mL， 34.97mmo1， 1.2当量)、碳酸钾(8g, 58.28， 2当量)和丙酮(100mL)的混合物在回流下搅 拌15小时。反应混合物冷却至室温，过滤并浓缩。残余物经硅胶 MPLC(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)纯化以提供为棕色油的标题化合 物ESI-MS: 236.0 [MH+; tR= 1.40分钟(纯度100%,系统1);TLC: Rf = 0.31(DCM/MeOH + 1 % NH/q， 9: 1)。实施例3: 3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-l-(6-『3-(4-乙基-P底唤-l-基V 苯基絲1-嘧咬-4-基"-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 559.9 / 561.9 [MH]+; tR= 3.75分钟(纯度100%,系统1); TLC: Rf = 0.37(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 92: 8)。步骤3.1: N-〖3-(4-乙基-哌唤-l-基)-苯基l-N，-曱基-嘧啶-4，6-二胺 标题化合物以类似于步骤2.1所述的方法来制备ESI-MS: 313.MH+; tR= 1.20分钟(纯度100%,系统1);TLC: Rf = 0.10(DCM/MeOH+ 1 %冊3叫，9: 1)。步骤3.2: 3-(4-乙基-哌唤-l-基)-苯基胺标题化合物以类似于步骤2.2所述的方法来制备API-MS: 206.2 [MH+; TLC: Rf = 0.31(DCM/EtOH， 9: 1)。歩骤3.3:1-乙基-4-(3-硝基-苯基)-哌嗪将l-氟-3-硝基苯(3.2mL，29.7mmol)和N國乙基-旅唤(7.6mL，59.4mmo1，2 当量)的混合物加热至回流并搅拌117小时。将该反应混合物冷却至室温 并用H2O(40mL)和DCM/MeOH(9: 1， 80mL)稀释。分离水层并用 DCM/MeOH(9: l)萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(Na2S04)，过滤并浓 缩。粗产物经珪胶柱色i普(DCM/MeOH， 1: 0 > 95: 5)纯化以提供为棕色 油的标题化合物ESI-MS: 236.0 [MH]+; tR= 2.49分钟(纯度99%,系 统l); TLC: Rf = 0.26(DCM/MeOH， 95: 5)。实施例4: 3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-笨基)-1-甲基-1-{6-14-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨基l-嘧吱-4-基V脲标题化合物以类似于实施例1所述的方法来制备ESI-MS: 577.0 / 579.0 [MH+; tR= 3,53分钟(纯度95%，系统1); TLC:Rf =0.40(DCM/MeOH + 1 % NH/q， 93: 7)。步骤4.1: N-甲基-N，-4-(2-吗啉-4-基-乙氣基)-苯基l-嘧咬-4，6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 330.2 [MH+; tR= 1.10分钟(纯度100%,系统1);TLC: Rf = 0.16(DCM/MeOH+ 1 %冊3叫，93: 7)。实施例5: W6-f4-苄氧基-苯基絲)-嘧啶-4-基l-3-G,6-二氯-3,5-二甲 氣基-苯基Vl-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 553.9 / 555.9MH+; tR= 5.16分钟(纯度100%,系统l)。步骤5.1: N-(4-爷氧基-苯基)-N，-曱基-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 307.MH+; tR= 3.72分钟(纯度100%,系统l)。实施例6: 3-(2,6-二氯-3,5-二曱氧基-苯基)-l-『6-"-羟基-苯基氨基)-嘧 啶_4_基1_1-曱基-脲在氢气中将l-6-(4-苄氧基-苯基M)-嘧啶-4-基]-3-(2，6-二氯-3，5-二甲 氧基-苯基)-l-甲基-脲(实施例5)(67mg， 0.121mmo1)、钯碳(20mg)和 MeOH(3.5mL)的混悬液在室温下搅拌3小时。将反应混合物经硅藻土垫过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化以提供为棕色固体的标题化合物 ESI-MS: 464.2 / 466.2 [MH+; tR= 3.91分钟(纯度100%，系统l)。实施例7: l-(2誦氯画3,5画二甲氧基画6-曱基画苯基)画3-{6誦4-(4-乙基-旅唤-l画 基)-苯基氨基1-嘧咬-4-基}-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 526.1 / 528.1 [MH+; tR= 3.12分钟(纯度100%，系统1); TLC:Rf =0.13(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 93: 7)。步骤7.1: N-『4-(4-乙基-派溱-l-基)-苯基l-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 299.1 [MH+; tR= 1.00分钟(纯度>95%，系统l)。步骤7.2: 4-(4-乙基哌唤-l-基)-苯胺在氢气中将l-乙基-4-(4-硝基-苯基)-哌唤(6.2g， 26.35mmol)和拉尼镍(2 g)在MeOH(120mL)的混悬液在室温下搅拌7小时。将反应混合物经硅藻 土垫过滤并浓缩以提供为紫色固体的标题化合物ESI-MS: 206.MH+; TLC: Rf = 0.15(DCM/MeOH + 1 % NH/q, 9: 1)。步骤7.3:1-乙基-4-(4-硝基-苯基V哌唤将l-溴画4-硝基苯(6g， 29.7mmol)和l-乙基旅唤(7.6mL，59.4mmo1，2当 量)的混合物加热至80""C历经15小时。冷却至室温后，将该反应混合物用 水和DCM/MeOH， 9: 1稀释。分离水层并用DCM/MeOH， 9: 1萃取。有 机相用盐水洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 9: l)纯化以提供为黄色固体的标题化合物 ESI画MS: 236.0MH]+; tR= 2,35分钟(纯度100%，系统l); TLC: Rf 二 0.50(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 9: 1)。歩骤7.4: 2-氯-3,5-二曱氧基-6-甲基-苯基-胺在氩气中将HCl(91mL， 360mmo1， 8当量，4N在二巧恶烷中)逐滴加入冷 却的(10。C)(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯(13.8g, 45.7mmol)在二 恶烷(150mL)的溶液中。将该反应混合物温至室温，搅拌 24小时并浓缩。残余物用EtOAc稀释，用饱和NaHC03水溶液和盐水洗 涤，干燥(Na2S04),过滤并浓缩。残余物经从DCM/己烷中结晶纯化以提 供标题化合物。ESI-MS: 202.0 [MH]，TLC: Rf = 0.37(DCM)。步骤7.5: (2-氯-3,5-二甲lL^-6-曱基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯 在氩气中将磺酰基氯化物(6.7mL， 79.8mmo1， 1,05当量)在 DCM(140mL)的溶液逐滴(75分钟)加入冷却的(-15。C)(3，5-二甲氧基-2-曱 基-苯基)-tJ^甲酸叔丁基酯(20.4g， 76.3mmol)在THF(330mL)的溶液中。 反应混合物在-15。C搅拌3小时并随后倒在冰/H2O(400mL)、饱和NaHC03 水溶液(400mL)和EtOAc(400mL)的混合物上。分离各层并用EtOAc(2 x 200mL)萃取水相。用H2O(3x200mL)和盐水(200mL)洗涤合并的有;W目， 干燥(Na2S04),过滤并浓缩。残余物在乙醚中研磨并随后经硅胶柱色i普(己 烷/丙酮，95: 5)纯化以提供标题化合物。ESI-MS: 302.MH广，TLC: Rf =0.13(己烷/丙酮，9: 1)。步骤7.6: (3,5-二甲氧基-2-曱基-苯基)-絲曱酸叔丁基酯 在氩气中将叔丁基锂(200mL， 340mmo1， 2.4当量，在戊烷中1.7M)溶 液逐滴加入冷却的(-65。C)(3，5-二甲氧基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯(36.1g， H2mmol)在THF(250mL)的溶液中。在-65。C下搅拌该混合物15分钟并随 后温至-25。C。随后加入械甲烷(10.7mL， 171mmo1， 1.2当量)在THF(140mL) 的溶液。将反应混合物在-25。C搅拌1小时后倒在冰/H2O(300mL)和 EtOAc(300mL)的混合物上。分离各层并用EtOAc(2 x 150mL)萃取水相。 用H20(3 x 150mL)和盐水(200mL)洗涤合并的有机相，干燥(Na2S04)，过 滤并浓缩。残余物经珪胶柱色谱(己烷/丙酮，95: 5 — 9: 1—4: l)纯化以 提供标题化合物。ESI-MS: 268.1 [MH]+，TLC: Rf = 0.25(己烷/丙酮，9:1)。步骤7.7: (3，5-二曱氧基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯在氩气中将二叔丁基二碳酸酯(145g， 651mmol， 1.3当量)在 THF(200mL)的溶液在室温下逐滴加入3，5-二甲氧基苯胺(78.2g， 500mmo1) 在THF(1.5L)的溶液。加热该反应混合物至回流历经4.5小时(加热时，见察到大量的气体放出)，冷却至室温并浓缩。用EtOAc(800mL)和H2O(800mL) 稀释残余物。分离各层并用EtOAc(2 x 200mL)萃取水相。用0.1N的 HCl(200mL)、 H20和盐水洗涤合并的有;M目，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。 残余物经DCM/己烷结晶以提供标题化合物。ESI-MS: 252.1 [M-HJ-， TLC: Rf-0.34(己烷/EtOAc，3: 1)。实施例8: 3-(2-氯-3,5-二曱氧基-6-甲基-苯基)-1-{6-『4-(4-乙基-旅唤-l-基)-苯基絲1-嘧咬-4-基}-1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例1所述的方法来制备ES1-MS: 540.1 / 542.1 [MH+; tR= 3.56分钟(纯度100%,系统1); TLC: Rf = 0.13(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 93: 7)。实施例9: 3-(2-氯-3,5-二曱氧基-6-甲基-苯基)-1 - {6-4-(2-二甲基氛基-乙氧基)-苯基氨基卜嘧啶-4-基卜1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例1所述的方法来制备ESI-MS: 515.2 / 517.2 [MH+; tR= 3.47分钟(纯度>95%，系统l)。歩骤9.1: N-4-(2-二曱基絲-乙氧基)-苯基l-N，-甲基-嘧啶-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 288.2 [MH]+; tR= 0.95分钟(纯度95%,系统l)。歩骤9.2: 4-(2-二甲基氨基-乙氧基〗-苯基胺标题化合物以类似于步骤1.2所述的方法来制备ESI-MS: 181.MH]+; TLC: Rf = 0.18(DCM/MeOH， 7: 3)。实施例10: 3-(2-氯-3,5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-l-曱基-(6-{4-〖2-(4-曱 基-p底唤-l-基)- 乙氧基卜苯基氨基卜嘧咬-4-基)-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 570.0[MH+; tR= 3.20分钟(纯度卯％，系统1)， TLC: Rf = 0，13(DCM/MeOH + 1 %冊3叫，93: 7)。步骤10.1: N-甲基-N，-M-『2-(4-甲基-哌嗪-l-基)-乙氧基l-苯基i-嘧咬 一4，6画二胺标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 343.2 [MH+; tR= 100分钟(纯度95%，系统1)， TLC: Rf = 0.23(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 9: 1)。实施例11: 3-(2-氯-6-碘-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯基氨基卜嘧咬-4-基Vl-甲基-脲标题4匕合物以类似于实施例1所述的方法来制备ESI-MS: 651.8 / 653.7 [MH+; tR= 3.20分钟(纯度95%,系统1)， TLC: Rf = 0.18(DCM/MeOH + 1 %冊3叫，93: 7)。步骤11.1 N-『4-(4-乙基-哌唤-l-基)-苯基l-N，-甲基-嘧啶-4，6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 313.2 [MH]+; tR-1.10分钟(系统l); TLC: Rf = 0.21(DCM/MeOH， 93: 7)。歩骤11.2: 2-氯-6-碘-3,5-二曱氣基-苯基-胺在氩气中将HCl(6.46mL，26mmo1，9.1当量，在二 悉烷中4N)加入冷却 的(10。C)(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯(1.28g， 2.85mmol，92%纯度)在二5悉烷(10mL)的溶液中。将该反应混合物温至室 温并随后搅拌1.5小时。用EtOAc和冰/水稀释该残余物，并通过加入饱和 NaHC03水溶液将其调至碱性。分离各层。水层用EtOAc萃取。有机相用 盐水洗涂，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色i普(DCM) 纯化以提供标题化合物。API陽ES-MS: 314.0MH]+， TLC: Rf = 0.53(DCM)。步骤11.3: (2-氯-6-碘-3,5-二甲氧基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯 在氩气中将碌酰基氯化物(0.92mL， ll.Ommol， 1.16当量)在 DCM(20mL)的溶液逐滴(30分钟)加入冷却的(-15。C)(2-碟-3，5-二甲l^-苯 基)-氨基甲酸叔丁基酯(3.6g， 9.49mmol)在THF(48mL)的溶液中。在-15。C 搅拌该反应混合物1小时并随后将其倒在水/H2O(100mL)、饱和NaHC03 水溶液(80mL)和EtOAc(100mL)的混合物上。分离各层并用EtOAc(2 x 100mL)萃取水相。用H2O(3x60mL)和盐水(60mL)洗涤合并的有;M目，干 燥(Na2S(X0，过滤并浓缩。残余物经珪胶柱色镨(DCM)纯化后经DCM/ 己烷结晶以提供标题化合物。ESI画MS: 411.9， 413.9 [M-H卩，TLC: Rf = (U8(DCM/己烷，7: 3)。步骤11.4: (2-碘-3,5-二甲氧基-苯基)-氨基曱酸叔丁基酯 在氩气中将叔丁基锂(14.1mL，24mmo1，2.4当量，在戊烷中1.7M)溶液 逐滴(15分钟)加入冷却的(-65。C)(3，5-二甲氧基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯 (2.53g， 10mmol)在THF(18mL)的溶液中。在-65。C下搅拌该混合物15分 钟后将其升温至-25。C。将过量的三氟碘甲烷通入该黄色反应混合物。将所 得黑色混合物倒在冰/H2O(60mL)和EtOAc(60mL)的混合物上。分离各层 并用EtOAc(2 x 30mL)萃取7jC相。用H20(3 x 40mL)和盐水(60mL)洗涤合 并的有机相，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱(DCM/己 烷，2: l)纯化以提供标题化合物。ESI-MS: 380.1 [MH+， TLC: Rf = 0.27(DCM/己烷，2: 1)。歩骤11.5: (3,5-二甲氧基-苯基)-氨基甲酸叔丁基酯将二叔丁基二碳酸酯(69.5g， 312mmo1， 1.3当量)在THF(100mL)的溶 液加入3,5-二甲氧基苯胺(37.5g， 240mmol)在THF(600mL)的溶液中。加 热该反应混合物至回流历经3小时，将其冷却至室温，搅拌过夜并浓缩。 将残余物在EtOAc(500mL)和H2O(500mL)之间分配。分离各层并用EtOAc(2 x 100mL)萃取水相。用0.1N HC1(2 x 100mL)、 H20和盐水洗涤 合并的有才M目，干燥(Na;tS04)，过滤并浓缩。残余物用己烷研磨纯化以提 供标题化合物。ESI-MS: 254.1 [MH+， TLC: Rf = 0，42(己烷/EtOAc， 3: 1)。实施例12: 3-(2-氯-3,5-二曱氧基-6-曱基-苯基)-1-{6-4-(4-异丙基-哌 溱-1-基)-苯基氨基1-嘧咬-4-基}-1-曱基-脲标题化合物以类似于实施例1所述的方法来制备ESI-MS: 554.0 / 555.0 [MH+; tR= 3.49分钟(纯度>95%，系统1)， TLC: Rf = 0.13(DCM/MeOH + 1 % NH/q， 93: 7)。步骤12,1: N-4-(4-异丙基-哌唤-l-基V苯基l-N，-甲基-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 288.MH+; tR= 0.95分钟(纯度95%，系统l)。步骤12,2: 4-(4-异丙基派，秦-l-基)-苯胺在氢气中将l-异丙基-4-(4-硝基-苯基)-哌溱(5.18g， 20.80mmol)和5% 钇碳(0.5 g)在MeOH(100mL)的混悬液在室温下搅拌2.7小时。将反应混合 物经硅藻土垫过滤并浓缩以提供为紫色固体的标题化合物ESI-MS: 220.1 [MH]+; tR= 0.95分钟(系统1)。歩骤12.3:1-异丙基-4-(4-硝基-苯基)-P底噢将l-溴画4-硝基苯(6g， 29.7mmol)和l曙乙基旅嚷(7.6mL， 59.4mmo1， 2当 量)的混合物加热至80。C历经15小时。冷却至室温后，浓缩该反应混合物。 残余物经硅胶柱色i普(DCM/MeOH ， 95: 5)纯化以提供为黄色固体的标题 化合物ESI-MS: 250.1 [MH+; tR= 2.57分钟(纯度100%，系统1); TLC: Rf=0.16(DCM/MeOH，95: 5)。实施例13: 1-{6-4-"-苄基-哌唤-1-基)-苯基氨基1-嘧咬-4-基}-3"2.6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-l-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 621.9 / 623.9 [MHj+; tR= 4.04分钟(纯度100%,系统l)。步骤13.1: N44-(4-苄基-哌唤-l-基)-苯基l-N，-曱基-嘧咬-4，6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 375.1 IMH]+; tR= 2.36分钟(纯度95%,系统1)。歩骤13.2: 4-(4-爷基-旅唤-l-基V苯基胺将铁粉(5.4g， 97mmo1， 4当量)分成几部分加入80。C的l-千基-4-(4-硝 基-苯基)-p底噪(7.2g ， 24.2mmo1) 、 EtOH(l 50mL) 、 H2O(40mL)和AcOH(20mL) 的混合物中。将该反应混合物在80。C下搅拌1.75小时，冷却至室温并浓缩。 用EtOAc和饱和Na2C03水溶液稀释该残余物。分离各层并用EtOAc萃 取水相。用盐水洗涤合并的有机相，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩以提供标 题化合物ES-MS: 268，MH广；在tR= 1.30分钟时单峰(系统1)。歩骤13.3: l-爷基-4-(4-硝基-苯基)-派溱将l-溴陽4-硝基苯(5g， 24,8mmol)和l画千基派漆(8.6mL， 49.5mmo1， 2当量)的混合物加热至80。C历经17小时。将该反应混合物冷却至室温，并用 DCM/H20稀释。分离各层并用DCM萃取水相。用盐水洗涤合并的有机 相，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱(己烷/EtOAc， 1: l)纯化以提供为黄色固体的标题化合物ESI-MS: 298.3 [MH+; tR= 3.25 分钟(纯度100%,系统l)。实施例14: 3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-甲基-1-『6-(4-哌溱-1-基-苯基氨基)-嘧咬-4-基l-脲在氢气中将1-{6-[4-(4-苄基-哌溱-1-基)-苯基#^-嘧啶-4-基}-3-(2，6-二氯隱3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-l-甲基-脲(100mg， 0.161mmol)(实施例13)、 钇碳(30mg)、 MeOH(6mL)和HC1(37%， 16L)的混悬液在室温下搅拌5天。 过滤并浓缩该反应混合物。残余物经珪胶柱色镨(DCM/2NNH3在MeOH 中，95: 5)纯化以提供为驼色固体的标题化合物ESI-MS: 532.0/534.0MH+; tR= 3.39分钟(纯度100%，系统l)。实施例15: 3-(2-氯-3,5-二曱氧基-6-曱基-苯基M-6-(3-二甲基絲曱 基-苯基絲)-嘧咬-4-基1-1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 485.0 / 487.0 [MH]+; tR= 3.69分钟(纯度100%，系统1)。实施例16: 3-(2-氯-3，5-二曱氧基-6-甲基-苯基)-1-{6-『3-(4-乙基-派唤 -1-基)-苯基氨基1-嘧咬-4-基"-曱基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 540.0 / 542.0 [MH]+; tR= 3.74分钟(纯度100%,系统l)。实施例17: 3-(2-氯-3，5-二甲IU^6-甲基-苯基)-l-曱基-l-(6-f4-(2-吡咯 烷-l-基-乙氧基)-苯基氨基l-嘧咬-4-基Vl-曱基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 541.0 / 543.0 [MH+; tR= 3.66分钟(纯度100%,系统l)。步骤17.1: N-甲基-N，-4-(2-吡咯烷-l-基-乙氧基)-苯基l-嘧咬-4，6-二胺 标题化合物以类似于步骤2.1所述的方法来制备ESI-MS: 314.MH广；tR= 1.15分钟(系统1); TLC: Rf = 0.15(DCM/MeOH + 1 % NH3aq，9: 1)。歩骤17.2: 4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基胺标题化合物以类似于步骤1.2所述的方法来制备ESI-MS: 207.1[MH+; TLC: Rf = 0.22(DCM/MeOH， 1: 1)。实施例18: 3-(2-氯-3,5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-1-曱基-1-{6-3-氟-4"2-吡咯烷-l-基-乙緣)-苯基絲l-嘧咬-4-基卜l-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 578.9 / 580.9 [MH+; tR= 3.96分钟(纯度100%,系统1); TLC: Rf = 0.38(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 92: 8)。步骤18.1: N-3-氟-4-(2-吡咯烷-l-基-乙氧基)-苯基l-N，-甲基-嘧咬-4.6-二胺标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 332.2 1MHj+; tR= 130分钟(系统1); TLC: Rf = 0.37(DCM/MeOH + 1 % NH/q， 99: 1)。步骤18.2: 3-氟-4-(2-吡咯烷-1-基-乙氣基)-苯基胺在氢气中将l-[2-(2-氟-4-硝基-苯氧基)-乙基-吡咯烷(1.25g， 4.92mmo1) 和10%钇碳(0.2 g)在EtOH(20mL)的混悬液在室温下搅拌1小时。将反应 混合物经硅藻土垫过滤并浓缩以提供为棕色油的标题化合物ESI-MS: 225.1 [MH+; tR= 0.80分钟(系统1)。歩骤18.3: 142-(2-氟-4-硝基-苯氧基)-乙基l-吡咯烷 将l-(2-氯-乙基)-吡咯烷盐酸化物(1.2g，7.0mmo1， 1.1当量)加入2-氟-4-硝基苯酚(lg, 6.4mmol)和碳酸铯(5.2g， 15.9mmo1， 2.5当量)在DMF(20mL) 的混悬液中。将所得混合物加热至80。C并搅拌18小时。加入额外的1-(2-氯-乙基)-吡咯烷盐酸化物(lg)并在80。C下搅拌该混合物3小时。将反应混 合物冷却至室温，用EtOAc和H20稀释。分离各层并用EtOAc萃取水层。 用H20洗涤有机相，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱 (DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)纯化以提供为黄色固体的标题化合物。ESI-MS : 255.MH+ ; tR= 2.57分钟(系统1) ; TLC : Rf = 0.55(DCM/MeOH + 1 % NH3aq, 95: 5)。实施例19: 342,6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-14"1-乙基-哌啶-4-基)-苯基絲1-嘧咬-4-基}-1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 558.9 / 560.9MH广；tR= 3.85分钟(纯度100%，系统1); TLC: Rf = 0.14(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)。步骤19.1: N-4-(l-乙基-哌咬-4-基)-苯基-1\，-甲基-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 312.MH1+; tR= 1.3分钟(系统1); TLC: Rf = 0.27(DCM/MeOH + 1 % NH/q，92: 8)。步骤19.2: 4-(1-乙基-哌咬-4-基)-苯基胺在氢气中将l-乙基-4-(4-硝基-苯基)-哌啶(0.8g, 4，92mmol)和10%钯 碳(O.l g)在EtOH(10mL)中的混悬液在室温下搅拌3小时。将反应混合物 经硅藻土垫过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)纯化以提供标题化合物。ESI-MS: 205.1 [MH+; TLC: Rf = 0.29(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)。歩骤19.3:1-乙基-4-(4-硝基-苯基)-哌啶将三乙酰氧基硼氩化钠(3.1g， 14.6mmo1，3当量)加入冷却的(5。C)4-(4-硝基-苯基)-派咬(lg， 4.9mmol)和乙醛(0.82mL， 14.6mmo1， 3当量)在 DCM(20mL)的溶液中。将该反应混合物在5'C下搅拌1小时后用DCM和 NaHC03饱和水溶液稀释。分离各层并用DCM萃取水层。有才^4目用盐水 洗涤，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色镨(DCM/MeOH + l%NH3aq，98: 2)纯化以提供为黄色油的标题化合物。ESI-MS: 235.1[MHI; tR= 2.64分钟(纯度85%，系统1);TLC: Rf = 0.14(DCM/MeOH + 1 % NH/q， 98: 2)。步骤19.4: 4-f 4-硝基-苯基)-哌咬将浓H2S04(2.65mL)在AcOH(40mL)的溶液和浓HNO:j(2.1mL)在 AcOH(20mL)的溶液依此逐滴加入4-苯基哌咬在AcOH(40mL)的溶液中， 保持温度低于20。C。然后，加入浓H2SO4(40mL)(不进行冷却；内部温度 达到60'C)。将反应混合物冷却至室温，将其倒在冰/水(100 g)上，通itia 入固体NaHC03(150 g)中和，并用DCM萃取。有才;^目用盐水洗涤，干燥 (Na2S04)，过滤并浓缩。残余物在Et20中研磨纯化以提供为黄色固体 的标题化合物。ESI-MS: 207.1 [MH+; tR= 2.42分钟(系统1)。实施例20: 3-(2,6-二氯-3,5-二曱氧基-苯基)-l-乙基-1-{6-4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯基絲l-嘧咬-4-基V脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 573.9 / 575.9 [MH]+; tR= 3.69分钟(纯度100%，系统l)。歩骤20.1: N-乙基-N'-4-(4-乙基-哌噢-l-基)-苯基卜嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备 ESI-MS: 327.MH]+; 、=1.5分钟(系统1)。实施例21: 3-(2,6-二氯-3,5-二曱猛-苯基)-1-{6-〖2-氟-4-(2-处咯烷-1-基-乙氧基)-苯基氨基1-嘧啶-4-基卜1-曱基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备ESI-MS: 578.9 / 580.9 [MH]+; tR= 3.79分钟(纯度100%,系统1)。歩骤21.1: N画『2-氟-4画(2-吡咯烷-l画基画乙氧基)-苯基l画N，-曱基画嘧啶画4,6隱二胺标题化合物以类似于步骤2.1所述的方法来制备ESI-MS: 332.2 [MH+。步骤21.2: 2-氟-4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基胺在氢气中将l-[2-(3-氟-4-硝基-苯氧基)-乙基-吡咯烷(1.96g， 7.7mmo1) 和10%把碳(0.2 g)在MeOH(40mL)中的混悬液在室温下搅拌0.5小时。将 反应混合物经硅藻土垫过滤并浓缩以提供标题化合物。ESI-MS: 225.1 [MH+; tR= 0'95分钟(系统1)。歩骤21,3: 1-『2-(3國氟-4-硝基-苯猛)-乙基l-吡咯烷 将l-(2-氯-乙基)-吡咯烷盐酸化物(2.6g， 15.4mmo1， 1.3当量)加入2-氟 -4-硝基苯酚(1.84g， 11.7mmol)和碳酸铯(9.1g， 27，9mmo1， 2.5当量)在 DMF(40mL)的混合物中。将所得混合物加热至8(TC并搅拌3小时。将反 应混合物冷却至室温后，用DCM和H20稀释。分离各层并用DCM萃取 水层。有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SOj，过滤并浓缩。残余物经硅胶 柱色语(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 97: 3)纯化以提供1.96g为暗黄的固体 的标题化合物。ESI-MS: 255.1 [MH]+; tR= 2.55分钟(纯度93%，系统 1); TLC: Rf = 0.40(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 93: 7)。实施例22: 3-(2,6-二氯-3,5-二曱氧基-苯基)-1-{6-『4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-2-甲氧基-苯基氨基卜嘧咬-4-基1-1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备API-MS: 589.9 / 591.8MH+; tR= 3.59分钟(系统1); TLC: Rf = 0.13(DCM/MeOH + 0.5 %NH3aq，95: 5)。步骤22.1: N-4-(4-乙基-哌溱-l-基)-2-甲氧基-苯基l-N'-曱基-嘧咬-4,6-二胺标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 343.2[MH+; 、=1.30分钟(系统1)。步骤22.2: 4-(4-乙基-哌唤-1-基)-2-甲絲-苯基胺在氢气中将l-乙基-4-(3-甲氧基-4-硝基-苯基)-哌噪(4g， 15.1mmol)和拉 尼镍(l g)在MeOH(80mL)中的混悬液在室温下搅拌10.5小时。将反应混合 物经硅藻土垫过滤并浓缩以提供为棕色油的标题化合物ESI-MS: 236.2 [MH+; tR= 0.95分钟(系统1)。步骤22.3:1-乙基-4-(3-曱氧基-4-硝基-苯基)-旅唤 标题化合物以类似于在步骤248.3中所述的方法来制备ESI-MS:266.1 [MH]+。实施例23: 3-(2,6-二氯-3,5-二曱氧基-苯基)-146-4-(4-乙基-咪唤-l-羰基)-苯基氨基1-嘧咬-4-基}-1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例233所述的方法来制备API-MS: 587.8 / 589.8 [MH]+; tR= 3.58分钟(纯度94.8%,系统1); TLC: Rf = 0.47(DCM/2N NH3在MeOH中，9: 1)。歩骤23.1: (4-乙基-哌嗪-l-基)-4-(6-曱基氨基-嘧啶-4-基M)-苯基l-曱酮在氩气中在室温下将丙基磷酸酐(50% in DMF， 2.72mL， 4.7mmol， 2当 量)加入4-(6-甲基氨基-嘧咬-4-基M)-苯甲酸(0.570g, 2.33mmol)、 N-乙基 4#<0.33mL， 2.57mmol， 1.1当量)、DMAP(7mg)和Et3N(3.3mL， 23.3mmol, 10当量)在DMF(25mL)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，用 EtOAc稀释并用H20洗涤。用EtOAc萃取水层。用盐水洗涂合并的有机 相，干燥(Na2S04),过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色语(DCM — DCM/2N NHb在MeOH中，86: 14)纯化以提供为黄的泡沐的标题化合物ES-MS:341.2 [MH]+; tR= 1.00分钟(系统1); Rf = 0.33(CH2Cl2/2 N冊3在MeOH中，9: 1)。步骤23.2: 4-(6-甲基絲-嘧咬-4-基絲V苯甲酸 标题化合物以类似于步骤2.1所述的方法来制备ESI-MS: 245.0MH+; 、=1.58分钟(系统1)。实施例24: 3-a6漏二氯羅3,5羅二甲氧基-苯基)-1-{6-4"4画乙基-哌凑-l画 基)-3-氟-苯基氨基l-嗜咬-4-基Vl-曱基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备API-MS: 577.9 / 579.9 [MH+; tR= 3.87分钟(纯度卯％，系统1); TLC: Rf = 0.20(DCM/MeOH + 1 %冊3叫，95: 5)。步骤24.1: N-4-(4-乙基-哌唤-l-基)-3-氟-苯基l-N'-甲基-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤2.1所述的方法来制备，但在微波装置中在160。C搅拌该反应混合物15分钟。粗产物经在EtOAc中研磨纯化以提供标题化合物ESI-MS: 331.2 [MH]+。歩骤24.2: 4-(4-乙基-旅唤-l-基)-3-氟-苯基胺在氢气中将l-乙基4-(2-氟4-硝基-苯基)-哌嗪(l.!2化，1S.lmmol)和拉 尼镍(13mg)在MeOH(6mL)中的混悬液在室温下搅拌17小时。将反应混合 物经硅藻土垫过滤并浓缩以提供为紫红色油的标题化合物ESI-MS: 224.1 [MH+; 、=0.90分钟(系统1)。歩骤24.3:1-乙基-4-(2-氟-4-硝基-苯基)-哌唤将N-乙基旅噪(0.96mL， 7.6mmo1， 1.2当量)加入3，4-二氟硝基苯(0.7mL 6.32mmol)和碳酸钾(1.74g， 12.6mmo1， 2当量)在DMF(10mL)的混合物中。 将该反应混合物在9(TC搅拌17小时，冷却至室温，用H20稀释并用DCM 萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物经珪胶柱色谱(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 97: 3)纯化以提供为黄色固体的标题化 合物ES-MS: 254.1 [MH+; tR= 2.65分钟(系统1); Rf = 0.30(DCM/MeOH + 1 % 93: 7)。实施例25: 3-(2,4-二氯-5-甲氧基-3-三氟甲基-苯基)-1-{6-4-(4-乙基-哌唤-1-基)-苯基絲1-嘧咬-4-基}-1-曱基-脲在氮气中将光气(在甲苯中20%, 0.54mL， l.Ommol， 2.0当量)加入2，4-二氯-5-甲氧基-3-三氟曱基苯胺(156mg， 0.60mmo1, 1.2当量)在二嚅烷(2mL) 的溶液中。将该混合物加热至回流，搅拌75分钟，冷却至室温，并在真空 中浓缩。在氮气中将所得的固体2，4-二氯-5-甲氧基-3-三氟甲基-苯基异氰酸 酯分几部分加入沸腾的N-4-(4-乙基-哌溱-l-基)-苯基卜N，-甲基-嘧啶-4，6-二 胺(156mg， 0.50mmol;制备方法参见步骤25.5)在6mL甲苯的溶液中。将 该反应混合物在110。C搅拌3.3小时，冷却至室温，并用DCM和饱和 NaHC03水溶液稀释。分离水层并用dcm萃取两次。有机相用盐水洗涤， 干燥(Na2SOj，过滤并浓缩。用两部分MeOH研磨所得固体以获得标题 化合物ESI-MS: 598/600 [MH+; tR= 5.1分钟(纯度97%,系统l)。步骤25.1: 2,4-二氯-5-甲氧基-3-三氟曱基苯胺将2M的KOH水(1.87mL)溶液加入N-(2，4-二氯-5-甲^J^3-三氟甲基 -苯基)-乙酰胺(104mg， 0.344mmol)在EtOH(3mL)的溶液中。在80。C搅拌 3.5小时后冷却至室温，蒸干溶剂并将残余物溶于EtOAc和饱和NaHC03 水溶液中。分离的水层用EtOAc萃取两次。有机相用盐水洗涤，干燥 (Na2S04)，过滤并浓缩，以提供标题化合物ESI-MS: 258/260 [M-H-; tR= 4.8分钟(系统1); TLC: Rf = 0.54(EtOAc)。步骤25.2: N-(2，4-二氯-5-曱氧基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺 在氮气中将N-(5-甲氧基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺(233mg， l.Ommol)溶液在冰浴中冷却(沉淀)。然后加入im的so2a2& dcm中的溶液1.93mL。 2小时后，再加入1.93mL的S02Cl2溶液并在0。C连续搅拌共4 小时。用DCM和饱和NaHC03水溶液稀释该混悬液。用DCM萃取分离 的无机相两次。用水和盐水洗涤有树目，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。柱 色谱(己烷/EtOAc，7: 3)以提供标题化合物mp: 143-144。C; API-MS: 300 / 302 [M画H；TLC: Rf = 0.23(己烷/EtOAc， 1: 1); 'H画NMR(DMSO-d6) 5 2.13(s， H3C)， 3.88(s, H3C)， 7.84(s, H苯基)，9.81(s， HN)。步骤25.3: N-(5-曱氧基-3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺在25-33。C的温度下将乙酸酐(1.22mL， 12.8mmol)历经10分钟加入5-甲氧基-3-三氟甲基-苯胺(2.29g， 12.0mmol)在甲苯(10mL)的溶液中。在室 温下90分钟后，加入己烷(10mL)并将该混悬液搅拌20分钟。过滤，用甲 苯/己烷2: 1和己烷洗涤以提供标题化合物mp: 123-124°C; API-MS: 234[MH+; TLC: Rf = 0.27(己烷/EtOAc， 1: 1)。歩骤25.4: 5-甲氣基-3-三氟甲基-苯胺在Pd-C(0.62g， 10%)的存在下将3_甲氧基-5-硝基三氟甲基苯(6.19经， 28mmol)在MeOH(140mL)的溶液进行氢化，经过滤除去催化剂并在真空 下浓缩所得滤液以提供标题化合物API-MS: 190 [M-H]-; TLC: Rf = 0.7(EtOAc)。歩骤25.5: N-4-(4-乙基-派唤-l-基V苯基l-N，-曱基-嘧啶-4,6-二胺 将4-(4-乙基哌療-l-基)-苯胺(lg，4.8811111101)(类似于实施例"8的方法 制备，步骤238.1)、 (6-氯-嘧咬-4-基)-甲基-胺(1.81g， 12.68mmo1，1.3当量) 和4N的HC1在二巧悉烷(15mL)的混合物在封闭的试管中加热至150。C历经 5小时。浓缩该反应混合物，用DCM和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。分离水层并用dcm萃取。用盐水洗涤有4;i4目，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。残余物经珪胶柱色谱(DCM/MeOH， 93: 7)纯化后经在乙醚中研磨以提供 为白色固体的标题化合物ESI-MS: 313.2 [MH]+; ^=1.10分钟(系统1); TLC: Rf = 0.21(DCM/MeOH， 93: 7)。实施例26: 3-(5-甲猛-3-三氟甲基-苯基Vl-f6-4-(4-乙基-p底溱-l-基V 苯基氨基1-嘧咬-4-基}-1-曱基-脲在氮气中将光气(在甲苯中20%， 1.62mL， 3.0mmo1， 2.0当量)加入5-曱 氧基-3-三氟曱基苯胺(344mg， 1.8mmo1， 1.2当量)在二巧悉烷(6mL)的溶液中。 将该混合物加热至回流，搅拌80分钟，冷却至室温，并在真空中浓缩。 45分钟内，在氮气中将浓缩的所得油状5-甲氧基-3-三氟曱基-苯基异氰酸 酯在甲苯中的溶液分几部分加入沸腾的]\-[4-(4-乙基-腺唤-1-基)-苯基1-]\'-甲基-嘧啶-4，6-二胺(468mg， 1.50mmol;步骤242.1)在18mL曱苯的溶液中。 将反应混合物在110。C搅拌4小时，冷却至室温，并用DCM和饱和NaHC03 水溶液稀释。分离水层并用DCM萃取两次。用盐水洗涤有机相，干燥 (Na2S04),过滤并浓缩。柱色谱(DCM/MeOH，49: 1 — 24: l)以提供标题 化合物API-MS: 530 / 532 [MH+; TLC: Rf = 0.4(DCM/MeOH， 9: 1); t^4.3分钟(纯度100%，系统l)。实施例27: 3-(5-曱氧基-3-三氟甲基-苯基)-1-{6-3-氯-4-(4-乙基-哌唤 -1-基)-苯基氨基1-嘧啶-4-基}-1-曱基-脲历经27小时，将0.4mL的1M的S02Ch在DCM的溶液分几部分重 复加入水冷却的3-(5-甲|^-3-三氟甲基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌溱-1-基)-苯基氨基卜嘧咬-4-基)-l-曱基-脲(105mg， 0.20mmol)(实施例26)在乙腈(6mL) 的混悬液中。随后该反应经HPLC分析。用DCM和饱和NaHC03水溶液 稀释反应混合物(仍包含原料)。分离水层并用DCM萃取两次。用盐水洗 涤有机相，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。反相MPLC(H20/CH3CN + 0.1 % TFA)，用NaHC03中和包含产物的流份后，部分浓缩并用DCM萃取以提 供标题化合物API-MS: 564 / 566 [MH；TLC: Rf = 0.28(DCM/MeOH + 1 %冊3叫，95: 5);H-匪R(DMSO-d6) 5 1.02 (t， H3C)， 2.37 (q， H2C), 2.51(m， 4H)， 2.92(m， 4H)， 3.33(s， H3C)， 3.82(s， H3C)， 6.48(s， 1H)， 6辟，1H)，7.12(d， 1H)， 7.43(m， 2H)， 7.59(s， 1H)， 7.82(s， 1H)， 8.55(s， 1H)， 9.66(s， HN)， 12.33(s， HN)。实施例28: 1-{6-2-氯-4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基1-嘧啶-4-基V3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-l-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备(在回流下搅拌1小时 20分钟)ESI-MS: 593.8 / 595.8 [MH+; tR= 3.80分钟(纯度95%,系 统l); TLC: Rf = 0.45(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)。步骤28.1: ]\42-氯-4-(4-乙基-咪唤-l-基)-苯基l-N'-甲基-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备ESI-MS: 347.1 / 349.1 [MH+; TLC: Rf = 0.15(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)。歩骤28.2: 2-氯-4-(4-乙基-哌唤-l-基)-苯基胺在氢气中将l-(3-氯-4-硝基-苯基)-4-乙基-哌唤(lg， 3.7mmol)和拉尼镍 (0.1 g)在MeOH(20mL)中的混悬液在室温下搅拌8小时。将反应混合物经 硅藻土垫过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谦(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)纯化以提供为米色固体的标题化合物ESI-MS: 240.1 / 242.1 [MH+; tR= 0，卯分钟(系统1); TLC: Rf = 0.46(DCM/MeOH + 1 % NH/q， 95: 5)。歩骤28.3:l-(3-氯陽4-硝基画苯基)-4曙乙基國哌唤将N-乙基旅,(4.3mL， 34.3mmo1， 1.2当量)加入2画氯-4-氟硝基苯(5g， 28.6mmol)和碳酸钾(7.9g， 57.1mmo1， 2当量)在DMF(50mL)的混合物中。 在100。C下搅拌该反应混合物6小时，冷却至室温，用1120稀释并用EtOAc 萃取。有机相用盐水洗涤，干燥(Na2S04)，过滤并浓缩。残余物经在乙 醚中研磨纯化以提供5.6g为黄色固体的标题化合物ES-MS: 270.0 [MH]+; tR= 2.90分钟(系统1)。实施例29: 3-f2,6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-4-(4-乙基-哌唤-l-基)-2-氟-苯基#^卜嘧咬-4-基}-1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例2所述的方法来制备(在回流下搅拌1小 时，并用EtOAc代替DCM萃取产物)ESI-MS: 577.9 / 579.9 [MH+; tR= 4.00分4中(纯度>95%，系统1); TLC: Rf = 0.35(DCM/MeOH + 1 % 冊3叫，97: 3)。步骤29.1: N-14"4陽乙基-哌唤-l醫基)-2國氟-苯基l-N'曙甲基-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤2.1所述的方法来制备，但在微波装置中在 160。C搅拌该反应混合物1小时，并用EtOAc代替DCM萃取产物。标题 化合物ESI-MS: 331.1 [MH+; TLC: Rf = 0.10(DCM/MeOH + 1 % NH/q，95: 5)。步骤29.2: 4-(4-乙基-哌唤-l-基)-2-氟-苯基胺在氢气下将l-乙基-4-(3-氟-4-硝基-苯基)-哌嗪(7g, 27.7mmol)和 Pd(10。/。)碳(0.35 g)在MeOH(140mL)中的混悬液在室温下搅拌3小时。将 反应混合物经硅藻土垫过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色语(DCM/MeOH + 1 %NH3aq，95: 5)纯化以提供为白色固体的标题化合物ESI-MS: 224.1 1MH+; TLC: Rf = 0.54(DCM/MeOH + 1 %冊3叫，95: 5)。歩骤29.3:1-乙基-4-(3-氟-4-硝基-苯基)-哌溱将N-乙基艰療(4.8mL， 37.7mmo1， 1.2当量)加入2，4-二氟硝基苯(5g, M.4mmol)和碳酸钾(8.7g, 62.9mmo1， 2当量)在DMF(50mL)的混合物中。 将反应混合物在100。C下搅拌6小时，冷却至室温，用1120稀释并用EtOAc 萃取。有机相用盐水洗涂，干燥(Na;tS04)，过滤并浓缩。残余物经硅胶 柱色谱(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)纯化以提供为黄色油的标题化合 物ES-MS: 254.1 [MH+; TLC: Rf = 0.67(DCM/MeOH + 1 % NH3aq， 95: 5)。实施例30: 3-(2,6-二氯-3，5-二甲絲-苯基)-1-{6-6-(4-异丙基,底凑-1-基)-吡咬-3-基氨基l-嘧咬-4-基Vl-甲基-脲标题化合物以类似于实施例1所述的方法来制备(2当量光气用于形成 异氰酸酯，在随后的步骤中在70。C搅拌16小时，并用EtOAc代替DCM 萃取产物)ESI-MS: 574.8 / 576.8 [MH+; tR= 3.32分钟(系统1); TLC: Rf = 0.10(DCM/MeOH/NH/q，94: 5: 1)。步骤30.1: N-6-(4-异丙基-派唤-1-基)-吡啶-3-基1-!^'-甲基-嘧啶-4,6-二胺标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备。标题化合物 ESI-MS: 328.2 [MH+。歩骤30.2: 6-(4-异丙基-哌唤-l-基)-吡咬-3-基胺将铁粉(1.4g， 25.3mmo1，4当量)、l-异丙基-4-(5-硝基-吡咬-2-基)-派噪 (1.58g， 6.32mmo1)、 EtOH(20mL)、 H20(5mL)和AcOH(2.5mL)的混合物 在卯。C下搅拌2小时，冷却至室温，通过加入氨水调至碱性，经硅藻土垫 过滤并部分的浓缩除去EtOH。残余物水溶液用氯化钠饱和并用EtOAc和 DCM萃取。用盐水洗涂合并的有机相，千燥(Na2S04),过滤并浓缩。残余 物经硅胶柱色语(DCM/MeOH/NH3叫，91: 8: l)纯化以提供为紫红色固体的 标题化合物ESI-MS: 221.1 [MH+; TLC: Rf = 0.20(DCM/MeOH/NH3aq， 91: 8: 1)。步骤30.3: l-异丙基-4-(5-硝基-吡咬-2-基)-哌嗪(NVP-BKT293) 将N-异丙基旅噪(1.8mL， 12.7mmo1， 2当量)加入冷却的(5。C)2-氯-5-硝 基吡咬(lg， 6.3mmol)在DCM(5mL)的混合物中。将反应混合物温至室温， 搅拌16小时，用DCM/H20稀释并用DCM萃取。用盐水洗涤有才M目，干 燥(Na2SCM，过滤并浓缩以提供为黄色固体的标题化合物ES-MS: 251.2[MH+; tR= 2.20分钟(系统1)。实施例31: 3-(2,6-二氯-3,5-二甲氣基-苯基)-1-{6-6-(4-乙基-哌噢-l-基)-吡啶-3-基絲1-嘧咬-4-基}-1-甲基-脲标题化合物以类似于实施例1所述的方法来制备(2当量光气用于形成 异氰酸酯，在随后的步骤中在回流下搅拌4小时，并用EtOAc代替DCM 萃取产物)ESI-MS: 560.8 / 562.8 [MHj+; tR= 3.20分钟(系统1); TLC: Rf=0.35(DCM/MeOH/NH3aq，94: 5: 1)。步骤31.1: N-6-(4-乙基-哌唤-l-基)-吡啶-3-基l-N'-曱基-嘧咬-4,6-二胺 标题化合物以类似于步骤1.1所述的方法来制备。标题化合物 ESI MS: 314.2 [MH+; TLC: Rf = 0.20(DCM/MeOH/NH3aq， 91: 8: 1)。步骤31.2: 6-(4-乙基-派溱-l-基)-吡咬-3-基胺在氢气下将1-乙基-4-(5-硝基-吡咬-2-基)-哌*(1.4 g)和拉尼镍(140mg) 在MeOH(30mL)的混悬液在室温下搅拌10小时。将反应混合物经珪藻土 垫过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色傳(DCM/MeOH/NH3aq,94: 5: l)纯化以 提供为紫红色油的标题化合物ESI-MS: 207.1 [MH]+; TLC: Rf = 0.26(DCM/MeOH/NH/q， 94: 5: 1)。步骤31.3:1-乙基-4-(5-硝基-吡咬-2-基)-旅唤标题化合物以类似于步骤30.3所述的方法来制备，但使用N-乙基哌 溱。标题化合物 ES-MS : 237.1 [MH+ ; TLC : Rf = 0.25(DCM/MeOH/NH3aq， 96: 3: 1)。实施例32:软胶嚢5000个软胶嚢，各自包含作为活性成分的在之前实施例1-29中任何 一个提到的任何一个式IA化合物0.05g，或者其按照下述内容来制备组成活性成分 250 gLauroglycol 2升制备方法将粉化的活性成分悬浮在LauroglykoF(丙烯乙二醇月桂 酸酯，Gattefoss6 S.A.， Saint Priest,法国)中并在湿润的粉碎机内研磨以生 产大小约l-3pm的颗粒。然后用装胶嚢机将每部分0.419g的混合物装入软 胶嚢中。实施例33:包含式IA化合物的片剂片剂包含作为活性成分的在之前实施例1-29中任何一个的任何一个 式IA化合物100mg，其按照下述组成、下述标准方法来制备 组成活性成分 100mg 结晶性乳糖 240mg Avicel 80mg PVPPXL 20mg Aerosil 2mg 硬脂酸镁 5mg447mg制备将活性成分与栽体材料混合并通过压片机压制(Korsch EKO， 压才莫直径10 mm)。Avice條是微晶纤维素(FMC，美国费城)。PVPPXL是聚乙烯聚吡咯烷 酮，交叉相连(BASF，德国)。Aerosil⑧是二氧化硅(Degussa，德国)。
权利要求
1.式IA的化合物，其中X、Y和Z中的两个是N(氮)，第三个是CH或N(优选地，Y和Z是N，且Z是CH)；并且或者其中，R1是被羟基、苯基-C1-C7-烷氧基、哌嗪-1-基或4-(苯基-C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基所取代的苯基；或者被(i)卤素或C1-C7-烷氧基以及除此之外被(ii)羟基、苯基-C1-C7-烷氧基、N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基-C1-C7-烷基、吡咯烷子基-C1-C7-烷氧基、1-(C1-C7-烷基)-哌啶-4-基、吗啉代-C1-C7-烷氧基、硫吗啉代-C1-C7-烷氧基、哌嗪-1-基、4-(苯基-C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基、4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基、[4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基]-C1-C7-烷基、N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基-C1-C7-烷基、N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基-C1-C7-烷氧基、[4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基]-C1-C7-烷氧基、[4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基]-羰基所取代的苯基；R2是氢、C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基或卤素；R3是氢、C1-C7-烷基或苯基-C1-C7-烷基，R4各自独立地是C1-C7-烷基、卤素-C1-C7-烷基、卤素或C1-C7-烷氧基，且n是0、1、2、3、4或5；或者R1是被羟基、苯基-C1-C7-烷氧基、哌嗪-1-基、4-(苯基-C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基；N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基-C1-C7-烷基、吡咯烷子基-C1-C7-烷氧基、1-(C1-C7-烷基)-哌啶-4-基、吗啉代-C1-C7-烷氧基、硫吗啉代-C1-C7-烷氧基、4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基、[4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基]-C1-C7-烷基、N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基-C1-C7-烷基、N-单-或N，N-二-(C1-C7-烷基)-氨基-C1-C7-烷氧基、[4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基]-C1-C7-烷氧基、[4-(C1-C7-烷基)-哌嗪-1-基]-羰基所取代的苯基；或者带有一个本段中提到的取代基，和除此之外选自卤素以及C1-C7-烷氧基的取代基的苯基；R2是氢、C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基或卤素；R3是氢、C1-C7-烷基或苯基-C1-C7-烷基，R5是氢(优选)、C1-C7-烷基或苯基-C1-C7-烷基，并且或者n是3、4或5且R4选自C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基和卤素，条件是C1-C7-烷基、C1-C7-烷氧基和卤素中各自至少存在一个；或者n是2且一个R4是卤素-C1-C7-烷基，另一个R4是C1-C7-烷氧基；或者n是3、4或5且R4选自卤素、碘代和C1-C7-烷氧基，条件是卤素、碘代和C1-C7-烷氧基中各自至少存在一个；或者n是3、4或5且R4选自卤素、卤素-C1-C7-烷基和C1-C7-烷氧基，条件是卤素、卤素-C1-C7-烷基和C1-C7-烷氧基中各自至少存在一个；或者Y是Z是N(氮)且X是CH，或者其中R1是被N-C1-C7-烷基-哌嗪-1-基单取代的3-吡啶基，R2是氢，R3是氢，R4各自独立地是C1-C7-烷基、卤素-C1-C7-烷基、卤素或C1-C7-烷氧基，R5是氢且n是1、2、3、4或5；或者式IA的化合物，其中R1是4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨基，R2是氢，R3是氢，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，R5是氢，Y和Z是N且X是CH；或者式IA的化合物，其中R1是3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯基氨基，R2是氢，R3是甲基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，R5是氢，Y和Z是N且X是CH，或者式IA的化合物，其中R1是3-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基，R2是氢，R3是甲基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，R5是氢，Y和Z是N且X是CH，或者式IA的化合物，其中R1是4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨基，R2是氢，R3是甲基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，R5是氢，Y和Z是N且X是CH，或者式IA的化合物，其中R1是4-(1-乙基-哌啶-4-基)-苯基氨基，R2是氢，R3是甲基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，R5是氢，Y和Z是N且X是CH，或者式IA的化合物，其中R1是4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基，R2是氢，R3是乙基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，R5是氢，Y和Z是N且X是CH，和/或或者式IA的化合物，其中R1是4-(4-乙基-哌嗪-1-羰基)-苯基氨基，R2是氢，R3是甲基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，R5是氢，Y和Z是N且X是CH；或者两个或多个式IA化合物的混合物；或其盐、前药、N-氧化物和/或酯。
2.如权利要求1所述的式IA化合物，其中X、 Y和Z中的两个是N(氮)，第三个是CH或N(优选地，Y和Z是 N，且Z是CH);并且 或者其中，r1是被羟基、苯基-c广C7-烷氧基、哌溱-i-基或4-(苯基-<:1-<:7-烷基)-哌溱-l-基所取代的苯基；或者被(i)卤素或d-CV垸氧基以及除此之外被(ii) 羟基、苯基-C，画C7画烷IL^、 N-单-或N，N-二-(C广CV烷基)-^J^d画C7匿烷基、 吡咯烷子基-C,-CV烷氧基、l-(C,-CV烷基)-哌啶-4-基、吗啉代-C广CV烷氧 基、硫吗啉代-d-O烷氧基、哌唤-l-基、4-(苯基-d-CV烷基)-哌噪-l-基、 4-(d誦C7画烷基)誦哌唤画l画基、[4-(d漏C7-烷基)陽哌嗪-l-基]國C广C7-烷基、N-单画 或N，N-二-(d-C7-烷基)-氨基-d-C7-烷基、N-单-或N，N-二-(C，-C7-烷基)-氨 基-d-Cr烷氧基、[4-(C广C7-烷基)-哌嗪-l-基]-d-CV烷氧基、[4-(d-CV烷基)-哌溱-l-基-羰基所取代的苯基；R2是氢、C广CV烷基、d-Cr烷氧基或卤素； R3是氢、d-C7-烷基或苯基-d-C7-烷基，1^各自独立地是C广Cr烷基、面素-C厂C7-烷基、卣素或C广CV烷氧基， RS是氢(优选)、d-C7-烷基或苯基-CrC7-烷基， 且n是0、 1、 2、 3、 "5'， 或者R1是被羟基、苯基-CVO烷氧基、哌嗪-l-基、4-(苯基-d-C7-烷基)-哌嗪-l-基；N-单-或N，N-二-(d-CV烷基)-氨基-d-C7-烷基、吡咯烷子基 -d-CV烷氧基、l-(d-C"烷基)-哌咬-4-基、吗啉代-d-CV烷氧基、硫吗啉代—d一C7一烷氧基、4-(d-c"烷基)-哌嗪-i-基、[4-(<:1-(:7-烷基)-哌嗪-1-基]-OO烷基、N-单-或N，N-二-(d-C7-烷基)-氨基-CVC7-烷基、N-单-或 N，N- 二 -(d-CV烷基)-氨基-d-CV烷氧基4-(d-(V烷基)-哌嗪-1-基l-C广C7-烷氧基、[4-(C广C7-烷基)-哌溱-l-基-羰基所取代的苯基；或者带有一个本段中提到的取代基，以及除此之外选自卣素和c,-cv烷氧基的取代基的苯基；R2是氢、d-CV烷基、d-CV烷氧基或卤素； R3是氢、C!-C"烷基或苯基-d-C7-烷基， R5是氢(优选)、CVC7-烷基或苯基-d-0烷基， 并且或者n是3、 4或5且R"选自C广CV烷基、C广C7-烷H^和面素，条 件是d-CV烷基、d-Cr烷^L^和卤素中各自至少存在一个；或者n是2且一个R"是卣素-C广C7-烷基，另 一个R"是C广CV烷氧基；或者n是3、 4或5且R4选自卣素、碘代和d-CV烷氧基，M是面 素、碘代和C,-C7-烷氧基中各自至少存在一个；或者n是3、 4或5且W选自囟素、卣素-d-C7-烷基和d-C7-烷氧基， 条件是卣素、闺素-C,-CV烷基和d-CV烷氧基中各自至少存在一个；或者式IA的化合物，其中W是4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨基，W是 氢，R3是氢，114是2-和6-氯及3-和5-曱氧基，n是4， 115是氢，Y和Z 是N且X是CH;或者式IA的化合物，其中R，是3-(4-曱基-哌溱-l-基曱基)-苯基氨基，R2 是氢，W是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，i!是4， R5是氢，Y和 Z是N且X是CH，或者式IA的化合物，其中W是3-(4-乙基-哌溱-l-基)-苯基絲，W是氢， R3是甲基，R4是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4，议5是氢，Y和Z是N 且X是CH，或者式IA的化合物，其中W是4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨基，ie是 氢，RS是甲基，W是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， 115是氢，Y和Z是N且X是CH， 或者式IA的化合物，其中R'是4-(l-乙基-哌咬-4-基)-苯基氨基，议2是氢， W是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， 115是氢，Y和Z是N 且X是CH，或者式IA的化合物，其中RJ是4-(4-乙基-哌溱-l-基)-苯基^Jo W是氬， R"是乙基，W是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， RS是氢，Y和Z是N 且X是CH，和/或或者式IA的化合物，其中W是4-(4-乙基-哌噪-l-羰基)-苯基絲，W是 氢，R"是甲基，R"是2-和6-氯及3-和5-甲氧基，n是4， Rs是氢，Y和Z 是N且X是CH;或者两个或多个式IA化合物的混合物；或其盐、前药、N-氧化物和/或酯。
3.如权利要求1所述的式IA化合物，其选自以下化合物 l-[6-(4画节氧基-苯基氨基)画嘧啶-4-基l-3-(2，6誦二氯画3，5-二甲氧基-苯 基)_1_甲基_脲，3-(2,6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-[6-(4-羟基-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-1-甲基-脲，1_{6-[4-(4-千基-旅溱-1-基)-苯基氨基-嘧啶-4-基}-3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-l-甲基-脲，3画(2,6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-l-甲基-l-[6-(4-哌嗪-l-基-苯基氨基)-嘧咬-4-基]-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[2-氟-4-(2-吡咯烷-1-基-乙氧基)-苯基氨基]-嘧咬-4-基}-1-甲基-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-2-甲氧基-苯基氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-3-氟-苯基 氨基卜嘧咬-4-基}-1-曱基-脲，3-(5-曱氧基-3-三氟甲基-苯基)-1-{6-[3-氯-4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯基氨 基卜嘧啶-4-基}-1-甲基-脲，1-{6-[2-氯-4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基-嘧啶-4-基}-3-(2，6-二氯-3，5画 二甲氧基-苯基)-l-甲基-脲，和3-(2，6-二氯-3,5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌噪-1-基)-2-氟-苯基 氨基]-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲；或其盐、前药、N-氧化物和/或酯。
4.如权利要求1所述的式IA化合物，其选自以下化合物l-(2-氯-3，5画二甲氧基-6-甲基-苯基)-3-{6-[4-(4-乙基画哌嗪-l-基)-苯基氨 基-嘧咬-4-基}-脲，3-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯基氨 基卜嘧啶-4-基}-1-甲基-脲，3-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-1-{6-[4-(2-二甲基氨基-乙氧基)画苯基氨基卜嘧啶-4-基}-1-甲基-脲，3-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-l-甲基-(6-{4-[2-(4-甲基-哌嗪-l-基)-乙氧基-苯基#^}-嘧咬-4-基)-脲，3-(2-氯-6画碘-3，5-二曱氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基陽哌嗪画l-基)曙苯基氨 基}-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲，3-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-1-{6-[4-(4-异丙基-哌嗪-l-基)-苯基 氨基卜嘧咬-4-基}-1-甲基-脲，3-(2-氯-3,5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-l-[6-(3-二甲基氨基甲基-苯基氨 基)-嘧咬-4-基卜l-甲基-脲，3-(2-氯-3，5-二曱氧基-6-甲基-苯基)-1-{6-[3-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯基氨 基卜嘧咬_4-基}-1-甲基-脲，3-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-1-曱基-1-{6-[4-(2-吡咯烷-1-基-乙 氧基)-苯基氨基-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲，3-(2-氯-3，5-二甲氧基-6-甲基-苯基)-1-甲基-1-{6-[3-氟-4-(2-吡咯烷-1-基 -乙氧基)-苯基^J+嘧咬-4-基卜l-甲基-脲，3-(2，4-二氯-5-曱氧基-3-三氟甲基-苯基)-1-{6-4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯 基氨基-嘧咬-4-基}-1-甲基-脲，和3-(5-甲氧基-3-三氟甲基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯基氨基l-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲；或其盐、前药、N-氧化物和/或酯。
5. 如权利要求1所述的式IA化合物，其选自以下化合物 l-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-3-{6-[4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨基]-嘧咬-4-基}-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二曱氧基-苯基)-l-甲基-1-{6-[3-(4-甲基-哌嗪-l-基曱 基)-苯基氨基-嘧吱-4-基}-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[3-(4-乙基-哌嚷-l-基)-苯基氨基j曙 嘧啶-4-基}-1-曱基-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-l-曱基-1-{6-[4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基氨基P密啶-4-基}-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(1-乙基-哌啶-4-基)-苯基氨基-嘧啶-4-基}-1-曱基-脲，3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-l-乙基-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-l-基)-苯 基氨基1-嘧咬-4-基}-脲；和3陽(2,6-二氯-3，5-二曱氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-l-羰基)-苯基氨 基卜嘧咬-4-基}-1-甲基-脲；或其盐、前药、N-氧化物和/或酯。
6. 如权利要求1所述的式IA化合物，其选自以下化合物 3-(2，6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[6-(4-乙基-哌嗪-l-基)-吡啶-3-基氨基-嘧啶-4-基}-1-甲基-脲；和3-(2,6-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[6-(4-异丙基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基氨基卜嘧咬-4-基}-1-甲基-脲，或其盐、前药、N-氧化物和/或酯。
7. 药物制剂，其包含如权利要求1-6中任一项所述的式IA化合物， 或其可药用盐、前药、N-氧化物或酯，以及至少一种可药用载体。
8. 如权利要求1-6中任一项所述的式IA的化合物，或其可药用盐、 前药、N-氧化物或酯用于动物或人体治疗中的用途，特别是用于对FGFR 抑制有响应的疾病的治疗中的用途。
9. 如权利要求1所述的式IA的化合物，或其可药用盐、前药、N-氧 化物或酯在制备用于治疗蛋白激酶，特别是FGFR依赖性疾病的药物制剂 中的用途。
10. 制备如权利要求l-6中任一项所述的式IA化合物的方法，其包括 在双反应性碳酸衍生物的存在下，将式IIA的苯胺化合物，("A)其中W和n如式IA的化合物所定义，与式IIIA的胺反应， FT 『Y Y (…A) YR2其中R1、 R2、 R3、 X、 Y和Z如式IA化合物所定义； 并且，如果需要，将式IA化合物转化为不同的式IA化合物，将可获 得的式IA化合物的盐转化为游离化合物或不同的盐，将可获得的游离式 IA化合物转化为其盐，和/或将可获得的式IA化合物的异构体混合物分离 成单个异构体。
11. 一种治疗酪氨酸激酶(特别是FGFR)依赖性疾病的方法，其包 含对需要此种治疗的人施用有效量的如权利要求1-6中任一项所述的式IA 的化合物、其N-氧化物、盐、酯或前药。
全文摘要
本发明涉及式(IA)的杂芳基芳基脲类化合物，其中的基团和符号具有本文所给出的含义；涉及此类化合物在治疗蛋白激酶依赖性疾病中的用途；涉及包含所述杂芳基芳基脲类化合物的药物制剂；涉及此类新化合物的制备方法以及包含使用此类杂芳基芳基脲类化合物的治疗方法。
文档编号A61K31/506GK101336237SQ200680051955
公开日2008年12月31日 申请日期2006年12月20日 优先权日2005年12月21日
发明者G·博尔德, P·菲雷, V·瓜格纳诺 申请人:诺瓦提斯公司