专利名称：Tpo基因修饰的人骨髓间质干细胞及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因修饰骨髓间质干细胞领域。
技术背景促血小板生成素(thrombopoietin， TPO)是调节巨核细胞和血小板生成 的细胞因子，TPO具有启动巨核细胞克隆形成、刺激高倍性巨核细胞生成和 成熟巨核细胞的产生以及支持功能性血小板生成的全程性功能。动物实验表明，重组人TPO在恢复血小板水平、促进其他造血因子活力 的功能上比其他造血因子更为有效；临床实验也表明重组人TPO能有效减轻 化疗引发的血小板减少。目前应用于临床研究的TPO主要有两种形式由细 菌表达的经PEG修饰的半长分子TPO (PEG-rHuMGDF)和哺乳动物细胞表 达的全长的、糖基化的TPO (rhTPO)。然而，多剂量PEG-rHuMGDF治疗癌 症患者和用于健康志愿者的实验研究中发现，PEG-rHuMGDF在应用中产生 一种中和抗体，这种PEG-rHuMGDF的Ig G型抗体与内源性的TPO发生交叉 反应，中和了它的生物学效应，继而发生血小板减少症。因其副作用， PEG-rHuMGDF已于1998年9月在美国被撤出临床试验。而目前对于rhTPO 的研究显示，在rfiTPOII、 III期临床中，癌症患者体内几项TPO毒性实验结 果证实rhTPO应用是可行的，但具有心脏、肺、血管或血液病史的患者却仍 是排除在II、 III期临床实验之列的。由于反复使用重组TPO可能产生中和抗体的危险及其高额费用，因此， 用基因治疗的策略代替注射重组TPO来治疗血小板减少症将是另一个重要出 路，有着广阔的发展前景。骨髓间质千细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和分化的基质细胞组 成骨髓微环境，能调节造血干细胞(haemopoietic stem cell, HSC)的存活、 自我更新、迁移以及分化，产生广泛的细胞因子。MSCs能产生许多细胞因子 支持造血，例如SCF、 LIF、 SDF-1、 OSM、 BMP-4、 Flt-3、 TGF-0 、 IL-l、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-ll、 IL-12、 IL-14、 IL隱15。 MSCs中IL-6, IL-ll， LIF， SCF， TPO在转录水平均有表达，但是用ELISA方法能检测到IL-6， IL-ll， LIF， SCF蛋白的表达，却不能检测到TPO蛋白的表达。如果用TPO基因修饰的MSCs 来支持造血细胞的生成， 一方面能使TPO协同MSCs分泌的已知或未知的细 胞因子支持造血生成；另一方面，能避免在支持造血的体系中另外加入细胞 因子。因此，TPO基因修饰的骨髓间质干细胞将成为一种新的促进血小板生 成的支持细胞。 发明内容本发明目的在于用重组腺相关病毒介导TPO基因，将TPO基因转染到人 MSCs，用TPO基因修饰的MSCs来支持造血细胞的生成。本发明的TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞，由重组腺相关病毒将TPO 基因介导转染到人骨髓间质干细胞而获得。本发明的TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞的具体制备方法包含以下步 骤(1)克隆人胎肝TPO基因，构建载体质粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP (pAAV-TPO); (2)制备rAAV-TPO病毒载体；(3)培养人骨髓间质干细胞； (4)将rAAV-TPO转染到人骨髓间质干细胞。 ，其中，步骤(1)中的TPO基因片段通过EcoRI酶切后插入pAAV-GFP; 构建的质粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP在e-globin intron序列中合成一段引物 做为测序引物ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC。为了继续检测TPO基因的全 长序列，分别在TPO基因的480bp位置和858bp位置合成测序引物，分别为: 5'-GCGTTTCCTGATGCTTGTAG-3' ， 5'画CAACCTCCAGCCTGGATATT-3'。步骤(2)采用磷酸钙共沉淀法将pAAV-TPO、 pAAV-RC、 pHelper三种 质粒共转染至HEK293而制备得到rAAV-TPO病毒载体。步骤(4)将rAAV-TPO转染到人骨髓间质干细胞的过程为将人MSCs 用0.25n/。胰蛋白酶/0.02。/。EDTA消化后，用PBS缓冲液洗涤，计数细胞，按l 个MSCs加入105颗粒的rAAV-TPO病毒液混匀培养。步骤(4)中选用的人骨髓间质干细胞最好为生长融合达到80% 90%的 第3代人MSCs。TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞，以及TPO基因修饰的人骨髓间质干 细胞分泌液，可以用来制备成促血小板生成的药物，用来治疗血小板减少症。TPO基因修饰的骨髓间质干细胞将成为一种新的促进血小板生成的支持 细胞。用TPO基因修饰的MSCs制备成促血小板生成的药物，由于它通过细胞分泌产生内源性TPO,用于治疗血小板减少，因此不存在注射人重组TPO 所出现的副作用，它一方面能使TPO协同MSCs分泌的己知或未知的细胞因 子支持造血生成，另一方面，能避免在支持造血的体系中另外加入细胞因子， 其支持造血细胞生成的功能比单纯使用人重组TPO更胜一筹。
图l: pAAV-TPO-IRES-GFP载体质粒表达框示意图；图2:用地高辛标记的GFP基因作探针，检测纯化后rAAV-TPO滴度的点杂交图；图3:不同物理滴度的rAAV-TPO转染HEK293细胞，在100倍倒置荧光 显微镜下的照片；① 102颗粒/细胞 ④105颗粒/细胞② 103颗粒/细胞 106颗粒/细胞 @104颗粒/细胞图4:体外原代培养第14天的人MSCs在200倍倒置显微镜下的照片； 图5: RT-PCR检测MSCs中TPO mRNA表达的电泳图； 图6: Western blot检测MSCs中TPO蛋白表达的电泳图；具体实施方式
以下结合附图详细说明本发明的具体实施(1) 构建pAAV-TPO-IRES-hrGFP:从人胎肝总RNA经RT-PCR的方法 获得全长TPO cDNA，将TPO基因克隆至pAAV-IRES-hrGFP载体的多克隆位 点，从而构建pAAV-TPO-IRES-hrGFP (pAAV-TPO)，其结构如附图1所示。pAAV-IRES-hrGFP质粒中0 -globin intron ( 0 -珠蛋白内含子)序列位于 EcoRI位点的上游，TPO基因片段通过EcoR I酶切后插入pAAV-GFP，故在 e-globin intron序列中合成一段引物做为测序引物。测序引物序列为 ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC。为了继续检测TPO基因的全长序列，分别在 TPO基因的480bp位置和858bp位置合成测序引物，分别为 5'-GCGTTTCCTGATGCTTGTAG-3'， 5'-CAACCTCCAGCCTGGATATT-3'。(2) 制备rAAV-TPO病毒载体将HEK293细胞按3 X 104/皿培养48-60 小时左右达到80%~85%融合，采用磷酸妈共沉淀法将pAAV-TPO、 pAAV-RC、 pHelper三种质粒共转染至HEK293细胞。转染混合液配置过程为:pAAV-TPO、pAAV-RC、 pHelper各10ug/皿，1.5mol/L的CaCl2，加水至20ml，混匀组成 转染混合液；再逐滴滴加2XHEPES20ml，充分混匀，静置5min，待混合液 出现白色云雾状，开始转染。逐滴将混合液均匀地滴在HEK293细胞培养皿 中，2ml服，在100倍的显微镜下看到均匀的细小颗粒。继续培养60 72小时 左右，显微镜下观察到细胞出现明显的病理改变。将细胞从培养皿上刮下， 室温2000rpm离心IO分钟，弃上清，加入PBS缓冲液(pH7.4)重悬，室温 下2000rpm离心IO分钟，弃上清，分离纯化rAAV-TPO。通过地高辛标记的GFP为探针的斑点杂交来测定rAAV-TPO，具体做法 为取2.5iig或者0.25ug的pAAV-GFP质粒溶于100ul无菌双蒸水中，以 20XSSC按1:2对倍稀释作为标准；取纯化后的rAAV-TPO病毒1 u 1或0.1 " 1溶于100ii 1无菌双蒸水中，以20XSSC按1:2对倍稀释后点样于尼龙膜上， 以GFP基因片断作为探针杂交。经过预杂交、杂交、洗膜、显色后结果如图 2所示。经过计算rAAV-TPO的物理滴度为1.2X 1012 particles/ml。分别采用不同的pAAV-TPO物理滴度(l(^颗粒湖胞，103颗粒/细胞，104 颗粒/细胞，105颗粒/细胞，106颗粒/细胞)转染HEK293细胞，结果如图3 所示，10S颗粒/细胞是rAAV-TPO转染细胞时较为合适的浓度。(3) 培养人骨髄间质干细胞取胸外科手术切除的人肋骨用含15%胎牛 血清(FCS)的DMEM冲出骨髓细胞，1 500rpm离心10min ，弃上清及脂肪 层，用DMEM充分混匀，轻轻加到密度为1.077Xl(^g/L的淋巴细胞分离液 上，2 500rpm离心30min,收集单个核细胞层，DMEM洗涤2次。收集细胞， 调整细胞密度，按1 X 106个/咖2密度接种，培养条件为含15%FCS的DMEM 培养液，置37'C、 5%C02、饱和湿度条件下培养(即原代，标记为PO)。 48h 后全量换液以除去未贴壁细胞，以后每3 4天半量换液一次。待细胞长至80% 左右汇合度时，用无钙镁离子的PBS缓冲液洗两次,37t:下用0.25%胰蛋白酶 /0.02%EDTA消化3 5min，用完全培养基终止消化，1200 rpm离心5min， 去上清，以l: 3比例传代，各代依次记为P1,P2，P3…。原代培养的14天左 右接近汇合，此时细胞形态多为长梭形，类似于成纤维样细胞(如图4)。(4) 将rAAV-TPO转染到人骨髓间质干细胞取生长融合达到80%~90% 的第3代(P3)人骨髓MSCs，用0.25^胰蛋白酶/0.02。/c)EDTA消化后，用PBS 缓冲液洗涤1次，计数细胞。以105颗粒的rAAV-TPO/1个MSCs的转染比例转染。用100 ii 1无血清的DMEM重悬MSCs，加入100 u 1的rAAV-TPO病 毒液，混匀后，置于37'C， 5%<:02培养箱中培养2小时，每隔15分钟弹悬 混匀1次。转染后用PBS缓冲液洗涤2次，细胞重新置于100mm皿中培养。 提取未转染或转染后的MSCs的RNA和蛋白，分别用RT-PCR和Western blot的方法检测TPO在mRNA和蛋白水平的表达。用RT-PCR法检测未转染 的MSCs和rAAV介导TPO基因转染的MSCs中人TPO mRNA的表达。结果 (如图5所示)表明，病毒介导TPO基因转染的MSCs中人TPO mRNA的 表达量明显高于未转染的MSCs中人TPO mRNA的表达量。P -actin的表达 无明显差异。Western blot结果(如图6所示)表明rAAV介导TPO基因转染 的MSCs和胎肝阳性对照组中TPO蛋白质表达水平明显增加。然而，未转染 的MSCs中未检测到TPO蛋白质表达，这可能与MSCs中TPO蛋白表达极低 有关0
权利要求
1. TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞，其特征在于所述人骨髓间质干细胞由重组腺相关病毒介导的TPO基因所修饰。
2. TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞的制备方法，其特征在于依次包含以下 步骤(l)克隆人胎肝TPO基因，构建载体质粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP; (2) 制备rAAV-TPO病毒载体；(3)培养人骨髓间质干细胞；(4)将rAAV-TPO 转染到人骨髓间质干细胞。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中的TPO基因片 段通过EcoR I酶切后插入pAAV-GFP;构建的质粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP 在P -giobin intron序列中合成 一 段引物作为测序引物 ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC;另外，在TPO基因的480bp位置和858bp 位置合成测序引物，分别为5'-GCGTTTCCTGATGCTTGTAG-3'， 5'-CAACCTCCAGCCTGGATATT-3'。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(2)采用磷酸钙共沉淀 法将pAAV-TPO、 pAAV-RC、 pHelper三种质粒共转染至HEK293而制备得到 rAAV-TPO病毒载体。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(4) rAAV-TPO转染到人 骨髓间质千细胞的过程为将人MSCs用0.25n/。胰蛋白酶/0.02Q/。EDTA消化后， 用PBS缓冲液洗涤，按1个MSCs加入105颗粒的rAAV-TPO病毒液混匀， 培养。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述人骨髓间质干细胞为生长融 合达到80%~90%的第3代人MSCs。
7. TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞在制备促血小板生成药物中的用途，其 特征在于用TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞或TPO基因修饰的人骨髓间 质干细胞分泌液制备成促血小板生成的药物。
全文摘要
本发明公开了TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞及其制备方法和用途。该人骨髓间质干细胞被由重组腺相关病毒介导的TPO基因所修饰而得到，具体的制备方法依次包括下述步骤克隆人胎肝TPO基因，构建载体质粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP；制备rAAV-TPO病毒载体；培养人骨髓间质干细胞；将rAAV-TPO转染到人骨髓间质干细胞。本发明的TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞或TPO基因修饰的人骨髓间质干细胞分泌液可以用于制备促血小板生成药物。由于TPO基因修饰的MSCs通过细胞分泌产生内源性TPO，用于治疗血小板减少，因此不存在注射人重组TPO所出现的副作用。
文档编号A61P7/00GK101240263SQ20071003439
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月7日 优先权日2007年2月7日
发明者周小莹, 谭孟群 申请人:中南大学