专利名称：：一种具有抗肺癌作用的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药
技术领域：
，特别是涉及一种具有抗肺癌作用且由重楼皂苷提取物和黄芪多糖组成的药物组合物。
背景技术：
：中药重楼为百合科重楼属CPan》)植物滇重楼CPaW^jrofy//^〃aSmithvar.ya朋a"era&)及七口十一枝花(_Pan\yjw/j^/y^/aSmithvar.c/n'"e"w^(Franch.)Hara)的根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于治疗臃肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症。现代药理研究表明，该药具有止血、祛痰和抑菌、镇痛镇静、抗早孕杀灭精子及抗细胞毒等作用，临床上应用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎和外科炎症以及肿瘤等病症，并且都有显著的疗效。民间早已使用中药重楼用于治疗癌症，如益肺抗瘤饮(重楼、黄芪、北沙参、天冬、女贞子、石上柏等的水煎剂，主治肺癌)、重楼汤(重楼、白花蛇舌草、蒲公英、败酱草、半枝莲等的水煎剂，主治肺癌)、止痛抗癌丸(重楼、三七、玄参、芦根、黄药子、川乌、冰片等研细末，过筛，用大蒜汁将之调成糊状，搓丸制成，治疗各种癌痛)、莲花片(重楼、半枝莲、三七、莪术、人工牛黄、山慈菇等研细末，制片剂，治疗原发性肝癌)等药物都是以重楼作为主要成分而制成。研究表明重楼皂苷是其主要活性成分。但上述这些药物都是由重楼原料直接制备而成，而不是采用从重楼提取出的重楼皂苷作为有效成分，因而活性低，治疗效果不明显且针对性不强。黄芪^Astragfl/mw6ra朋ce船(Fisch.)Bge.var(Bge.)Hsiao是祖国医学中最常用的补益药之一，有"扶正固本，补中益气"之功效，常用作肿瘤治疗的辅助用药。黄芪多糖(astragaluspolyaaccharidcs,APS)为其主要有效成分，研究表明黄芪多糖对机体的免疫功能具有广泛的影响，能够通过增强宿主免疫反应发挥抗肿瘤作用。但到目前为止重楼和黄芪都是单独使用，因此尚未发现具有抗肺癌作用且由重楼皂苷提取物和黄芪多糖组成的药物组合物见诸报导。
发明内容为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种活性高且作用明确的具有抗肺癌作用的药物组合物。为了达到上述目的，本发明提供的具有抗肺癌作用的药物组合物由重楼皂苷提取物和黄芪多糖以3:1的重量比混合而成，其中重楼皂苷提取物的提取方法包括按顺序进行的下列步骤1)将云南产滇重楼的粗粉过5目筛后分别用4倍体积比的70%85%乙醇浸泡1小时，然后在85"C的温度下加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液并浓縮而得到浸膏；2)将上述浸膏加入到50100倍体积比的0%20%乙醇中并分散均匀，离心，沉淀后再溶解，再离心，重复2次，合并上清液；3)将上述上清液经大孔吸附树脂层析柱，所用干树脂量按照与浸膏重量比例为4:110:1计算，上柱流速为13BV/h，洗脱液弃去；用60%80%乙醇洗脱，流速为25BV/h，收集乙醇洗脱液，减压浓縮真空干燥后即可得到重楼皂苷提取物；所述的黄芪多糖的提取方法包括按顺序进行的下列步骤1)将黄芪干燥粉碎后加入IO倍水，于8(TC的温度下提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液并浓縮至原体积的1/51/6;2)在上述所得浓縮滤液中加入95%的乙醇至醇度达80%，放置过夜，将沉淀加水溶解，过滤，滤液经Sevag法除蛋白7次，然后用氨水调节pH至8，加入占总液体量3%的30%过氧化氢后在37'C的水浴中放置12h，过滤，将滤液置于透析袋中流水透析12h，液体浓縮后再醇沉，放置过夜，将沉淀用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥后即可得到黄芪多糖。所述的重楼皂苷提取物的收率为9%10%，总皂苷含量为60.6%63.2%，其中重楼皂苷I和重楼皂苷II的量合计为2%2.5%。所述的黄芪多糖的收率为8%11.3%，多糖含量为81.3%83.7%。本发明提供的具有抗肺癌作用的药物组合物是将云南产滇重楼经乙醇提取，然后经大孔吸附树脂乙醇梯度洗脱而得到重楼皂苷提取物，将黄芪经水提醇沉除蛋白后得到黄芪多糖，最后将两种提取物以3:l的重量比混合而制成。经体外MTT法活性试验证明，此药物混合物可显著抑制LA795肺腺癌细胞等多种肺癌细胞株的生长，ICso可达26.73^ig/ml;对荷瘤小鼠试验显示，抑瘤率可达55.63%，可明显抑制荷瘤小鼠皮下移植肿瘤的肺转移和引起肿瘤细胞的凋亡，并可提高荷瘤小鼠脾指数与胸腺指数，且无明显毒副作用。另外，与原药材相比，该药物组合物活性高且作用明确，并可制备成各种不同的剂型。具体实施方式1、将云南产滇重楼500g粗粉过5目筛后分别用4倍体积比的70%和85%乙醇浸泡1小时，然后在85'C的温度下加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液并浓縮而得到浸膏;将上述浸膏加入到100倍体积比的20%乙醇中并分散均匀，离心，沉淀后再溶解，再离心，重复2次，合并上清液;将上述上清液经大孔吸附树脂层析柱，所用干树脂量按照与浸膏重量比例为5:1计算，上柱流速为l3BV/h，洗脱液弃去；用60%80%乙醇洗脱，流速为25BV/h，收集乙醇洗脱液，减压浓縮真空干燥后即可得到重楼皂苷提取物47.1g。2、将黄芪300g干燥粉碎后加入10倍水，于8(TC的温度下提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液并浓縮至约500ml;在上述滤液中加入95%的乙醇至醇度达80%，放置过夜，将沉淀加水溶解，过滤，滤液经Sevag法除蛋白7次，然后用氨水调节pH至8，加入占总液体量3%的30%过氧化氢后在37。C的水浴中放置12h，过滤，将滤液置于透析袋中流水透析12h，液体浓縮后再醇沉，放置过夜，将沉淀用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥后即可得到黄芪多糖25.6g。3、将上述重楼皂苷提取物和黄芪多糖以3:1的重量比混合即可制成本发明提供的药物组合物。将上述药物组合物进行抗肿瘤活性试验，其方法和结果如下一、抗肿瘤活性试验方法1体外抗肿瘤活性试验1.l细胞株及培养小鼠肺腺癌LA795细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素的RPMI1640培养基中，于37"C，5%<:02培养箱及饱和湿度条件下培养，3—4天传代一次。人肺腺癌A549细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素的DMEM培养基中，于37。C，5%C02培养箱及饱和湿度条件下培养，3—4天传代一次。1.2药物抗肿瘤活性测定MTT法将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为3xlO"个/mL的细胞悬液，接种于96孔酶标板，每孔加200faL。24h后换不含血清培养液使细胞同步化生长，每孔200pL。第三天加含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养液，每孔加200pL，受试药设8个剂量组，每组设8个平行孔，于37^C培养24h后，每孔加无血清无酚红培养液新鲜配制的0.5mg/mLMTT100pL，继续培养4h，然后，每孔加100pLDMSO溶解MTT甲簪颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值(OD)，实验重复三次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由OD值计算抑制率，公式为细胞生长抑制率=(对照组OD值一实验组OD值)/对照组ODX100%，并由此求得ICso(半数抑制率)，ICscr细胞生长抑制率为50%的药物浓度。2体内抗肿瘤活性试验2.1动物造模取接种LA795肺腺癌细胞后第6—8天肿瘤生长良好的T739荷瘤鼠，拉断颈椎处死小鼠，在无菌条件下剥离肿瘤，选择新鲜无坏死的瘤组织剪碎置玻璃研磨器中，加适量生理盐水轻轻研磨制备成瘤细胞悬液，细胞筛过滤后加生理盐水稀释、计数，调配成细胞浓度为1000万/毫升的细胞悬液，0.2ml/每只，2"06在冰浴条件下接种于健康小鼠右前肢腋窝皮下。2.2动物分组及给药接种当天将造模T739小鼠随机分为8组，开始给药，每日l次(1)模型组，灌服生理盐水，每只0.2ml;(2)化疗组，按20mg/kg'bw腹腔注射环磷酰胺；(3)重楼皂苷高剂量组按400mg/kg*bw灌服；(4)重楼皂苷低剂量组按200mg/kg'bw灌服；(5)黄芪多糖高剂量组按200mg/kg*bw灌服；(6)黄芪多糖低剂量组按100mg/kg*bw灌服；(7)药物组合物高剂量组按400mg/kg'bw灌服;(8)药物组合物低剂量组按200mg/kg'bw灌服。给药两周，于给药后第15天将小鼠处死，解剖取其瘤组织、肝、脾、肾、心、脑、肺、胸腺、胃、回肠、结肠。剥取瘤组织，称质量，测定抑瘤率抑瘤率(％)=(1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)X100%。将摘取的胸腺和脾脏称质量，以胸腺和脾脏质量(mg)与体质量(g)之比作为胸腺和脾指数。将取下的组织保存于10%中性福尔马林中，并做石蜡切片，进行常规HE染色，其中瘤组织亦做TUNEL染色，观察细胞凋亡。二、抗肿瘤活性试验结果表1重楼皂苷提取物和黄芪多糖药物组合物体外抗肿瘤活性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2重楼皂苷提取物和黄芪多糖药物组合物对荷瘤小鼠抑瘤率试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3重楼皂苷提取物和黄芪多糖药物组合物对荷瘤小鼠免疫器官重量指数比较组别剂量(mg/kg'bw)脾脏指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4各组织HE染色及瘤组织TUNEL染色结果组别主耍组织HE染色结果瘤组织HE染色及TUNEL结果丰莫型纟且肝组织、肺组织内多散在瘤栓与转移灶。瘤组织内中央有大片坏死，坏死周心、脑、肝、肾、胃、回肠、结肠结构正常。围有少量细胞凋亡。4t疗会且肺组织内有较多瘤栓与转移灶。肝组织极少瘤组织中有分布均匀的广泛小灶性瘤栓与转移灶。心、脑、肝、肾、胃、回肠、坏死，坏死灶周围细胞凋亡明显，结肠结构正常。凋亡细胞数量多。重楼皂苷高剂量组肝组织、肺组织内瘤栓和转移灶皆很少，瘤组织内有小灶性坏死，坏死小灶瘤栓中瘤细胞多有变性并伴有坏死。心、周围多细胞变性。整个瘤组织细胞脑、肝、肾、胃、冋肠、结肠结构正常。凋亡数量多。重楼皂苷低剂量组基本同重楼皂苷高剂量组。黄芪多糖髙剂量组肺组织、肝组织内有较多瘤栓与转移灶。瘤组织中凋亡细胞数量少。心、脑、肝、肾、胃、回肠、结肠结构正常。黄芪多糖低剂量组基本同黄芪多糖高剂量组。药物组合物高剂量组肝组织、肺组织内很难发现瘤栓和转移灶，瘤组织内有小灶性坏死，坏死小灶心、脑、肝、肾、胃、回肠、结肠结构正常。整个瘤组织细胞凋亡数量多。药物组合物低剂量组基本问药物组合物a剂量组。三、结论经实验证明，本发明提供具有抗肺癌作用的药物组合物具有较高的抗肿瘤活性，对LA795肺腺癌细胞的ICso为26.73吗/mL，对人肺腺癌A549细胞的IC50为28.99pg/mL，对T739荷瘤小鼠的抑瘤率可达到55.63%，可明显抑制荷瘤小鼠皮下移植肿瘤的肺转移和引起肿瘤细胞的凋亡，并可提高荷瘤小鼠脾指数与胸腺指数。组织病理学鉴定表明，对心、脑、肺、肝、肾、胃、回肠、结肠无明显毒性。权利要求1、一种具有抗肺癌作用的药物组合物，其特征在于所述的具有抗肺癌作用的药物组合物由重楼皂苷提取物和黄芪多糖以3∶1的重量比混合而成，其中重楼皂苷提取物的提取方法包括按顺序进行的下列步骤1)将云南产滇重楼的粗粉过5目筛后分别用4倍体积比的70％～85％乙醇浸泡1小时，然后在85℃的温度下加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液并浓缩而得到浸膏；2)将上述浸膏加入到50～100倍体积比的0％～20％乙醇中并分散均匀，离心，沉淀后再溶解，再离心，重复2次，合并上清液；3)将上述上清液经大孔吸附树脂层析柱，所用干树脂量按照与浸膏重量比例为4∶1～10∶1计算，上柱流速为1～3BV/h，洗脱液弃去；用60％～80％乙醇洗脱，流速为2～5BV/h，收集乙醇洗脱液，减压浓缩真空干燥后即可得到重楼皂苷提取物；所述的黄芪多糖的提取方法包括按顺序进行的下列步骤1)将黄芪干燥粉碎后加入10倍水，于80℃的温度下提取3次，每次2小时，提取液过滤，合并滤液并浓缩至原体积的1/5～1/6；2)在上述所得浓缩滤液中加入95％的乙醇至醇度达80％，放置过夜，将沉淀加水溶解，过滤，滤液经Sevag法除蛋白7次，然后用氨水调节pH至8，加入占总液体量3％的30％过氧化氢后在37℃的水浴中放置12h，过滤，将滤液置于透析袋中流水透析12h，液体浓缩后再醇沉，放置过夜，将沉淀用无水乙醇和丙酮洗涤，干燥后即可得到黄芪多糖。2、根据权利要求1所述的具有抗肺癌作用的药物组合物，其特征在于所述的重楼皂苷提取物的收率为9%10%，总皂苷含量为60.6%63.2%，其中重楼皂苷I和重楼皂苷II的量合计为2%2.5%。3、根据权利要求1所述的具有抗肺癌作用的药物组合物，其特征在于所述的黄芪多糖的收率为8%11.3%，多糖含量为81.3%83.7%。全文摘要一种具有抗肺癌作用的药物组合物。其由重楼皂苷提取物和黄芪多糖以3∶1的重量比混合而成。本发明的药物组合物是将重楼经乙醇提取，然后经大孔吸附树脂乙醇梯度洗脱而得到重楼皂苷提取物，将黄芪经水提醇沉除蛋白后得到黄芪多糖，最后将两种提取物混合而制成。经体外MTT法活性试验证明，此药物混合物可显著抑制LA795肺腺癌细胞等多种肺癌细胞株的生长，IC<sub>50</sub>可达26.73μg/ml；对荷瘤小鼠试验显示，抑瘤率可达55.63％，可明显抑制荷瘤小鼠皮下移植肿瘤的肺转移和引起肿瘤细胞的凋亡，并可提高荷瘤小鼠脾指数与胸腺指数，且无明显毒副作用。另外，与原药材相比，该药物组合物活性高且作用明确，并可制备成各种不同剂型。文档编号A61K36/88GK101152408SQ200710059758公开日2008年4月2日申请日期2007年9月24日优先权日2007年9月24日发明者满淑丽,颜璐璐,高文远申请人:天津大学