颗粒-基质的制作方法

专利名称：：颗粒-基质的制作方法颗粒-基质狱领域本发明涉及一种组合物，其包含颗粒和可由至少两种前体自选择性反应形成三维网络而获得的基质。还銜共制备所m，的试剂盒和方法。医疗器械诸如一脱意义的植入物和牙科专用植入物如今，,泛应用。例如在骨折或者牙齿脱落情况下，在坚硬的组织结构需要被修复^被替换时，它们已经变^艮受重视的可能性。然而，这些植入物的成功强烈^a于HA位点的充分支撑。如果在所述位点的骨质量(bonemass)不完善或者质地有缺陷，则需要骨修复和/或骨增强。，各种各样的治疗用于重新获得完善的骨质量，包括4OT不同来源、皿和尺寸的骨移植材料。尽管存在骨质量和/或强度的系统治疗方法，但是在例如骨质疏松症中，仍难以按可靠并且可控制的方式实现骨生^boneformation).然而，局部骨生成对于只需在局部增加骨体积的情形，例如当放置牙科植入物时的充分治疗非常有益。目前用于修复骨缺陷的方i^括不同来源的移植材料。该材料要么是合成的，要么源自天然。所j顿的一类天然移植材料是自体骨。与源自天然(人、动物、植物、藻类等)的骨/类骨材料相反，自体骨材料不会引发强烈的免疫反应从而不被移植宿主排斥。然而，自体骨材料需要二次手术以获得骨，增大了在该位点不期望的感染和/或炎症的危险并且使治疗费用显著增加。而且，骨材料的去除至少暂时导致在该位点结构弱化并引起痛苦的治愈过程。过去的几年间，变得M^f楚的是各种生物活性因子的舰改善了骨修复和/或骨生长。也已经显示出应用这类因子的方法极大的影响它们的再生效果。尽管不断努力在研发用于所述因子的可控制地提供和释放的方法，但是这仍然是该领域中的普遍问jfe—。本领域中已经描述了用于组织自生长或者生物活性因子的释放的不同生物材料。WO00/44808公开了il31与共轭不饱和基团亲核加成反应而形成的聚合物生物材料，所获得的该生物材料呈7K,状态，可以用于诸如胶水或者密封剂以及作为组织工程和伤口愈合应用的支架。而且所^7K凝,生理^^牛下快'US5,626,861公开了可以用作移植材料的微孔基质的制造方法。该复合材料由溶解于有机翻咖二氯甲，者氯仿的可生物降解和生物相容的聚合物然后与羟基磷灰石混合而成的混，来形成。后者，粒状磷酸钙陶瓷。该材料具有尺寸范围在100-250i(^t间的不规则的小孔。生物活性因子可以非共价结^f该复合材料中。US5，204,382描述了可注射的移植组合物，其包含与有*，^1或#^浮于液体载体的胶原蛋白混合的可生物相容的陶瓷基质。该陶粒的尺寸范围在50Mt-250m^tt间。US6,417,247公开了聚合物禾嗨瓷基质。该组糊通常瞎况下为液体并且跟煤些刺激、例如驗升高时固化。WO2004/103421描述了具有固定^的羟基磷灰石/二氧化硅材料。还描述了基于，基磷灰石/二氧化硅材料的非常多孔的骨割"^才料。WO03/040235公开了用于控制细胞向内生长和组织再生的合成基质。该基质包含舰多官能前体形成的三维聚合网络。WO2004/054633描述了大L合成陶瓷，其可以用于制备颗粒化的骨替代材料。EP0324425公开了用a-繊三钙和磷酸四钙中的至少一种制备医用骨假体的方法。US2004/0019132描述了用于制造TO植替代品的方法和组，。糊粉末压缩方法产生包含颗粒化骨材料如脱矿骨基质的成形产品。WO03/092760公开了作为用于组织工程学和骨移植材料载体的结构化复合吻，其由大量的多孔性磷,颗粒组成。WO2006/072622描述了补充基质(supplementedmatrices),其中包含可释放地加入的PTH，鄉含有颗粒材料。
发明内容如在这里所使用的，单词"聚合"和"交联"用于表示不同前体的相互连接以导致分子量的显著增大。"交联"还进一步^支链，一般会生成三维聚，网络。"自选择"含义是该反应的第一前体A与第二前体B的反应比在该反应位点与混，中雜的其它化糊的腿快很多，并且第二前体B与第一前体A的反应比在该反应位点与混合物中存在的其它化合物的反应快很多。该混合物可以包含其它生物材料，例如，药物、肽、蛋白质、DNA、RNA、细胞、细胞团聚体和组织。"共轭不饱和键"是指碳-碳、碳-杂原子棘杂原子-杂原子的多重键与单键交替。这样的键育腿行加成反应。"共轭不饱和基团"是指含有碳-碳、碳-杂原子或者杂原子-杂原子的多重键与单键交替的W或者分子的区域，其具有能进行加成反应的多重键。共轭不饱和基团的实例包括但不限于丙烯酸酯、丙烯酰胺、奎宁和乙烯掛比啶铩，如2-或者4-乙烯掛比徒錄。本发明的问题是提供骨修复和减骨增长材料，其具有优异生物相容性和机櫬急定性，可以在原位修复骨缺陷和/或骨增长，同时将不希望的炎症的危险陶氐至最小，消除了为获得自体骨材料而需要二次手术的需要，且不再有感染的危险。另外，治疗费用也显著下降。该问^M如权利要求1的组^/得以解决。其它，的实案是权利要求2-28的主题。根据本发明的组^包含颗粒和可,聚，基质。/Lf中交自质^领域已知的，其能提供适用于组织再生的多孔的三维可生物,基质，其可iiil自选择反应获得。聚合物材料的实例是PEG。在i^的实施方案中，这样的聚^t)基质,两种或者更多种如下定义的前#^7乂存在下的自选择反应获得。所，粒和所述基质的组合产生了一种具有优异骨修复和/或骨生长性质的组合物。所，粒和所述基质的组合协同增效骨修复和/或骨增长。在基{共三维支架的同时，颗粒确保好的机械稳定性。由于形成基质和颗粒的前体恰好在^ffl之t!T混合，实现了颗粒在全部组合物中的最佳分布。作为形成该基质的单体的所述前,于7K。明确是前体而非聚合物与颗粒混合使该基质育辦原位生成是錢的。因此，包含前体和颗粒的水溶液是非粘性的且能毫无困7她鹏混合。该基质的快速賊保留了颗粒的最优化分布并避免了由于颗粒可能的沉淀导致的不均匀。而且，7jC繊基质和颗粒的组合j顿粒软膏t辦鄉为所需微，稳定该靴并且防娜姐移。例如当相对大量的液体要加入该颗粒时，如果合适的话，可以加入诸如CMC(羧甲基纤维素)、PGA(丙二,藻酸酯)棘黄原胶之类的粘度改性剂以确保原位引入(administration)有关的物理性能最佳。因此，保证了贯穿由该组合物形成的,三维结构的骨修复和/或骨增长性能是均匀和最佳的。在先前已知的治疗中，当与非聚合液体，例如氯化钠溶滅者血液混合时应用骨填充材料。结果，所引入的骨移植混合物不能提供新的硬质组织的顺利生成所需要的精确稳定性。由于软组织的覆盖层或者其它冲击作用，该骨移植材料通常经受机m力，这会导致，、位移或甚至是增长物的塌陷。本发明的组^#1##:将适当的填充材料如磷,颗粒，与聚合物基质如PEG结合，从而麟受控制的并且安全的骨修复和/或骨增长来剜艮该问题。除简单^卜，组合物的单一组分、形成该基质的前体以，粒具有优异的稳定性，因而保存期限长。有利的是，该组分以干燥形存，如粉末，并且前体ffi用之前立即溶解。作为选择，该组分可以5t存于保护其功能性的翻中。而且，该组合吻是生物可降解的，由此留出用于天然骨向内生长的空间。而且，CT免在骨缺陷完全治愈后用手术来去除骨修复和/或骨生长材半被留部分。其,产物容易排泄并且无毒。所鄉粒一方面用作填充剂扩充组合物術只，另一方面其为该组合^/il供必要的机械3贼。而且，它为骨沉积提供支架表面。存在各种各样的肖睏于颗粒的材料，例如骨材料或者合淑才料。颗粒材料的实例是自,植骨、羟基磷灰石、磷mn钙及它们的混^。用于自体骨材料的颗粒材料的进一步实例是颏、磨牙后的和鼻棘(nasalspine)(全部由口腔内取得)、嵴、髂骨(iliaca)和颅顶(全部由口腔外取得)、源自天然的骨/骨类似材料是冷冻干燥骨同种异,植物(FDBA)、去除矿物质冷冻干燥骨同种异体移植物(DFDBA;Grafton)、牛的材料(BioOss、Osteogr^)h、NavigraftD、OsteograMO、珊瑚材料(ProOsteon、Interpore500)、藻對才料(FriosAlgipore)、胶原。合淑才料是羟翻灰石(Ostim)、磷酸三钙(Cerasoib、BioResorb、Cerosd)等〉、羟基磷灰石和磷酸三钙的混合物(StraumannBoneCeramic)、生物活性玻璃(PerioGlas、Biogran)、硫,和碳酸化磷灰石。该合微才料具有的优势在于它们稀自动抓由此消除了被A^t动物病原染的风险，取决于该天然材料的来源，如果使用的是骨/类似骨材料而不是自体骨材料时，所述感染的风险总是雜的。另外，与j顿自体骨材料的情况相比，合成的颗粒消除了对于二次手术的需求。所述二次手术是复杂化和额夕卜花费的主要来源。除健康的骨结构至少暂时被弱化的事实之外，感染或者炎症也会发生，使其本身已经疼痛的手术位点的痊愈敏呈更加^化。合淑才料的另—馆势在于该合鹏斗的制造允i働储如化学组成、结晶度、孔隙率之类的参数。以下详细描述形,质的前体A和B。第一前体A包含具有n佛的核，其具有共轭不饱和基团或#^接至链的末端20个原子任意一个的共轭不饱和键。在一^M的实施方案中，所述共轭不饱和基团^共轭不饱和键位于末端。第一前体A的核可以是单一的原子如碳原子、氮原子或者小分子如环氧乙烷单元、氨基酸或肽、糖、多官能醇如季戊四醇、D-山梨糖醇、甘油赫是诸如六聚甘油之类的低聚甘油。该链是直链聚合物或者直舰者支链^S^，任选包含杂原子、m^基或者酉諶。除所述粒外，前体A还可以另外^t链棘支^Sa^或不具有共轭不饱和基团或者键的聚合物取代。在一^[M的实施方案中，第一前体A具有2-10个、雌2-8个，更雌3-8个、最雌4-8顿。所述共轭不饱和键雌是丙烯酸酯、丙烯,、奎宁、2-棘4-乙烯基吡啶铺、乙烯基砜、马来胺或者式(Ia)或者(Ib)的衣繊酯。ii0"0其中&和lM^k是氣、甲基乙基丙基棘丁基，并且R3JilM^t支链c,-q。赚，雌是甲基、乙基丙基赫丁基。第二前体B包含具有m顿的核，M^有驗至该链的棘20个原子中任意一个的硫醇或^M基。例如半胱氨,基可以结合到该链中。优选该硫醇基团在端部。第二前体B的核可以是单个原子如碳原子或，原子或者小肝如环氧乙烷单元、氨基酸郷、糖、多官能醇如季戊四醇、1>山梨糖醇、甘油棘低聚甘油如六聚甘油。所述链jii:链聚合物或者直^^m^^，任选包含杂原子、酯基^m^基。在，的实Ste案中，第二前体8具有2-10个、雌2-8个，更雌2A个、最雌24僧。在雌的实案中，前体B的核包含肽，该肽包含一个或者多个酶降解点。酶降解点的实例是纤维蛋白溶酶底物序列、基质金属蛋白酶等。在鶴的实案中，前体A和/或B包含肽，该肽包含一个或者多顿,点。前体A和/或B也可以魏含2个半胱氨^S以及一个或者多个酶卿早点的肽。这样的前体于WO03/040235中有描述，该文献引A^文作为参考。酶,点的实例是纤维蛋白溶酶底物序列、基质金属蛋白酶等。在雌的实案中，包含肽或者如前体B所述为包含2个半胱氨膨戋凝B—个g^多个酶,点的肽的前体，可以用作第三前体。第一前体A化合物具有n，，其中n大于^^于2，并S^f述第二前体B化合物具有m条链，其中m大于I^"等于2。第一前体A禾tV或第二前体B还可以进一步包含非官能化的链。第一和第二前体的官能化链的总数，即m+n总数大于或等于5。优选，m+n等于^"大于6以获得成型良好的三维网络。形^S质的前体溶解或者悬浮于7k溶液中。该前^T、必是完全7K溶性的。可以用前,液将，粒润湿，，将颗^L悬浮于大量的前体溶液中。由于不需要有机歸l」，仅仅存在水溶液和/或悬浮液。这些容易处理并且与存在有机溶剂时不同，不需要任何费力的防范。而且，有机溶剂增加了暴露在这些總i冲的医护人员和患者的健康风险。本发明消除了所述风险。通过自选择反应形成三维网络的至少两种前体的使用可以有利地原位应用。这意味将该组^tl以液体棘糊状引入骨缺陷位点，以精确控制组合物用量。该液体组合物，佳地适应该骨缺陷的形状，确保最佳的定位和支撑。而且，它能使该组合物定型为所需要的皿。无需进一步的固定。该组^tl的固化在几分钟内完成，从混合的时候就开始。不需要任何g^的引发刺激并且该自选择反应不损害周围组织。在，的实案中，戶;f^粒包含自鈣，其由于惰性而生物相容性高，即不弓胞炎i4iif呈赫其它不希望的生物反应。在另一优选的实施方案中，所，粒包含羟基磷灰石(ha)和/或三磷酸弼(tcp)。在雌的实施方案中，所述组合物包含颗粒，其中该颗粒中羟基磷灰石/三磷,的M比为0.1-5.0、雌1.04.0、最雌1.0-2.0。在另一优选的实施方案中，所述颗粒中羟灰石(ha)的含量至少是1M%，,等于^t大于15最iti^等于^大于50重5%。该组合物中颗粒的含量显著地影响该组合物的机械强度。该组，包含10龍-80重1%的颗粒能超1脚的结果。雌该范围是20重量-70重1%以及最皿该范围是30M*60S*%。在另一优选的实施方案中，第一前体a的共轭不饱和基团或者共轭不饱和键是丙烯酸酯、奎宁、2-棘4-乙烯掛比啶铺、乙烯Wl、马娜则安或者式(Ia)或者(Ib)的衣自酯。最皿丙烯酸酯。在特别优选的实案中，前体a选自式Al<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>a=5-200，雌7-150，最雌20-80，式A7。在另一个皿的实施方案中，前体B包括硫醇部分或选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式Bl<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式B2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式B3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式B4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式B5b=5-200;雌7-150，最雌20-80;式B6。最，前体A是具有4根链以及大约15,000Da的M量的PEG-丙烯酸酯。最雌的前体B选自肝量大约为3500Da的直链PEG-二硫醇和舒量约为2400Da的具有4根链的PEG魂醇。前体A禾n/或前体B肝量可变4tM著，雌500Da曙100,000Da,更雌腦-50，000Da，最雌2000-30,000Da。在雌的实案中，前体A禾口/或B的链是聚合物，其选自聚(乙烯醇)、聚(烯化氧)、聚(乙二醇)、聚(氧乙烯化多元醇)、聚(氧乙烯化山梨糖醇)、聚(氧乙烯化葡萄糖)、聚(喝唑啉)、聚(丙烯酰-基吗啉)、聚(乙烯基吡咯烷酮)及它们的混合物。在特别优选的实施方案中，前体A种或B的链是聚(乙二醇)。该聚(乙二醇)可以是直链的^#是支链的。在另一个,的实案中，前体A与前体B—起使用，iM体B是包含2个半胱氨M^卩一个或者多个酶降解位点的肽。该半胱氨m^^位于该肽的端部。在优选的实施方案中，所述组合物包含至少一种生物活性因子。该生物活性因子可以在混合该组合物的其它组分时加入。如果该生物活性因子不包含反应性基团，如硫醇^#胺基贝ij所述生物活性因子不共价键接于基质，而是简单地包埋于该组合物中。随后该生物活性因子M:扩散而释放。然而，该生物活性因子也可以共條接于所述基质，例如，这可以M31在混合时存在于该生物活性因子中的硫醇结构部分与存在于前体A中的共轭不饱和基团或，反应来实现。硫醇部分雜于诸如ms酸半胱氨酸中。此氨基酸能容易地引入肽、寡肽或者蛋白质中。在将颗粒与包含第一前体A和第二前体B的溶液混合之前，将该生物活性因子吸附于所32^^fe上也是可能的。在一个优选的实案中，所述生物活性因子选自甲状旁腺素(PTH)、基于PTH的肽、PTH的肽片断、包含RGD三肽的肽、转化生长因子P族(TGF3)、骨皿形成蛋白族(BMP)、血小板衍生的生长因子族(PDGF)、血管内皮细胞生长因子^(VEGF)、胰岛素样生长因子族(IGF)、成纤维细胞生长因子方好GF)、EP01165102Bl中描述的釉质基Mt亍生蛋白和肽(EMD)、前列腺素&(PGE2)和EP2^t剂，以及dentonin。Dentonin是在骨和牙组织中发现的基质细胞夕卜(matrixextracellular)磷糖蛋白的肽片断(MEPE)。其在WO02/14360中有进一步描述。另外，细鹏卜基质蛋白，如纤维结合蛋白、胶原、层粘连蛋白也可以用作生物活性因子。这些肽和蛋白质可以包含或者不包含緲卜的半胱氨酸。这样的半胱氨酸鹏繊和蛋白质与基质的共4條接。在另一^tt选的实施方案中，生物活性因子选自甲状旁腺素(PTH)、基于PTH的肽、PTH的肽片断。已经证明甲状旁腺素(PTH)对于骨组织施加多样性合成代谢作用。尤其优选的是包含PTH的前34个氮基酸的B太。该肽可以包含或者不包含额外的半胱氨酸，该半胱氨酸,所述肽与基质的共价连接。这样的肽可以i131PTH的酶促裂解^#肽合成来制备。在进"^优选的实施方案中，所述生物活性因子选自釉基质、釉原蛋白(amelin)、釉丛蛋白(tuftelin)、成釉蛋白(ameloblastin)、釉蛋白(enamelin)和牙质、涎蛋白(dentinSialoprotein)。舰引扁胞连敏点提高基质的效能。例如，RGD序列图形(motif)在特定的细胞连接中起重要作用。可行的细胞连接肽是H-Gly-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro<}ly-NH2，其肖^131其半胱氨酸共,接于基质。所述生物活性因子可以由天然来源、ilil合成^重组的方式^t其混合物来制备。根据权利要求29所述，本发明还涉及制备如权利要求1-28所述组，的试剂盒(kits)。雌的实歸案是权利要求29-35的主题内容。试剂盒也落A^发明的范围中。这样的试剂盒用于制备本发明所述的组合物。该试剂盒包含(i)颗粒，和(ii)前体A，和(iii)前体B,其各自独立地lt存。该试剂盒还可以包含一种以上的颗粒和两种以上的前体。在优选的实施方案中，戶，试剂盒还包含至少一种生物活性因子作为另一可以独立地PG存的组分(iv)。如果需要，该试剂盒还可以包含两种或者更多种预混存忙、^优选分别存贮的生物活性因子。后一瞎况中，当该试剂据患者的具体需要使用时，可以混合所述因子。所述试剂盒还可能包含某些预混存贮形式的组分。例如，颗粒和前体A可以预混lt存、颗粒和前体B可以预混je存、也可以是前体B和生物活性因子预混r:存。所述前体可以干燥形^e存或者l^存于适当的溶剂中(如0.04%乙酸)。鹏用前即亥枷旭当的缓冲溶液。该前体雌以千燥形^!存。所述生物活性因子可以(预先)吸收于颗粒中。而且，该生物活性因子可以干燥(冻干)形存棘贮存于适当缓冲的7夂溶液中。前者提f姚异的稳定性因而保存周期长，而后者非常便于使用。根据权利要求36和37所述，本发明及制备如权利要求1-26所,，的方法。还提供了制备本发明所述组合物的方法。为此，所述颗粒、所述前体A和所i&前体B^;K存在下混合。tt^将7XM冲至或者,于生理pH。基质合适的缓冲范围是pH7.4-9.0。一旦不同组分混合则聚合开始并在相当短的时间段内(10秒至10併中)形^i7K凝胶。所述前,必是完全7jC溶性的。不同组分的混合可以以几种方式实现。如果前体A和B按水溶W:存则它们借助于适当的混合设备与颗粒混合。雌它们恰好在舰前过滤灭菌。最,这些组分以在生产和包装时灭菌由此保证无菌。如果这些组分以干粉形式贮存，则它们可以各自溶解于适当缓冲7K溶液中。如果试剂盒包含生物活性因子，贝IJ该因子可以与任一种前体预先混合或预先反应，或者以干燥或冻干形式或溶織态斜虫地加入。例如，如果该生物活性因子包含硫醇，则其可与前体A^5fe反应。该生物活性因子也可以在与前体A和B混合之前，预先吸收于颗粒中。根据权利要求38,本发明还涉及如权利要求1-28所^^且合物作为骨修复和/或骨增长材料的应用。在一个优选的实施方案中，本发明所述组合物用作骨修复和/或骨增长材料。实施例1将164毫克(0.084^Jf尔硫醇)HS-PEG-SH3.4k(NektarHuntsvme，AL，USA)溶解于1.71毫升的0.05%乙酸中以及将326毫克(0.083辦尔丙烯酸酯)4-臂PEG-丙烯酸酯15k(NektarHuntsville，AL,USA)溶解于1.55毫升含有100ppm亚甲蓝的0.05o/。乙酸中。将两种PEG溶液的等^H^与0.4M三乙醇膨盐酸缓冲液(pH8.85)按1.5:1.5:1的1^只比率混合，在25。C下在3.5併中内得到凝胶。将三溶液的^H^f(Vp細:V胁鹏:V^^1.5:1.5:1)移輕丽CP(60%/40%)颗粒(StraumannBoneCeramic,InstitutStraumannAG,Basel,Switzerland)并且混合。三个外科医生独立地用各种颗掛液体比例评价了组合物的应用性能<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>该实验显示所，粒容易吸收PEG溶液并5J生成的颗粒软膏(putty)易于用于下颌骨缺陷模型并且在PEG〗化后产生稳定的自生长。图1显示由外科医生1用M^化后的颗粒软膏涂抹的下颌骨缺陷模型。实施例2配方l:将150毫克(0.47，尔丙烯酸酯)8-臂PEG-丙烯酸酯2k溶解于0.60毫升0.02M三乙醇隙盐酸缓冲液(pH7.6)中和将311毫克(0.49毫摩尔硫醇)4-臂PEG魂醇2k溶解于0.44毫升水中。将相同份数的两种溶液混合，在37'C下在大约35秒内产生凝胶。配方2:将170毫克(0.45辦尔丙烯酸酯)6-臂PEG-丙烯酸酯2k溶解于0.58毫升0.05M三乙醇膨盐酸缓冲液(pH9.8)中和将190毫克(0.47辦尔硫醇)6-臂PEG嶺享2k溶解于0.56毫升水中。将相同份数的两种溶液混合，在37'C下在大约75秒内产生凝胶。配方3:将69毫克(0.018毫摩尔丙烯酸酯)4-臂PEG-丙烯酸酯15k溶解于含有100ppm亚甲蓝的0.131毫升的0.04。/。乙^7K溶液中并且将11毫克(0.018，尔硫醇)4-臂PEG-^醇2k溶解于0.189毫升的0.04。/。乙^tK溶液中。将两种PEG溶液的^H^样与0.05M三乙醇膨盐酸缓冲液(pH8.7)按1:1:3的体积比率混合，在25'C下在约2.5射中内产生凝胶。Jd^三配方中任一与HA/TCP(60%/40%)颗粒(StraumannBoneCeramic,InstitutStraumannAG，Basel,Switzerland)混合产生与实施例1的配方相类似的应用性能。实施例3用2M盐酸将0.1M三乙醇胺7jC溶液调到pH8.7。将4-臂PEG-丙烯酸酯15k和HS-PEG-SH3.4k(二者均来自Nektar，Huntsville，AL，USA)溶解于此缓冲溶液中，这样PEG总浓度是9.8%并且雜等摩尔量的丙烯酸酯和硫醇基团。将该溶液的一半与IWTCP(60%/40%)颗粒按0,6毫升液体每0.5，粒的比例混合。用不糊模具将PEG溶液以及PEG溶液与颗粒的混，都浇铸成型为直径6絲的6个彬鹏。固化15^H中后，称重嫁鹏，加A5U含有10毫升30mMPBS(pH7.4)的Falcon管并腿于37'C的水浴中。按规定间隔将该凝胶从缓冲溶液中取出，吸干并且称重。检测该缓冲溶液的pH，如果与pH7.4的偏离值大于O.l,贝的30mMPBS(pH7.4)代替所述缓冲溶液。在浇铸之后立即^胶粉碎，接着根据重量在每一个时间点划分它们的重量。带有颗粒的凝胶以及不带有颗粒的凝胶以同样的速率降解并且在约ll天内(图2)完全,，然而，加塌粒导致溶胀显著陶氐。图2显示于37。C在PBS(pH7.4)中7KI^样品(9.8重*%带有/或者不带有颗粒的PEG)相对时间的溶胀。给出6个样品的平均值(±SD)。实施例4方法麻醉16只成年(12个月大)新西兰白兔，34公斤重，然后各自获得4个高7毫米，卜径7毫米的钛圆柱，将其拧A^员盖皮层骨中形成的1毫米深的圆形穿孔(perforatedslit)中。下述4种治疗形式随机分配(1)空白对照，(2)PEG基质和羟繊灰石(HA)/磷酸三钙(TCP)颗粒(StraumannBoneCeramic;InstitutStraumaraiAG,Basel,Switzerland)的组合，以及含有100(3)或者20微弥克(4)PTHl34凝咬的PEG基质与HA/TCP颗粒的组合。应用前即刻将4-臂PEG-丙烯酸酯15k和HS-PEG-SH3.4k(二者均来自Nektar，Huntsville,AL，USA)各自溶解于0.1M三乙醇膨盐酸缓冲液(pH8.7)中，这,两种溶液一起时PEG总浓度是9.8重1%并且存在等摩尔量的丙烯酸酯和硫醇基团。然后将两种PEG溶液都过滤灭菌。嫩卜地将35氨基^l太甲状旁腺素(cys-PTHw)和9雜酸cys-RGD肽(二者均来自Bachem，Bubendorf，Switzerland)加入该PEG-丙烯酸溶液中，导致在半胱氨,SfPPEG-丙烯酸酯之间形成判，。肽的最终浓度是cys-RGD350微效克凝胶，cys-PTH^20或者100微克/克凝胶。然后将PEG溶液涂覆于丽CP颗粒之上h并且混合大约10秒。接着，该颗粒软膏应用到确定的圆柱中。在60秒内，该PEG繊定型并因而使HAyTCP颗粒稳定化。该圆柱朝骨内方向开放但朝TO^^"骨膜薄片方向用钛盖封闭。骨膜和皮肤薄片修改并缝合以用于初步愈合。8周以后，处死这些^并且准备沉积部分用于组织学。从组织学评价在圆柱中的骨形成。计算在圆柱中骨形成的平均值和标准偏差，舰点测量或魏过骨再生以及移植部分与骨接触的面积邀行评价。为统计分析，使用根据Hdm所述的反复测量ANOVA和随后带有修正p-数值的成对t-实验来检测4种治疗形式之间的差异。结果所有动物显示出手术区J^平整愈合并且没有观察到体重减轻。就样本修补而言，由豫少固定3个圆綠头盖骨脱位而SA软连接组织中。这3个圆柱(2个测试位点和一个对比位点)没有进皿一步分析。发现其余61个圆柱是稳定的并且在设置原位。定性组织学刑介显示在所有圆柱中各种縫的新生长骨没有发炎迹象。在空白对照圆柱中，增长组织包含细长的骨柱(slenderbonetrabeculae)和大空间。临近圆柱内壁表面的骨柱平行取向并且以各种程度紧密接触经机械加工的圆柱表面。在^f虫含有非官能化PEG基质和FWTCP颗粒的对比圆柱中，新生长骨量差异巨大。与空圆柱相反，该骨生长不是主要沿着1并且新骨大多与颗粒紧密撤虫，其看總完整并且均匀分布在生长的组织中。在以上第三种圆柱中，HA/TCP颗粒主要被丰矿物雌织包围。在两个实验组中，明显检测到较新生成的骨，部分达到上面第三种圆柱。在圆柱断面上骨再生面积如下所示-<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>图3显示对于不同治疗的骨再生区域以皿著14^平。M，据中断定颗粒与含有与ha/TCP颗粒结合的共^H合的甲状旁腺素肽的聚乙二醇7KH^的组合显著isia兔子原位骨自生长。具体讲，图3显示用于兔子头盖骨的^ffl带有PEG颗粒的圆柱模型的骨再生区域。以范围在25、75&分位;^曲线显示数值，包括中值和,内四分位数范围1.5倍的寄生振荡(whiskers)。实施例5方法麻醉8只成丰(12个月大)新西兰白兔，34公斤重，然后各自获得4个高7毫米且外径7毫米的钛圆柱，将其拧A/1M^层骨中形成的1毫米深的圆形穿孔中。下述4种治疗形式随机分配(1)空白对照，(2)含有0.31毫克/毫升共《/rH合RGD的PEG基质和羟基磷灰石(HA)麟酸三药(TCP)颗粒(Straum咖BoneCeramic,InstitutStraumannAG,BaselySwitzerland)的组合，以及含有0.31毫弥毫升共i^ll合RGD的PEG基质和15微克(3)或者30微克(4)非键合重组BMP-2和HA/TCP颗粒的组合。应用前即刻将4-臂PEG-丙烯酸酯15k和HS-PEG-SH3.4k(全部来自Nektar，Huntsville，AL，USA)溶解于2mMHC17jC溶液中以产生含有等摩尔数丙烯酸酯和硫醇基团的均质溶液，然后将其过滤灭菌。将该灭菌PEG溶液的^H^f、9氨基酸cys-RGD肽(来自Bachem,Bubendorf,Switzerland)的溶液，和BMP-2溶液与0.4M三乙醇膨盐酸缓冲液(pH8.85)混合以产生204微船有9.8S4%PEG、0.31毫弥毫升RGD以及0、74、或者147微弥毫升BMP-2的溶液。然后将该溶液涂覆于150毫克的HA/TCP颗粒之上并且混合大约10秒。接着，繊粒软膏应用到确定的圆柱中。在60秒内，该PEG)定型并因而使HAATCP颗粒稳定化。圆柱朝骨内方向开放但朝覆盖皮肤-骨膜薄片方向用fAM^闭。骨膜和皮肤薄片修改缝合以用于初步愈合。8周以后，处死这些动物并且准备沉积部分用于组织学。依照组织学评价在圆柱中的骨形成。计算在圆柱中骨形成的平均值和标准偏差，M点领懂棘ffiil骨再生面禾;ya衍平价。结果所有动物显示出手术区^平整愈合并且没有观察到体重减轻。在圆柱断面上矿物化骨面积百分比如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>图4显示对于不同治疗的骨再生面积百分比以皿著'lfcK平。从这^中断，粒与含有共if^合RGD肽和与HA/TCP颗粒组合的包埋BMP-2的聚乙二醇水凝胶的组合显著,兔子原位骨自生长。具体讲，图4显示所发现的用，子头盖骨的使用带有PEG的颗粒的圆柱模型的矿物化骨百分比。以范围在25、75*分位数方^曲线显示数值，包括中值和皿内四分，范围1.5倍的寄生振荡。权利要求1.一种组合物，其包含颗粒，选自自生骨材料、源自天然的骨/类似骨材料、合成材料及其混合物；和基质，其能在水存在下通过至少两种前体A和B自选择反应而获得，其中第一前体A包含具有n个链的核，各个链具有共轭不饱和基团或者连接至该链的末端20个原子中的任何一个的共轭不饱和键；第二前体B包含具有m个链的核，各个链具有连接至该链的末端20个原子中的任何一个的硫醇或者胺，其中m大于或者等于2，n大于或者等于2，m+n大于或者等于5。2.如权利要求1所述的组合物，其中所粒包含羟1灰石和磷酸三钙。3.如权利要求1所述的组合物，其中所^粒包含羟1灰石和/或磷酸三朽。4.如权利要求i-3臓的组，，其中戶;M^粒中羟繊灰石麟mH钙的重量比为0,1-5.0，优选1.040，最，1.0-2.0。5.如权利要求14所述的组合物，其中所^粒中羟灰石含量为至少1敏/0，雌等于或者大于15S*%，最雌等于棘大于50重4%。6.如权利要求1-5所述的组糊，其中戶;^a^fe含10-80重*%、优选20-70S*%、最，30^60Sfi"/。的颗粒。7.如权利要求"所述的组合物，其中所述前体A的核是碳原子、氮原子、环氧乙烷、^皿、齢K化，、多官能醇、甘油^t低聚甘油。8.如权利要求1-7"膽的组糊，其中所述前体B的核是碳原子、氮原子、环氧乙烷、皿酸或肽、碳水化合物、多官能醇、甘油^#低聚甘油。9.如权利要求7所述的组，，其中所述前体A的核是碳原子、环氧乙烷单元、葡萄糖、D-山梨糖醇、季戊四醇、甘油或者六聚甘油。10.如权禾腰求8所述的组合物，其中所述前体B的核是碳原子、环氧乙烷单元、肽、葡萄糖、D-山梨糖醇、季戊四醇、甘油或者六聚甘油。11.如权利要求10所述的组合物，其中所皿包含一个^#多个,降解位点。12.如权利要求1-11所述的组合物，其中所述前体B包含肽，包含一个或者多个位点。13.如权利要求1-12所述的组合物，其包含第三前体，该前体包含肽或者就是肽，其中所鄉太包含一个或者多个SI^,位点。14.如权利要求1-13所述的组合物，其中戶腿第一前体A的共轭不饱和基团棘共轭不饱和键是丙烯酸酯、丙烯,、奎宁、2-或者4-乙烯掛比啶絲、乙烯Wl、马来M胺或者衣iW酯。15.如权利要求14戶脱的组，，其中戶M第一前体A的共轭不饱和基团或者共轭不饱和键是丙烯酸酯。16.如权利要求1-15所述的组合物，其中所述第一前体A选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>a=5-200，雌7-150,最雌20-80;式A7。17.如权利要求1-16所述的组合物，其中所述前体B包含硫醇部分。18.如权禾腰求1-17戶舰的组合物，其中所述第二前体B选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式B5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>b=5-200;^i^7-150，；S，20-80;式B6。19.如权利要求1-18戶/M的组合物，其中所述前体A禾P/或B包含链，该链具有500-100，000Da、■1000-50，000Da、最,2000-30,000Da的M20.如权利要求1-19所述的组合物，其中所述前体A种或B的链是聚合物，其选自聚(乙烯醇)、聚(烯化氧)、聚(乙二醇)、聚(氧乙烯化多元醇)、聚(氧乙烯化山梨糖醇)、聚(氧乙烯化葡萄糖)、聚(嚅唑啉)、聚(丙炼醜-嚼)、聚(乙烯掛比咯烷酮)及它们的混，。21.如权利要求1-20所述的组合物,其中所述前体A禾H/或B的链是聚(乙二醇)。22.如权利要求1-21所述的组糊，其中所述组合物包含至少一种共价键^T基质^包埋于该组合物中的生物活性因子。23.如权禾腰求22所述的组糊，其中所述生物活性因^^含硫醇。24.如权利要求22棘23所述的组糊，其中戶腿生物活性因子选自甲状旁腺素(PTH)、基于PTH的肽、PTH的肽的片断、包含RGD三肽的肽、转化生长因子e族(TGFP)、骨形态形成蛋白族(BMP)、血小板衍生的生长因子族(PDGF)、血管内皮生长因子族(VEGF)、胰岛素样生长因子族(IGF)、成纤维细胞生长因子，GF)、釉质基Mt性蛋白和肽(EMD)、前列腺素g(PGEj)禾口dentonin。25.如权禾頓求24所述的组合物，其中所述生物活性因子选自甲状旁腺素(PTH)、基于PTH的肽和PTH的肽的片断。26.如权禾腰求24棘25所述的组激，其中戶腿生物活性因子是Cys27.如权利要求24所述的组^tl，其中所述釉质基Jlt性蛋白劍太(EMD)选自釉基质、釉原蛋白、釉丛蛋白、成釉蛋白、釉蛋白和牙质涎蛋白。28.如权利要求24所述的组合物，其中所述生物活性因子是H-Gly-Cys-Gly-Arg-Gly-Asp"Ser-Pro>Gly-NH2。29.用于制备如权利要求1-28戶/fj^且合物的试剂盒，其包含(i)颗粒，禾口(ii)前体A,和(iii)前体B,其中所繊粒、前体A和前体B如权利要求1所定义，作为独立贮存的组分。30.如权利要求29所述的试剂盒，其包含(iv)包含至少一种生物活性因子，其中该生物活性因子如权利要求20-26所定义，作为进一步^5Ji存组分。31.如权利要求29赫30所述的试剂盒，其中所繊粒和前体A以预、32.如权利要求29赫30所述的试剂盒，其中戶;f^粒和前体B以预33.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述前体B和生物活性因子以预混物歸。34.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述生物活性因子以冷冻千燥的35.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述生物活性因子贮存于适宜的缓冲溶液中。36.制备如权利要求1-28所述组^l的方法，S5i^7jC存在下将所，粒、所述前体A和所述前体B在适宜容器中混合而进行。37.制备如权利要求1-28戶/f^a働的方法，舰a)在水存在下将前体A、前体B和生物活性因子于适合容器中混合，以及b)将所，粒加入并且与步骤a)所获得的预混^T混合。38.如利要求1-28所，^作为骨修复和/或骨增长材料的应用。全文摘要本发明涉及一种组合物，其包含选自自生骨材料、源自天然的骨/类似骨材料、合成材料及其混合物的颗粒，以及可通过在水存在下至少两种前体A和B的自选择反应而获得的基质。还描述了制备所述组合物的试剂盒。文档编号A61L27/54GK101244292SQ20071008797公开日2008年8月20日申请日期2007年2月16日优先权日2006年2月20日发明者A·奈哈特,A·莫伦勃戈,C·哈默雷,D·费尔,R·荣格申请人:斯特劳曼控股公司