专利名称：适宜用作肠病原体凝集剂的三寡糖和四寡糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及三^t和四寡糖或它们的提取物或它们的衍生物或其
混合物作为病原体凝集剂(agglutination agent)的用途。尤其是，本 发明涉及三寡糖和四寡糖或它们的提取物或它们的衍生物或其混合物 通过肠病原体的特异性计数(enumeration)及随后的特异性排泄来改善 动物胃肠道中的微生物生态系统从而改善动物重量的增加、降低祠料 转化并以这种方式改善动物的饲养价值、健康和良好状态(well-being) 的用途。
背景技术：
在现代动物生产体系中，肠内孩￡生物区系和宿主动物间的平衡是 一种微妙的平衡，该平衡的扰乱(例如通过细菌感染)将对动物的总体 性能产生负面影响(Eckel, 1999)。关于牲畜中肠内微生物感染问题的知 识使通过稳定肠内微生物区系而影响以飼料添加剂进行的生物调节过 程、降低腹泻频率以至减重(loss)的全新方式成为可能。过去，这种 感染问题部分通过提供含抗生素作为生长促进剂的饲料来解决。
但在自传统抗微生物剂(例如青霉素)的发现以来已有50年的今 天，许多细菌已对一种、很多情况下是多种抗微生物剂具有耐性 (Guillot, 1989)。这种耐性证明每年对成千上万的人是致命性的并导致 高的医疗成本和沉重的经济成本(Barton， 1998)。对抗孩i生物剂的耐性 问JHA全球性的，但部分由于抗微生物剂在动物营养物中的广泛使用 所引起，抗微生物剂之所以在动物营养物中被广泛使用是因为其向饲 料配方中的添加导致更佳的性能(降低的饲料转化和较高的生长速率) (Dupont和Steele, 1987; Prescott, 1997)且因为所有抗微生物剂的使用 中超过半数与动物生产相关(Aarestrup, 1999)。对于一些国家，例如欧 盟，这已导致可在饲料配方中用作生长促进剂的所有抗孩史生物剂的禁 用(Muirhead, 1998; Ross, 1999)。
今天仍在使用的大多数传统抗微生物剂及其他生长促进剂的问题在于其以细胞内水平攻击细菌(Guillot，1989)。也就是i兌，它们抑制用 来构建细胞的化合物的合成中的关键酶。当使用这种方法时，细菌会
制。或者，它们会产生直接降解抗微生物剂的酶(例如p-内酰胺酶)(Neu 等人，1980; Chirica等人，1998)。通过质粒转移(经由微生物4^)，耐 性可快速地从一种微生物细胞转移到另一种(耐药性扩大)(Finland, 1971; Hedges和Jacob, 1974; Thompson, 1986; Hamilton, 1994)。
由于在动物饲料中使用传统抗微生物剂(作为生长促进剂)带来的 世界性负面反应，人们进行了研究来寻找新型的(天然)抗微生物剂或 生长促进剂(主要釆用另一种作用模式)(Mazza， 1998)。在研究替代的 (天然)抗微生物剂的过程中，目前人们注意的焦点主要放在若干(有机) 酸(Eckd， 1997; Liang, 1997; Radecki等人，1988)、新的活性益生菌 (Chiquette and Banchaar, 1998; Garriga等人，1998; Tannock， 1999)、 益生元(Olsen， 1996; Bower等人，1998; Brown等人，1998; Iji和Tivey， 1998; Houdijk等人，1999)、 一些植物(洋葱和大蒜)提取物和药草提取 物(精油)(De Koning和Hongbiao, 1999; Nielsen, 1999)的使用上。
如今，不同类型的^瞎已用于不同的应用中。在这些应用的一些 中，寡糖被(共价)连接到支承物或载体上。
WO2006022542要求保护不可消化的寡糖和可消化的半乳糖组合 用于制备呼吸道感染和/或呼吸道感染疾病的治疗和/或预防的方法中 所用组合物的用途，所述方法包括向哺乳动物口服施用组合物，所述 组合物包含a)含不可消化的寡糖的半乳糖，所述不可消化的寡糖含至 少两个端基糖单元，其中至少一个端基糖单元选自葡萄糖和半乳糖， 至少一个端基糖选自半乳糖和岩藻糖；和b)占组合物总干重的至少 5重量％的可消化半乳糖，所述糖选自半乳糖和包含含有至少两个端 基糖单元的糖的可消化半乳糖，其中至少一个端基糖单元选自葡萄糖 和半乳糖，至少一个端基糖选自半乳糖和岩藻糖。剂量为每100克组 合物千重0.1-12克聚合度为2-10的反式半乳寡糖 (transgalactooligo-saccharide )。
WO2004074496涉及一种制备新型S^的方法，所述方法包括将 底物与乳酸杆菌Utf"Ma"7/ws) a-半乳糖苷酶组合。该发明也涉及所 述寡糖本身及包含所述寡糖的组合物。该发明还涉及所述寡糖以及包含所述寡糖的组合物用来增加动物胃肠道中的有益菌的用途。所述寡 糖由半乳糖和葡萄糖组成。
JP2002226496提供了 一种通过不加酸水解多糖来获得寡糖及获 得含所述寡糖的抗传染病试剂的方法。方案让硫酸酯化多糖(以岩藻 多糖为例)通过含g和硫B作为交换基的H型阳离子交换树脂柱 然后加热以使硫酸酯化多糖水解得到寡糖。通过该方法获得的寡糖主 要由岩藻糖组成，并且在用作抗传染病试剂时通过阻止病原真菌粘附 到肠道上而具有对抗大肠杆菌(五sc/^n'c/wVi "//)、弧菌(W6nV )等 的活性。
CN1370784描述了甲壳胺低聚糖的制备方法，所述方法包括用醋 酸将曱壳胺溶解、加酶进行反应、加入盐酸和最后的喷雾干燥，其特 征在于所加入的包括半纤维素酶、纤维素酶和p-淀粉酶的酶以A^应 过程中的减压蒸发。该方法将甲壳胺降解为含2-12个甲壳胺的曱壳胺 低聚糖，平均分子量为1500。曱壳胺低聚糖可用以抑制肿瘤、防治肝 病、改善肠道功能、防治老年病。
JP2002121138描述了用来预防肠道传染病的组合物的制备，所述 组合物能预防因肠道传染病的致病菌引起的传染病。方案该用于预 防肠道传染病的组合物包含选自衍生自鸡蛋黄、寡糖结合蛋白和^t 结合肽的寡糖中的一种或更多种。该组合物特别是为唾液酸寡糖、唾 液酸寡糖蛋白和唾液酸，肽。此外，该组合物对肠道传染病的致病 菌向宿主细胞上的粘附具有抑制作用。
US6069137描述了一种治疗由对象中肠产毒性大肠杆菌介导的旅 行者腹泻的方法，该方法包括向需要这类治疗的对象施用有效量的包 含与衍生硅胶颗粒(derivatized silica particle)共价连接的选自 P-Gal(l-4).|5-Glc 、 .p.Gal(l-3).p.Ga歸c 、 p.GalNAc(l-4).(5.Gal 、 P.Gal(l-3).p.Gal、 (3.Gal(l-3).p.GalNAc(l-4).p.Gal 和
a.NeuAc(2-3).|5.Gal的M序列的组合物，其中所述S^序列与肠产毒 性大肠杆菌的至少 一种血清型结合，且其中所述组合物能从胃肠道中 消除。
EP1018342描述了 一种试剂在制备用于预防或治疗由SLT介导的 肠道传染病的药物中的用途，其中所述试剂为能从胃肠道中消除的药 学可接受的固体惰性亲和栽体，所述载体有通过间隔臂共价连接于其上的亲和配体，其中所述配体被表征为含与SLT结合的二糖亚单元 aGal(l-4).(5Gal 的寡糖；前提是所述二糖不是 aGal(l-4)ssGal(l-4).j5GlcNAc三糖或aGal(l國4)ssGal(l画4).pGlc三糖的 一部分。
US5939397描述了 一种治疗由对象中霍乱弧菌(K C7io/eni)传染 病引起的霍乱和电解质失衡及腹泻的方法，所述方法包括向需要这类 治疗的对象施用有效量的包含通过非肽勤目容的连接臂与药学可接受 的固体惰性载体共价连接的寡糖序列的组合物，其中所述寡糖序列在 如此结合到所述固体惰性载体上时能与霍乱弧菌的一种或更多种血清 型结合，且其中所述组合物能从胃肠道中消除。所述S^t为1-3 。
本发明的一个目的是提供更具特异性和活性的一系列对胃肠道中 的微生物生态系统具有改进效果的g。更具体而言，本发明旨在提
泄来选择性地控制和调节有此需要的对象的胃肠道中的微生物生态系 统。当作为(饲料)组合物施用给动物时，相信所述活性出人意料地导 致其成为有效的(饲料)组合物而导致改进的饲料转化率(即每千克体重 增加所消耗饲料的重量)和改进的动物饲养价值、健康和良好状态。
发明内容
本专利申请尤其是通过下述措施来改进现有技术
-其他生物活性寡糖结构，所述结构主要包含戊糖(如核糖、阿拉 伯糖、木糖和来苏糖)、己糖(如阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、 塔罗糖和甘露糖)、葡糖醛酸、半乳糖醛酸或它们的衍生物和混合物，
-明确限走的较小范围的聚合度(3-4)，
-较^氐的包合率，
_无需支承载体或连接臂，
-仅对病原微生物有凝集活性。
本发明涉及S^的三聚体和四聚体(也称三(寡)糖和四(寡)糖)或其 -时生物作为具有生长促进能力的新型创新性试剂的用途。
在第一方面，本发明涉及包含选自包括戊糖、己糖、其L或D异构体、其a或(5形式、其组合、其氧化衍生物或其任意混合物的集合 的组分的均三聚体、异三聚体、均四聚体和/或异四聚体的组合物用作 凝集肠病原体的凝集剂的用途。本发明提供了选定的糖低聚物(寡糖) 或其衍生物的用途。本发明涉及低聚反应程度低的寡糖或其衍生物的 用途，更具体而言涉及三(寡)糖和四(寡)糖或其衍生物。有利的是，本 发明的糖低聚物本身将提供令人满意的效果。它们不需要(共价)连接 到任何类型的载体或支承物上。此外，另一优势在于选定的糖低聚物 具有较低的包合率且仅对肠病原体具有活性。
优选本发明的组合物为用以选择性地控制和调节有此需要的对象 的胃肠道中微生物生态系统的固体或液体饲料组合物，所述方法包括 用如本文中所定义的组合物喂所述对象。本发明还提供了控制有此需 要的对象的腹泻的方法，所述方法包括向所述对象施用如本文中所定 义的组合物。本发明的另一方面包括改善有此需要的动物的体重增加 和降低有此需要的动物的饲料转化率的方法，所述方法包括向所述动 物施用如本文中所定义的组合物。
本发明至少部分地基于这样的观察，即作为伺料添加剂向动物提 供三(寡)糖和四(寡)糖或其提取物或衍生物将以下述特定方式改变动
物胃肠道中的微生物生态系统。第一阶段，通过避免其粘附到胃肠道 壁上而出人意料地计算出胃肠道腔中肠病原体的总量(=胃肠道内选 择性产生的肠病原体)，第二阶段，计数的肠病原体非常快速地从动物 的胃肠道中排泄出去(优选在施用三(寡)糖和四(寡)糖后两周内)。肠病 原体可包括病原菌、真菌、酵母菌和病毒。在第二种情况下，通过从 胃肠道中快速消除肠病原体，获得更好的动物性能，所述性能反映在 日生长和饲料转化中。三(寡)糖和四(寡)糖的生长促进效应已以来自动 物胃肠道中的富肠病原体菌林的洗提水平清晰可见。
图1示出了在喂饲后的不同时间点小鸡的胃肠道中肠病原体的数量。
图2示出了对A)大肠杆菌K88和B)食淀粉乳杆菌(￡""o^c///ws "/^/ww"s)使用三甘露糖和/或四甘露糖的凝集试验的结果。
具体实施例方式
本发明涉及一种组合物及其用作凝集肠病原体的凝集剂的用途。 更具体而言，本发明的组合物包含寡糖，更优选选自包括戊糖、
己糖、其L或D异构体、其a或p形式、其组合、其氧化;时生物或其 任意混合物的集合的组分的均三聚体、异三聚体、均四聚体和/或异四
聚体。术语絲指短链糖分子。术语"低聚物"在本文中用来指具有多 于一个的单体单元的化合物。本发明的组合物中存在的低聚物大体包
含(寡)糖化合物的三聚体和四聚体，更具体而言包含均三聚体和/或异
三聚体。
可以使用至高约1%的浓度、优选0.01-0.2重量％的量以及可能与 其他原料或其他生长促进物质如抗生素、益生菌、益生元、酸等组合 来达到此特定目标。已经发现0.125g/100g飼料是特别适宜的(参见实 施例)。
总的来说，三，和四斜t(或它们的提取物或它们的衍生物)首 先引起肠病原体的生长(肠病原体的生长促进)，然后清除所计数的肠 病原体菌林。
本发明的新颖性在于三寡糖和四寡糖(或它们的提取物或它们的 衍生物)可用作动物饲养中的特异性生长促进剂，而本发明的创新性特 征在于对动物胃肠道中肠病原体的计数，之后清除所计数的肠病原体。 结果，实现了较少的腹泻和更佳的性能。此外，由于肠病原体从动物 中排泄出去，动物将变得更健康。动物可包括鸟类(家禽等)和哺乳动 物(猪、反刍动物、宠物等，也包括人)。
所观察到的效果在(最终干燥的)三寡糖和四斜奢(或提取物或衍 生物)正常通过动物胃肠道的过程中获得。
本发明涉及4吏用如本文中所定义的组合物或三，和四，或它 行特异性计数之后ii行特异性排泄来改善动物胃肠道中的樣吏生物生态
系统从而改善动物的重量增加、降低饲料转化并以此改善动物的饲养 价值、健康和良好状态(例如使得少患腹泻)的方法。
本发明涉及使用如本文中所定义的组合物或三寡糖和/或四寡糖生长促进剂的方法。
本发明涉及一种方法，其中三寡糖和/或四^瞎由戊糖(如核糖、阿 拉伯糖、木糖和来苏糖)、己糖(如阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、 塔罗糖和甘露糖)、葡糖醛酸、半乳糖醛酸或它们的所有衍生物和组合 组成。这也意味着所述三寡糖或四寡糖为均低聚物或异低聚物。
本发明涉及一种方法，其中己糖通过a键或p键或二者的组合彼 此连接。本发明涉及一种方法，其中半乳糖醛酸通过a键或p键或二 者的组合彼此连接。本发明涉及一种方法，其中戊糖通过a键或(5键 或二者的组合彼此连接。
本发明涉及一种方法，其中所观察到的效果在所述三S^和四寡 糖或它们的提取物或它们的衍生物或其混合物正常通过动物胃肠道和 消化的过程中获得。
本发明涉及一种方法，其中所述三^t和/或四S^t或它们的提取 物或它们的^t生物或其混合物的用量为至高约1%。
按前述权利要求的方法，其中三寡糖和/或四寡糖或它们的提取物
抗生素、益生菌、i生元、酸等组^使用。
本发明涉及一种方法，其中三，和/或四S^或它们的提取物或 它们的衍生物或其混合物的剂量为0.125g/100g饲料(干基)。
本发明涉及一种方法，其中所述肠病原体包括埃希氏菌属 (五sc/im.c/wVi )、沙门氏菌属(5W歸we〃")、志贺氏菌属(57w》e〃")、
克雷伯氏菌属(7T/e^/e〃tt)、欧文氏菌属(Enw7i/fl)、耶尔森氏菌属 (KM/mVi )、弯曲杆菌属(Cfl柳/^/"^"w )、螺杆菌属(He/ZcoZ^"w )、
弧菌属(W6n》)、假单胞菌属(」P^M^7附OWfl )以及其他革兰氏(Ofl附)
阴性菌。
本发明涉及一种方法，其中所述肠病原体包括诺如病毒属
(iV^Y v/mS)、轮状病毒属(i Otov/raS)以及其他病毒。
本发明涉及一种方法，其中所述动物为鸟类(家禽等)或哺乳动物 类(猪、反刍动物、宠物等，也包括人)。
本发明涉及一种方法，其中所述寡糖以固相或液相提供给动物。为了可以更清楚地理解本发明，将参照下述实施例对其优选形式 加以描述。
实施例
实施例1:三甘露寡糖和四甘露寡糖对家禽胃肠道中微生物生态 系统的影响
给3x40只一日龄的小鸡提供如下飼料对照饲料、添加了3ppm 黄霉素的对照伺料和添加了 0.025%三甘露，和/或四甘露*#的对 照饲料。对照饲料为捣碎的饲料，由适合作为动物营养物的原料组成。 水和饲料随意供给。在第2天时用三周龄小鸡(胃肠道问题最严重时期) 的盲肠内容物来传染小鸡。以一定的时间间隔解剖小鸡并通过在麦氏 琼脂上平板计数来测定小肠中的肠病原体含量。结果汇总在图1中。
从图l清楚地看出，三甘露 和/或四甘露*#在第一周对肠内 微生物区系的生长/存活具有积极作用。仅一周后，肠道中的肠内微生 物区系含量非常快速地降低，甚至达到比对照和黄霉素处理还要低的 水平。
实施例2:三半乳糖搭酸S^和/或四半乳糖醛酸，(tri- and/or tetra國galacturonic-oligo-saccharide)对小，鸟小生能的景》响
采用与实验1中所勤目同的实验条件。在本实施例中于13天后监 测曰生长和饲料转化。结果汇总在表1中。
表l:四寡糖对小鸡.性能的影响
对照对照+黄霉素对照+四寡糖
第l天时重量/小鸡43.143.5443.66
第13天时重量/小鸡164.1208.8211.5
飼料转化/小鸡1.801.511.48
从表1可以推断，在该特定试验中三半乳糖醛酸寡糖和/或四半乳 糖醛酸寡糖的使用给出了与使用传统生长促进剂(黄霉素)所获类似的 结果。但作用模式没有可比性(参见实施例1)。
11实施例3:三半乳糖醛酸S^和/或四半乳糖醛酸S^t对小猪性能 的影响
试验开始时，每栏圏养5只小猪。每栏装一饲料槽(随意装S己)以 便给予固体丸粒状饲料。每栏装一饮水乳头。开始时温度为28。C，直 至断奶后的10天。之后将温度降至25。C。给予市售的不含药物的饮 食。不含药物是指小猪在试验前和试验过程中未接受任何治疗用抗生 素。所述饮食以丸粒形式给予。
所述饮食如下
■Co:对照饮食
-Tr:对照饮食+0.125%的甘露，
试验设计如下2种处理(Co和Tr)xl6组平行测定x5只小猪。
在试验开始时，将小猪(体重约7kg)按重量分配进不同的栏中。进 行这种分配是为了佳:每个处理和每一栏具有相等的平均重量和相等的 平均重量标准偏差。以一定的时间间隔对小猪称重并监测饲料消耗。 得到日生长、日采食量和饲料转化率(表2)。
M^接受甘露寡糖的小猪的畜牧学性能
饲料参数断奶生长总计
Co曰生长(g/猪/d)116.0320.9218.4
采食量(g/猪/d)156.3419.5287.9
饲料转化率1.731.631.65
Tr曰生长(g/猪/d)131.9322.2224.8
采食量(g/猪/d)225.2515.1363.7
饲料转化率1.731.681.65
42可以推断，供给甘露寡糖改善了小猪的畜牧学;f^。
实施例4:三甘露寡糖和/或四甘露寡糖对病原体凝集的影响
以0.025%的剂量将三甘露，和/或四甘露寡糖与大肠杆菌K88 和食淀粉乳杆菌细胞在pH 7.0的液体中孵育10分钟。10分钟后通过 显微分析目测凝集情况。图2给出了结果。从图2中清楚地看到，三 甘露*#和/或四甘露寡糖能凝集大肠杆菌K88细胞而不凝集食淀粉 乳杆菌细胞。这意味着病原微生物被三甘露*#和/或四甘露^#所凝集。
实施例5:木寡糖的聚合度对病原体凝集的影响
以0.025%的剂量将^4#、三木JMt、四木*#、五木S^t和十木 寡糖与大肠杆菌K88和食淀粉乳杆菌在pH 7.0下孵育10分钟。10分 钟后通过显微分析目测凝集情况。清楚地看到，用三木寡糖和四木寡 糖获得了最佳凝集。这意味着病原微生物优选被三木寡糖和/或四木寡 糖所凝集。
参考文献
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chemical composition of free and particle associated bacterial populations of the rumen.
Can.丄Anim. Sci.，迅"5-120.<formula>formula see original document page 14</formula>
权利要求
1. 包含选自包括戊糖、己糖、其L或D异构体、其α或β形式、其组合、其氧化衍生物或其任意混合物的集合的组分的均三聚体、异三聚体、均四聚体和/或异四聚体的组合物用作凝集肠病原体的凝集剂的用途。
2. 根据权利要求l的用途，其中所述戊糖为戊醛糖，优选包括 核糖、阿拉伯糖、木糖和/或来苏糖。
3. 根据权利要求l的用途，其中所述己糖为己醛糖，优选选自 包括阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖的集合。
4. 根据权利要求1的用途，其中所述组分包含葡糖醛酸和/或半乳 糖酪酸。
5. 根据权利要求l-4中任一项的用途，其中所述戊糖、己糖、其 L或D异构体、其a或p形式、其组合、其氧化;肝生物通过a和/或p 糖苷键彼此连接。
6. 根据权利要求l-5中任一项的用途，其中所述均三聚体、异三 聚体、均四聚体和/或异四聚体以占所述组合物干重的至多1%的量、 优选0.01-0.2%的量存在。
7. 根据权利要求l-6中任一项的用途，其中所述肠病原体为选自 包括埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏 菌属、耶尔森氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、弧菌属、假单胞菌属 以及其他革兰氏阴性菌的集合的细菌。
8. 根据权利要求l-6中任一项的用途，其中所述肠病原体为选自 包拾若如病毒属、轮状病毒属以及其他病毒的集合的病毒。
9. 根据权利要求1-8中任一项的用途，与一种或更多种选自包括 抗生素、益生菌、益生元和/或酸的集合的其他组分组合。
10. 根据权利要求l-9中任一项的用途，其中所述组合物以固体或 液体形式使用。
11. 根据权利要求1-10中任一项的用途，其中所述组合物为固体 或液体饲料组合物。
12. —种选择性地控制和调节有此需要的对象的胃肠道中微生物生态系统的方法，所述方法包括用如权利要求l-ll中任一项所定义的 组合物喂饲所述对象。
13. —种控制有此需要的对象的腹泻的方法，所述方法包括向所 i^t象施用如权利要求l-11中任一项所定义的组合物。
14. 一种改善有此需要的动物的体重增加和降低有此需要的动物 的飼料转化率的方法，所述方法包括向所述动物施用如权利要求1-11 中任一项所定义的组合物。
15. —种如权利要求1-11中任一项所定义的组合物。
全文摘要
本发明涉及包含选自包括戊糖、己糖、其L或D异构体、其α或β形式、其组合、其氧化衍生物或其任意混合物的集合的组分的均三聚体、异三聚体、均四聚体和/或异四聚体的组合物用作凝集肠病原体的凝集剂的用途。本发明还提供了一种选择性地控制和调节有此需要的对象的胃肠道中的微生物生态系统的方法。
文档编号A61K31/702GK101454011SQ200780019619
公开日2009年6月10日 申请日期2007年5月29日 优先权日2006年5月30日
发明者卡特林·德谢佩, 格特·布吕热曼 申请人:营养科学股份有限公司