流感全病毒减活疫苗重组体、其构建方法及应用的制作方法

专利名称：：流感全病毒减活疫苗重组体、其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组病毒体毒4朱，尤其涉及一种流感全病毒减活疫苗冷适应重组体、其构建方法及用途，属于生物制药领域。
背景技术：
：应用减毒流感疫苗进行免疫是模仿流感病毒的自然免疫学原理。它是通过对鼻腔粘膜施用雾化状态适冷型减毒疫苗来实现的，此疫苗诱发血清和粘膜抗体的产生并激活细胞免疫机能，因而其免疫性与自然感染相似。另外鼻腔喷雾^^药比注射方式更能增加人们的接受程度。鼻喷式流感全病毒减活疫苗是利用美国密执根大学Maassab博士通过温度适应原理建造的适冷病毒作为疫苗构建的基础，此适冷病毒，在疫苗病毒的构建中又称主供体病毒(MDV)，是将流感病毒在逐渐降低温度的条件下进行了多次传代，从而产生一林可以在25。C下有效、稳定生长的病毒，经过对此原始病毒及其多次和在多种条件下传代所产生的中间体病毒的基因型的分析研究，结果表明其对温度适应的特性是由其编码的遗传基因所决定的，与原始病毒相比，适冷病毒的六条内源基因序列发生了重要的变更，这些变更保证了适冷性病毒能在低温下稳定生长。通常情况下野生型原代病毒的生长在25。C下严重受限，而主供体病毒是适冷型的，即在25。C下能有效生长；主供体病毒也是温度壽文感型的，即A型病毒的生长受限温度为39°C，B型病毒的生长受限温度为37°C。因雪貂对流感病毒的反应与人体非常相近，釆用雪貂为动物材料所作的动物安全性和免疫原性等实验证实，主供体病毒是在雪貂中为减活的，即此病毒不能在雪貂体内产生常见的人流感症状。由Maassab博士建造的流感A型和B型主供体病毒抹是减活基因的稳定供体，可用于构建减活流感侯选疫苗。自1976年以来，美国国家健康研究中心及其它医疗机构对一些适冷型疫苗侯选毒抹进行了临床研究，在这些临床研究中，一价和二价A型疫苗，一价B型疫苗，以及三价疫苗被施用于8000多人，年龄从2个月到100多岁。
发明内容本发明首先所要解决的技术问题是利用现代分子生物学原理和手,殳，通过最佳的遗传组合，完成病毒学的目标，即产生一种减活的、适冷的、温度牵文感的流感病毒疫苗重组体。本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种减活的、适冷的、温度敏感的流感病毒疫苗重组体(CaA/Newcaledonia/20/99),其微生物保藏号是CGMCC1538;^呆藏地点是中国孩i生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏时间2005年11月17日。本发明流感病毒减活疫苗重组体含特定的基因组合，由于流感病毒基因组结构的特异性，即8个基因分别由8个RNA片段编码，在病毒复制过程中，8个基因片段可以自由组合，因而，此疫苗的组成特点为两个表面蛋白基因HA和NA来源于野生型病毒，六个内源病毒基因PB2，PB1，PA，NP，M和NS来源于适冷型病毒，表面抗原基因决定了病毒的抗原性，内源基因决定了病毒的减活与适冷性。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种制备上述流感病毒重组体的方法。本发明所要解决的另一技术问题是通过以下技术途径来实现的一种制备上述流感病毒重组体的方法，包^^以下步骤将流感主供体病毒和流感野生致病型病毒混合共感染，筛选病毒重组体、克隆、鉴定即得。上述制备方法中，其中，所述的主供体病毒^^朱优选为适冷型的A/AnnArbor/6/1960或B/AnnArbor/1/1966(购自MobioHealth公司)；所述的野生致病型病毒抹(购自英国NIBSC)优选为A/NewCaledonia/20/1999、A/Wyoming/3/2003和B/Jilin/20/2004。将主供体病毒与野生性病毒按5:1到1:50(优选为1:1)的比例混合共感染；共感染的温度为20-33°C,优选为27。C;共感染的时间为20-60小时，优选为24小时；共感染的剂量是每个病毒感染1-0.01细胞，优选为每个病毒感染1个细胞。适当比例的主供体病毒与野生性病毒，以及感染剂量对成功地构建种子疫苗起到决定性的作用。首先，各病毒的感染剂量是本着每个病毒感染一个细胞的原则，.即MOI(Multiplicityoflnfectivity)为1,这个原则的确立是为了确4果每个细胞最多只被一个病毒感染，只有一套病毒基因组进入细胞，与此同时，由于病毒储备液中绝大部分病毒颗粒是无感染力的，尽可能使重组时干扰病毒颗粒数量维持最低，MOI太高会影响感染效率；再者，病毒的个体差异性也决定了在混合实验中使用其它感染滴度比例(MOI)。在确定了感染剂量后，两种病毒的比例也是一个重要因素，如果根据每种病毒有一个病毒颗粒感染一个细胞的原则，主供体病毒与野生型病毒的比例为1:1,这一比例在实-睑中也经常被采纳。由于主供体病毒在低温25。C下生长，而野生型病毒则不能，本发明选择25-33°C作为混合感染温度，优选27。C作为混合感染温度，从而给两种病毒的生长都提供了机会，但相对而言对主供体病毒生长更有利，较大程度地限制了野生型病毒的生长，提供了一个有利于获取主供体病毒的六个内源基因的条件。病毒完成一个循环复制所需时间不等，流感病毒多为4小时左右，但由于病毒感染不同步，加上病毒的个体生物差异性，为了确保基因重组的发生，本发明选择共感染的时间为20-60小时，优选为24小时。完成混合感染后，得到的是一个含多种基因组合的重组病毒的混合物，从中得到所需的6:2病毒体，即两个表面蛋白基因来源于野生型病毒，六个内源基因来源于适冷型病毒，可参考以下的方法进行筛选首先，本发明对这个病毒混合体用抗主供体病毒的抗血清去中和含主供体表面抗原的病毒颗粒，保护那些含野生型表面抗原的重组病毒；然后从鸡胚中分离出的病毒经终点稀释法稀释后接种鸡胚肾原细胞，经培养，每天测定各样品的凝血酶效价(HA),含HA+的孔数小于50%的培养亚被选用进入下一步筛选。小于50%的板被定义为达到终点稀释度，即每孔中最多只接受一个具有感染性病毒颗粒的理想状态。最后将HA+的细胞悬液接种鸡胚培养，收集蛋清液。以上收集的蛋清液被用来抽提RNA，通过常规RNA反转录过程形成cDNA，以此cDNA为模板采用DNA聚合酶链式反应(PCR)来取得流感病毒的八个基因片段，将各基因片段用适当的限制性内切酶处理，再用琼脂凝胶电泳法分析，将未知样品与两个母本病毒的限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)相比较，从而鉴定未知病毒中各基因片段的来源，HA和NA来源于野生型，其它六个内源基因来源于适冷型，即6:2重组体。本发明以经多次逐渐降温而培养出来的一种遗传性稳定、适冷性的流感病毒遗传变异体作为模板，用当年流行的野生型病毒的表面抗原取代该适冷病毒的表面抗原而制备得到流感减毒活疫苗。本发明重组体病毒是适冷的(在25。C条件下有效生长)、温度敏感性的(A型病毒的生长受限温度为39°C，B型病毒的生长受限温度为37°C)、减活的(在雪貂中为减活的，即此病毒不能在雪貂体内产生常见的人流感症状，可用于产生活流感候选疫苗)。本发明病毒重组体的适冷性与在动物或人体内弱化的特点使它成为极好的候选疫苗，补充了目前流感疫苗的短缺状态。本发明最终产品为三价减活流感全病毒疫苗混合物，其制备方法如下三林单价减活、适冷疫苗病毒分别含有当年世界卫生组织推荐的三种野生型病毒的表面抗原，三种野生型病毒包括两个A型病毒，即H1N1和H3N2，和一个B型病毒。单价病毒构建完成后，先用常规的终点稀释法测定出各单价疫苗病毒的效价，以组织培养半感染剂量(TCID5。/mL)表示。将各单价病毒用无菌的蛋清液稀释至要求的最终效价，即1065-10"。使用时，将所制备的疫苗混合物以500pL分装入微型喷雾器。本发明还提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有治疗上有效量的本发明流感病毒疫苗重组体，任选的一种或多种免疫佐剂和药学可接受的赋型剂。以本发明三价减活流感全病毒疫苗接种CD—1小鼠(ICR品系，剂量为50uL/只，接种方式为鼻腔喷射)，接种后观察小鼠的生命体征和测试其免疫反应，并对每组小鼠用与测试疫苗相等剂量的野生型三价病毒进行攻击试验，测定本发明疫苗对病毒感染的保护性及能力。试验结果表明抗体在接种本发明疫苗后的第四天开始产生，在第六到第八天达到最高。之后的十多天的观察期间抗体效价一直维持较高水平。小鼠21天后接受三价野生型病毒攻击，未接受免疫的对照组动物全部(IOO%)出现流感症状，死亡率为100%;接受免疫的动物中有16.7%的小鼠体温稍有升高，两到三天后消失，未出现明显的流感症状，其中两只小鼠出现无力体征，体温分别为39.(TC和39.5'C,其它小鼠表现正常，本发明三价流感疫苗的免疫保护效率达到93.3%。总体结果表明，本发明减活流感疫苗具有较好的抗原性和免疫原性，而且在动物体受较高浓度同类野生型病毒感染的情况下也能产生当高的保护力。用本发明三价减活流感全病毒疫苗接种CD—1小鼠(ICR品系)，剂量为50uL/只，以鼻腔喷雾接种来评价本发明疫苗对动物体的安全性。与此同时，用同剂量的三价野生病毒混合体、以同样的接种方式接种阳性对照组，和用磷酸緩冲液接种阴性对照组。通过连续15天对各组小鼠的观察，确定小鼠有无流感症状，测定体征及记录死亡率。试验结果表明，本发明疫苗组小鼠与阴性对照組小鼠综合指标无明显差异，两组小鼠的平均体重在接种前和接种后变化幅度基本一致，未出现小鼠死亡。阳性对照组呈典型流感症状，死亡率为95%。实验结杲表明，本发明三价减活流感疫苗对小鼠使用是安全的。图1主供体对照限制性酶切电泳图谱；图2野生型对照限制性酶切电泳图谱；图3本发明病毒重组体限制性酶切电泳图谱；图4小鼠对本发明疫苗、无菌磷酸盐緩冲液和野生性病毒的不良反应率;图5免疫后小鼠体内三种病毒特异性抗体效价；图6受试动物免疫后，小鼠体重在野生型病毒攻击前后的变化；图7受试动物免疫后，小鼠体温在野生型病毒攻击前后的变化。具体实施例方式以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。本发明病毒重组体的制备。用无特异性病原(SPF)鸡胚制取鸡胚肾原细胞，用70%的酒精喷洒消毒容器，放入超净工作台中风干。将细胞容器来回倒置不少于八次以充分混合，直至细胞为均一状态。将细胞液通过六层无菌纱布以去处细胞残渣，将过滤物收集于50mL试管中。用台盼蓝计数活细胞数和总细胞数。活细胞总数>50/小格，作进一步稀释，直至小于50/小格。用完全MEM细胞培养液(90%的MEM细胞培养液+10%的胎牛血清+1倍青链霉素)调整细胞悬液的细胞数量到2.5xl06/mL,在6-孔板的每孔中加入2ml的细胞悬液，将细胞板至于37°C,含5%C02细胞培养箱中培养24小时。在相差显微镜下检验细胞生长情况，以汇合程度表示，选择汇合度〉70%的板做下一步试验。选用两个孔做细胞计数。在各孔中加入0.5ml的胰酶-EDTA溶液。37。C下培养2到4分钟或室温下5分钟。当培养完成后，加入0.5mL的完全M199培养液(90%的完全M199培养液+10%的胎牛血清+1倍青链霉素)以抑制胰酶的活性。混合直到细胞悬液达到均一状态。做细胞计数，将细胞悬液和台盼蓝按1:1混合。即将20/d的细胞悬液和20jul的台盼蓝在一个1.5mL的微型离心管中在混合，计数活细胞数。根据细胞计数，用完全MEM培养液将供体病毒稀释为MOI等于4.0和0.4(即感染性病毒数目与细胞数目的比值)，野生型感染度根据主供体/野生型的比为5:l和25:1计算。水上保存。取出细胞6-孔板。在超净工作台中无菌抽出每个孔中的培养液，用2mL预热的PBS洗涤细胞一次。将lmL的主供体病毒稀释液和lmL的野生病毒稀释液混合。将感染的细胞板在27士1。C和5±1%C02中培养60士15分钟。在培养结束时，用新吸头将病毒感染液吸去。各孔中加入2mL的、室温的、完全MEM培养液。在27土1。C和5±1%(302培养12±1和48±1小时，收集细胞上清液，完成混合感染将收集的上清液保存在-60。C以下。取上述共感染上清液样品，在37士2。C的水浴锅中融化样品，将样品在使用前在冰上保存。在超净工作台中，用完全MEM培养液进行稀释。将样品保存在冰上待用。37士2。C水浴锅中预热PBS和完全MEM细胞培养液不少于10分钟。获取含鸡胚肾原细胞的96-孔板，在超净工作台中将96—孔的鸡胚肾原细胞;f反内的用过的完全M199培养液遗弃，用200mL预热的PBS洗涤细胞，将获取的共感染上清液^f故IO倍系列稀释，取20mL的以上所制备的病毒稀释液，加入96孔的鸡胚肾原细胞板的各孔中。将细胞板放入27土rC和5±1%C02,细胞培养箱中培养。此过程允许病毒吸附于宿主细胞表面，完成感染过程的第一步。在培养细胞时，制备筛选用抗血清稀释液。用预热的完全MEM细胞培养液将适当的抗主供体病毒抗血清稀释为0.05%。在细胞感染60±15分钟后，将板内病毒液弃去。各孔加入200/xL的含抗主供体病毒抗体的完全MEM细胞培养液实现抗血清筛选的目标。将细胞板在27±1°C,5%C02下培养3到7天。在这3到7天的培养期间，每天要对细胞板的各孔液^故HA测试，以确定HA阳性孔的百分率。如果HA阳性孔数^0%,放弃该板。如果细胞板中不呈现HA阳性，将板放回，继续培养，第2天再测。对于达标板，分别收集HA+孔的上清液为疫苗种子侯选病毒，冷冻保存。将HA+侯选病毒分别接种11天的SPF鸡胚，在27.0土rC,湿度为70±5%条件下培养8±1或12±1小时。用照蛋灯检查鸡胚，将活鸡胚放入4。C水箱中，冷冻4-12小时。采集鸡胚尿清液，将收获物分别装入冷冻储藏管中，-60°C以下保存。分别取样，进行RNA抽提，具体操作参照厂家TRIZOL(上海闪晶)或RNA抽提试剂盒(Qiagen)的说明书。下边以一个样品为例进行基因型鉴定的详细说明。第一步反转录反应将提取的RNA7uL、引物Unil20.5/iL和纯化水2.5uL配成的混合物置于PCR仪，7(TC反应5分钟，4。C保存。将4ul的10mMdNTPs、4pL的5X反转录酶緩沖液、lptL的RNA酶抑制剂(RNasin)和1/iL反转录酶组成的混合液加入上述反应液中，室温下保存10-30分钟，放入PCR仪，42。C反应1.5hrs,75。C反应10min,4。C下保存。反转录的产物即cDNA。第二步PCR扩增。取40uL上步制得的cDNA样品，力口8uL的dNTPs(10mM)、10uL的10XDNA聚合酶緩冲液、的TaqDNA聚合酶，加入纯化水配得总体积为80uL的混合液，将该混合液平分为8份，各取10ul分装入8个PCIU敬型管中，将管1至管8分别标记为PB2，PB1，PA,HA，NP,NA，M,NS，按标记分别加入1.5pL的相应的引物对(见表1)。引物对的准备是先将各引物对配制成1/xg/jttL的储存液，稀释成25ng//iL的工作液，按以下PCR反应程序合成基因片断，94°C3min1个循环、94。C下1分钟，55。C下2分钟，72。C下3分钟做35个循环、4。C保存。表l引物序列型基因正向引物反向引物PB2GAAGTACACATCAGGGAGACGCCTAAGGATGTCTACCATCCPB1ATGAGAAGAAAGCAAAGTTGGCAAATGTTGGTTGCTGGACCAAGATCATTGTTTATCATPACTCAAATGTCCAAAGAAGCCATGCTCACAAAGTTTACCHlCTACTGGTCCTGTTATGTGCTAGAACACATCCAGAAGCTGH2CTCATTCTCCTGTTCACAGCGCAGATCCTGCACTGCAGAGH3GACTATCATTGCTTTGAGCTGTTGCACCTAATGTTGCCNPGAGAATGGTGCTCTCTGCCGATCGGGTTCGTTGCCNlCAACACTAATGTTGTTGCTGGAAAGCCGAAAACCCCACTGCAGATGN2GGCTCTGTCTCTCTCACCCAGGCCATGGAGCCTGTTCCMCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTTACTCCAGCTCTATGCTGACNSGACAAAGACATAATGGATCCGCTGAAACGAGAAAGTTCTTATCTCPB2CTGTTAAGGGACAATGAAGCTTTATTTCTCCTCTCACTCCTTG别PB1CATAGATGTACCCATACAGAAATCCCGGAACCAAATTGGPAAGGCCAAAAACACAATGGCAGAGTGGCCCACTTGGCATAATTHAGTACTACTCATGGTAGTAACATCCGCAAGAAACATTGTCTCTGGAGACCNPGAGTTGGACTTGACCCTTCATGGTCATCATAATCCTCTGCTGT<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>第三步DNA片段的限制性内切酶处理。取6uL的DNA扩增产物，根据基因来源，加入限制性内切酶(表2),按照以下的方式准备，PCR产物6pL、10X内切酶緩冲液lpL、限制性内切酶0.25|iL,加适量双蒸水配成总体积10uL的酶切混合液，将酶切反应混合物放入各种酶所要求的反应温度下反应至少1小时。第四步琼脂糖凝胶电泳。在酶切处理过的DNA样品中加入适量的DNA上样緩冲液，点入1-1.2%的琼脂糖凝胶，100V稳压条件下电泳50-60分钟，紫外分析仪上观察DNA谱带，根据限制性内切酶对野生型和适冷型病毒基因的选择性切割的特征图语，确定某基因是来源于主供体病毒还是野生型病毒。最后筛选出病毒PB2，PB1,PA，NP，M和NS六条基因来源于主供体，同时，HA和NA来源于野生型，这样的病毒为我们的所要筛选的种子病毒(图1、图2、图3)。表2限制性内切酶的具体种类<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>试验例1本发明减活流感全病毒疫苗的动物安全性评价试验一、受试制剂与使用试剂1、受试制剂本发明三价减活流感全病毒疫苗。规格0.5ml/支，保存条件-15°<:避光保存。2、阳性对照试剂三价野生型病毒(各野生型单价病毒购自英国NIBSC，经扩增与效价测定后，用无菌蛋清液稀释并将三种病毒液混合，使三种病毒的最终效价为106TCID5()/mL)。规格0.5ml/支。保存条件-15。C避光保存3、阴性对照试剂无菌磷酸盐缓冲液；规格0.5ml/支。二、受试动物清洁级小鼠，3-4周龄，体重12.0-18.0g,雌雄兼用，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，合格证书号0040014。所有动物均按常规饲养，自由饮水、摄食，动物詞养环境温度为18-22。C,相对湿度40-60%，良好通风。有资格参加试验的动物应该为红血球凝集试验(HA)阴性。三、试-睑方法1)动物选择与分配参加试验的动物先抽血，做红血球凝集试验测定，合格动物应为血凝试验(HA)阴性。随机选取符合条件的动物60只，分三组，分别为阴性对照组、试验组、和阳性对照组，每组20只。阴性对照组接种50ul无菌磷酸盐緩冲液(25uL/鼻孔)，试验组接种50uL受试制剂(本发明三价疫苗)，阳性对照组接种50ul三价野生型病毒混合物，三价野生性病毒混合物中每个病毒效价为106TCID5。/mL。2)本发明疫苗病毒、野生型病毒及磷酸盐缓冲液的准备与使用使用之前，本发明减活流感全病毒疫苗和三价野生型病毒必需解冻，解冻方法之一为将喷雾器握在手掌中，解冻后立即使用。另一种解冻方式是在水箱中解冻，解冻后可在2-8。C下保存，保存时间不得超过60小时。磷酸盐緩沖液在使用之前应灭菌，在4。C条件下保存不超过180天。3)搡作规程在病毒液与磷酸盐援冲液的使用过程中，将它们作为同等生物试剂对待，试验人员需要带口罩，穿无菌服，戴试验于套，以保证试验人员的安全。试验中的各组动物应有相对大的隔离空间，以防交叉感染，保证试验结果的准确性。接受动物身体固定，头部稍^f敬向上倾斜，将微型喷雾注射器的尖端塞进鼻孔内侧边缘，按压微型喷雾注射器注射杆。通常每只小鼠用量为50uL(25uL/鼻孔)。接种后每天测定小鼠体温、体重指标，对照三组动物的各指标变化情况，并在试验过程中观察咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、无力、死亡等指标。具体按表3、表4标准判断动物反应发生程度，计算反应发生率。在每个试验结束后，将动物用C02处死并销毁。表3小鼠药物反应症状<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4小鼠药物反应评价指标<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.试验结果小鼠对疫苗、无菌磷酸盐緩沖液和野生型病毒的不良反应以药物不良反应率来反映(图4)。阴性对照组的小鼠在试验观察期内无一死亡，生长状况良好，体重均有所增加，体温正常。接种本发明流感减毒活疫苗(试验组)的20只小鼠与阴性对照组比无明显差别，100%存活，全部呈正常生长，其中1只小鼠在接种疫苗后的第1天出现无力、抓鼻现象，到2天两只小鼠有体温升高现象，偶有躁动、抓鼻、打喷噢现象，呈阳性反应，但无严重的流感症状出现，这两只小鼠在第4至第5天后均恢复正常。接种野生性病毒的20只小鼠中，其中两只在接种后的第1天体温开始升高，第2天和第3天后所有小鼠出现咳嗽、流鼻弟、打喷噢、流泪、喘息等症状，流感症状表现较典型，体重明显减轻，并有一只小鼠死亡，在随后的几天中，小鼠相继死亡，死亡率达95%,到试验结束时，仅有一只阳性对照小鼠从感染中恢复，存活，呈极强阳性反应。上述试验结果表明，在本试验条件下，阴性对照组小鼠全部健康，与之相对应的阳性对照组，全部小鼠都出现不同程度的流感症状，动物死亡率达95%,与两对照组相比，本发明三价减活流感全病毒疫苗以50uL/只接种小鼠后，试验动物末出现流感症状，生长状况良好，表明本发明疫苗对动物安全。试验例2本发明减活流感全病毒疫苗的抗原性、免疫原性和动物保护性试验一、受试制剂与使用试剂1受试制剂本发明三价减活流感全病毒疫苗。规格0.5ml/支，保存条件-15。C避光保存。2、攻击试验试剂三价野生型病毒(各野生型单价病毒购自英国NIBSC,经扩增与效价测定后，用无菌蛋清液稀释并将三种病毒液混合，使三种病毒的最终效价为106TCID5()/mL)。规格0.5ml/支，保存条件-15。C避光保存。3、阴性对照试剂无菌磷酸盐缓沖液，规格0.5ml/支，保存方式避光，干燥处保存。二.受试动物清洁级小鼠，3-4周龄，体重12.0-18.0g，雌雄兼用，由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，合格证书号0040014。所有动物均按常规飼养，自由饮水、摄食，动物饲养环境温度为18-22。C，相对湿度40-60%,良好通风。有资格参加试验的动物应该为红血球凝集试验(HA)阴性。三.试〗全方法l)动物选择与分配参加试验的动物先抽血，做红血球凝集试验测定，合格动物应为血凝试验(HA)13阴性。随机选取符合条件的动物39只，分两组，阴性对照组9只(等分为3个小组)，每只接种50uL无菌磷酸盐缓沖液；试验组30只(等分为3个小组)，每只接种50uL本发明三价减活流感全病毒疫苗。21天后，每只小鼠接受50uL三价野生型病毒混合物接种进行攻击试验，病毒混合体内每种病毒效价为106TCID5o/mL。2)本发明三价流感减活疫苗病毒、野生型病毒及磷酸盐緩冲液的准备与使用之前，本发明流感减活疫苗和三价野生型病毒必需解冻，解冻方法之一为将喷雾器握在手掌中，解冻后立即使用。另一种解冻方式是在冰箱中解冻，化冻后可在2-8"下保存，保存时间不得超过60小时。磷酸盐緩冲液在使用之前应灭菌，在4。C条件下保存不超过180天。3)操作规程在病毒液与磷酸盐緩冲液的使用过程，将它们作为生物制剂对待，试验人员需要带口罩，穿无菌服，戴试验手套。适当程度的保护以保证试验人员的安全。试验中的各小组动物应有相对大的隔离空间，以防交叉感染，保证试验结果的准确性。接受动物身体固定，头部稍微向上倾斜，将微型喷雾注射器的尖端塞进鼻孔内侧边缘，按压微型喷雾注射器注射杆。通常每只小鼠用量为50uL(25uL/鼻孔)。接种后第2天到第12天，根据抗原性与免疫原性操作规程进行断尾取血，分离血清，对血清样品进行血凝抑制试验(HI)，测定血清对疫苗混合物中各病毒特异性抗体的效价；具体操作是从免疫接种后的第2天起一直到第12天，按照取样时间表取血样，每次取血对照组用3只动物(一个小组)，试验组用10只动物(一个小组)，轮流对每小组动物抽血以免引起取血过多造成的非药物影响。每只动物取血样约为100-200uL，分离血清，将血清与受体破坏酶以3:1混和，37。C处理过夜，65°C灭活30分钟，对处理过的血清作血凝抑制测定(HI)，决定血清对各单一病毒的抗体的效价，以评价疫苗的抗原性及免疫原性。免疫接种后第21天用三价野生型病毒混合物接种小鼠进行攻击试验，剂量为50uL/只106TCID5。/mL，攻击试验开始前，野生型病毒攻击后第3、5、8和第14天(即第一次免疫后第24、26、29和35天)，测定小鼠体温、体重等指标，并在试验过程中观察咳嗽、打喷噢、流鼻弟、无力、死亡等指标。具体按表3、表4标准判断攻击反应发生程度，计算攻击反应发生率。在每个试验结束后，将动物用C0214处死并销毁。5.试验结果l)抗原性与免疫原性试验前，所有小鼠对疫苗的三个病毒成份都没有特异性抗体。阴性对照组的9只小鼠抗体效价结果均为阴性，阴性表型持续整个试验过程(见图5与表5、6和7)。接种三价流感疫苗的试验组30只小鼠全部有抗体产生，抗体在接种疫苗后的第三天开始陆续产生，但效价都《，在第六到第八天达到最高64~256。之后的几天观察期间抗体效价一直维持较高水平。其中H1N1型免疫效果最好，在免疫观察的后期具有较高的抗体效价，平均约134个HI单位。H3N2和B型与H1N1相比抗体效价略低，但也有很好的免疫效果，平均抗体效价为89和46个HI。综合30只小鼠的抗体效价水十分析，存在一定个体差异其中有25只小鼠抗体效价相接近处在较高的位置，而有5只小鼠抗体效价偏低。抗体效价的检测结果汇总见表5、表6和表7。表5小鼠免疫接种后血清抗体效价检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表6小鼠免疫接种后血清抗体效价检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7小鼠免疫接种后血清抗体效价检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>对照7000000000三组800000000090000000002100000000022000000000试23000000000验248226464321286464二25842128646412812864组26161641286432128128642744212812864128128642822016168161682916486464641281286430321641281286425612864平均11739266401189247试验结果表明，本发明三价减活流感全病毒疫苗可以有效的激发动物体产生病毒特异性抗体，并有较高的抗体效价，具有有效的抗原性与免疫原性。2)动物保护性接种本发明三价疫苗后的实验组小鼠和阴性对照组的小鼠在第21天接受野生三价流感病毒的攻击，在攻击后的14天内对小鼠的体温和体重进行了测定记录(表8),试验结果见图6与图7。在攻击后的第三天阴性对照的9只小鼠全部出现打喷噢，流鼻弟的流感症状，体温均有所增加；在第四到第五天流感症状加剧有的小鼠出现呼吸困难、步态不稳、痉挛等等，体重明显减轻，体温持续高热，并行小鼠死亡，十大内小鼠全部死亡，呈极强阳性反应。接种本发明三价疫苗的实验组小鼠接受攻击后，其中有5只在第三天体温略有升高(表8),但总体观察无明显体重减轻现象。其中的2只出现流感症状，体温17分别达39.0。C和39.5。C,呈阳性反应，其后几天感冒症状逐渐消失，痊愈。表8小鼠经攻击试验后体温和体重变化情况<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3037.923.838.623.638.123.637.924.437.924.9试验结果表明，没有接受本发明疫苗的对照组小鼠在受到野生型病毒攻击的情况下，无抵抗力，该组所有动物在攻击试验初期都在不同程度上表现出流感病状，十天内阴性对照组中所有动物死亡率为100%。然而，接受疫苗的试验组动物，除了两只小鼠呈现流鼻洋、打喷嚷等轻微流感症状外，其它动物在全部试验过程中部健康、正常，无一动物死亡，保护率达93.3%,两只患病小鼠最终也康复。攻击试验综合评价见表9。表9攻击试验综合评价攻击后天凄t死亡率平均体温("C)阴'性，寸照釭L30/940.02/939.886/940.4149/9一试马全组30/3038.20/3038.280/3038.0140/3038.0试验结论上述试验结果表明，在本试验条件下，本发明流感减活全疫苗对小鼠为良好的抗原体，并在小鼠体内可激发良好的免疫原反应，通过免疫后的小鼠对野生型病毒具有明显的保护性。19权利要求1、一种减活的、适冷的、温度敏感的流感病毒疫苗重组体(CaA/Newcaledonia/20/99)，其微生物保藏号是CGMCC1538。2、一种制备权利要求1的流感病毒减活疫苗重组体的方法，包^^以下步骤将流感主供体病毒毒林和流感野生致病型病毒毒才朱混合共感染宿主细l包；筛选、克隆、鉴定，得到重组体。3、根据权利要求2，其特征在于，所述的主供体病毒毒抹选用适冷的A/AnnArbor/6/60或B/AnnArbor/1/66。4、根据权利要求2的方法，其特征在于，将主供体病毒与野生型病毒按5:1到1:50的比例混合共感染；共感染的温度为25-33°C;共感染的时间为20到60小时；共感染的剂量是每个病毒感染1-0.01细胞；感染宿主细胞为鸡胚肾原细胞。5、根据权利要求4的方法，其特征在于，将主供体病毒与野生型病毒按1:1的比例混合共感染；共感染的温度为27°C;共感染的时间为24小时；共感染的剂量是每个病毒感染1细胞。6、一种疫苗组合物，含有治疗上有效量的权利要求1的流感病毒疫苗重组体，任选的一种或多种免疫佐剂，和药学可接受的赋型剂。7、权利要求1的流感病毒疫苗重组体在制备防治流感药物中的用途。全文摘要本发明公开了一种新的减活的、适冷的、温度敏感的流感病毒疫苗重组体，其微生物保藏号是CGMCC1538。本发明以经多次逐渐降温而培养出来的一种遗传稳定、适冷的流感病毒遗传变异体作为模板，用遗传重组的方法以野生病毒的表面抗原取代该适冷病毒的表面抗原而制备得到本发明减活流感全病毒疫苗。本发明流感病毒疫苗重组体具有减活、适冷、温度敏感等特点，由其制备成的减活流感全病毒疫苗具有良好的抗原性、免疫原性和保护效力，可有效防治流感病毒。文档编号A61K39/145GK101497877SQ20081000475公开日2009年8月5日申请日期2008年1月28日优先权日2008年1月28日发明者刘贵生,李金铃,武文军,董存元申请人:河北新张药股份有限公司