专利名称：：一种生物碱类化合物及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，涉及生物碱类化合物及其制备方法，具体涉及一种具有抗胂瘤活性的化合物，和其药学上可接受的盐；本发明也涉及这一化合物的微生物发酵方法和这一化合物在制造抗肿瘤药物上的用途。
背景技术：
：肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，发病率和死亡率一直呈上升趋势，目前已成为第一位致死疾病。癌症死亡率前三位是肝癌、胃癌、肺癌，我国是世界上肝癌高发国家之一，发病率在l/万左右。肝癌迄今处于一种严重缺乏有效治疗药物的状况，由于对肝癌缺乏有效控制方法，患者的预后极差。除早期可手术患者的5年存活率达80~90%外，不能手术患者，至症状发作后的平均存活时间只有3~4个月，发展中国家全部肝癌病例的平均5年存活率仅为5%左右。此外，中、晚期肝癌临床治疗的一个棘手问题是癌痛，当患者最终开始使用吗啡类镇痛药物后，由于其严重的药物依赖性，只有通过用药剂量迅速而持续的增加，才能达到止痛的作用，而连续不断的大剂量镇痛药物使用，又加重了肝脏的负担，从而使癌症的恶性程度进一步加剧。因此，开发新的抗肿瘤类药物就显得十分紧迫与必要。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种用于治疗肿瘤疾病的新的抗肿瘤类药物A,其分子式为C7H9FN204,分子量为216，化学结构式如式(I)所示。熔点141-143°C，外观呈白色粉末，它在药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐或者有机盐。本发明涉及的化合物A的结构釆用核磁共振、红外等光谱学的方法确定'°本发明的另一个目的是提供这种抗肿瘤抗生素的发酵用菌种和制备方法。经初步测试，化合物A在体外能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，其IC5在O.9-56.mol/L范围内，具有显著的抗肿瘤活性。式i本发明的吲哚酮类化合物A是从广西省太化县都阳山坡的土壤中分离得到假浅灰链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.:2362)的发酵培养物中提取得到，制备方法的具体步骤如下(1)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.:2362)的斜面培养方法斜面培养基组成(1L):可溶性淀粉20g,NaCl0.5g,跳lg,K2HP0,0.5g,FeS040.Olg,MgS04.7H200.5g,琼脂份20g,pH7.0。28-30。C，培养7天。(2)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.:2362)的种子液培养方法种子培养基组成(IL):黄豆粉5~15g,酵母膏37g,葡萄糖10~30g,淀粉10~30g,K2HP040.1-l.Og，(NH4)2S040.1-3,0g,MgS04.7H200.1-0.5g,CaC030.1-5.0g，pH7.2。三角摇瓶装量20-60%，转速100-250转/分钟，28-32。C,培养20-48小时。(3)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.:2362)的发酵方法发酵培养基组成(1L):花生粉10-25g，酵母膏5-30g，葡萄糖0.5-30g，蛋白胨0.1—10g，(NH4)2S040.1-10g，KC10.l-3g,pH7.0。发酵罐装量20-60%，接种量3-12%,转速100-250转/分钟，28-32r:,培养5-7天。发酵结東后，发酵产物经过板框压滤机过滤后，得到菌丝体和发酵滤液两部分。(4)步骤(3)得到的菌丝体部分，(a)用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，常温下凉干；(b)菌丝体用甲醇提取数次，提取物减压浓缩得到浸膏；(c)浸膏用蒸馏水分散，用乙酸乙酯提取数次，经100-200目硅胶柱(流动相为氯仿-乙酸乙酯梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到化合物A。经本发明制备的化合物体外能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，具有显著的抗肿瘤活性。本发明所用的假浅灰链霉菌(Streptomycespseudogriseolus)Y05A-1070已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京巿朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.:2362),保藏曰为2008年1月25曰。具体实施方式实施例1化合物A的制备(1)链霉菌Y05A-1070'(CGMCCNo.:2362)的斜面培养方法斜面培养基组成(1L):可溶性淀粉20g,NaCl0.5g，跳lg,K2HP040.5g，FeS040.01g，MgS04.7H200.5g，琼脂份20g,pH7.0。28-30。C，培养7天。(2)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.:2362)的种子液培养方法种子培养基组成(IL):黄豆粉5~15g,酵母膏37g,葡萄糖10~30g,淀粉10~30g,K2,40.l-l.Og，(NH4)2S040.1-3.0g,MgS04.7H200.1-0.5g，CaC030.1-5.0g,pH7.2。三角摇瓶装量20-60°/。，转速100-250转/分钟，28-32。C,培养20-48小时。(3)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.:2362)的发酵方法发酵培养基组成(1L):花生粉10-25g,酵母膏5-30g,葡萄糖0.5-30g;,蛋白胨0.l-10g,(NH4)2S040.1-10g,KC10.1—3g，pH7.0。发酵罐装量20-60%,接种量3-12%,转速100-250转/分钟，28-32'C，培养5-7天。发酵结東后，发酵产物经过板框压滤机过滤后，得到菌丝体和发酵滤液两部分(4)步骤(3)得到的菌丝体部分，(a)用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，常温下凉干；(b)菌丝体用甲醇提取数次，提取物减压浓缩得到浸膏；(c)浸膏用蒸馏水分散，用乙酸乙酯提取数次，经100-200目硅胶柱(流动相为氯仿一乙酸乙酯梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到化合物A。化合物A的实验数据外观为白色粉末，m.p.141-143。微溶于苯、氯仿、乙醚等溶剂，溶于水、乙醇、甲醇。MSU/z):216。IRu/cm—1(KBr):1761(u丄1724(u))'1657(u丄力-腿(CDC1》5:1.31(3H,tJ=7.2Hz,-CH3),4.26(2H，q，J=7.2HZ，-COOCH广)，4.68(2H，s,-CH2N<C_9),7.32(1H，d，C-H，/=3.OHz),9.93(1H，brs,H—N<)。实施例2MTT还原法检测化合物A的抗肿瘤活性1.材料1.1四脞盐(MTT):用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4,5-dimethythiazo1z-yl)2，5-diphenyltetrazoUumbromide,SIGMA)终浓度5mg/mL,过滤除菌，分装后4。C避光保存。1.2靶细胞的制备(以A549细胞为例)从液氮罐中取出人肺癌细胞株A549细胞的冻存管，迅速置入37°C水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌搡作移入离心管中；加入全培养液(含10Vj、牛血清的RPMI1640(Gibco1BRL公司))至10mL，1000rpm离心5s，弃上清；重复以上操作一次；以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5。/C02，37°C培养；观察细胞生长情况，及时更换培养液，^^瓶。取对数生长期细胞，胰酶消化，调整细胞数至lxl05/mL;将细胞悬液加入到96孔板中，各孔加入A549细胞100nL(lxl07mL)，5%C02,37。C培养8hr。加入不同浓度B6-9(使用全培养液配制)溶液IOOyL，对照加全培养液100继续培养48hr。每孔加入MTT溶液各10nL，继续培养4hr。去除培养液，每孔加入DMS0100jiiL,轻轻振荡5-10min，使颗粒溶解。使用酶联免疫仪测定570mn下每孔OD值。计算肿瘤细胞杀伤率和抑制率，以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC5。。肺癌细胞株A549，肝癌细胞株HepG-2，胃癌细胞株HGC-27，乳癌细胞株MCF-7的试验方法同上。肿瘤细胞杀伤率°/=[(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]xl00%1.3实验结果实验结果显示化合物A均能有效抑制肺癌细胞株A549,肝癌细胞株HepG-2，胃癌细胞株HGC-27，乳癌细胞株MCF-7的生长。化合物A对这些癌细胞的ICs。值(urnol/L)见表1。表lB6-9的体外细胞毒试验结果(IC5。pimol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1.一种生物碱类化合物，其特征在于该化合物的结构式如(A)所示其分子式为C7H9FN2O4，分子量为216，外观为白色结晶。2.根据权利要求l所述的一种生物碱类化合物，其特征在于还包括该化合物在在药学上可接受的盐是硫酸盐、盐酸盐及有机酸盐。3.—种如权利要求1所述的生物碱类化合物的制备方法，其特征在于该方法包括培养能够产生所述抗生素的链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.2362)的培养条件，以及从发酵液中回收所得到的抗生素，其具体步骤(1)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.2362)的斜面培养方法斜面培养基组成(1L):可溶性淀粉20g，NaCl0.5g，跳lg，K2HP040.5gFeS040.Olg，MgS04.7H200.5g，琼脂份20g，pH7.0。28-30°C，培养7天；(2)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.2362)的种子液培养方法种子培养基组成(1L):黄豆粉5~15g，酵母膏3-7g，葡萄糖10~30g，淀粉10~30g，K2HP040.l-l.Og,(NH4)2S040.1-3.0g,MgS04.7H200.l-O.5g,CaC030.1-5.0g,pH7.2。三角摇瓶装量20-60%，转速100-250转/分钟，28-32°C，培养20-48小时；(3)链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.2362)的发酵方法发酵培养基组成(1L):花生粉10-25g，酵母膏5-30g，葡萄糖0.5-30g，蛋白胨0.l-10g，(NH4)2S040.l-10g,KC10.l-3g，pH7.0。发酵罐装量20-60%，接种量3-12%，转速IOO-250转/分钟，28-32'C，培养5-7天。发酵结束后，发酵产物经过板框压滤机过滤后，得到菌丝体和发酵滤液两部分；(4)步骤(3)得到的菌丝体部分，(a)用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，常温下凉干；(b)菌丝体用甲醇提取数次，提取物减压浓缩得到浸膏；(c)浸膏用蒸馏水分散，用乙酸乙酯提取数次，经100-200目硅胶柱(流动相为氯仿一乙酸乙酯梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到化合物A。4.生物碱类化合物(A)在制备抑制肿瘤的药物中的应用。如下:全文摘要本发明属于医药
技术领域：
，公开了一种生物碱类化合物及其制备方法。该化合物是从我国广西省太化县都阳山坡的土壤中筛选得到的链霉菌Y05A-1070(CGMCCNo.2362)经菌种培养、发酵、发酵液的过滤、萃取、吸附洗脱、冷冻干燥等步骤得到，纯度达到95％以上。该化合物及其药学上可接受的盐是硫酸盐、盐酸盐及有机酸盐能显著抑制A549细胞、HGC-2细胞、HGC-27细胞，MCF-7细胞，提示其具有抗肿瘤的活性，可用于开发抗肿瘤类药物。文档编号A61P35/00GK101538247SQ200810010678公开日2009年9月23日申请日期2008年3月17日优先权日2008年3月17日发明者吴春福,张怡轩申请人:沈阳药科大学