专利名称：：“海普诺”在制备治疗2型糖尿病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药，具体地说是一种海洋天然活性化合物"海普诺"的制备方法、药理活性及药学用途。该化合物及其衍生物作为胰岛素增敏剂，可用于治疗胰岛素抵抗类2型糖尿病。
背景技术：
：糖尿病(DiabetesMellitus,DM)是一种慢性的代谢分泌内分泌疾病，据2007年国际糖尿病联盟(IDF)资料，全世界成年糖尿病患者人数约2.46亿，其中2型糖尿病(T2DM)患者占总糖尿病患者90。/。以上。到2025年，全世界的糖尿病患者人数预计将达到3.8亿。目前用于治疗T2DM的药物主要有双胍类、磺脲类、(x-糖苷酶抑制剂和噻唑烷二酮类等，由于它们多是针对病症而不是针对病因分子耙点药物的设计，因而存在各种弊端。因此，市场急需安全有效、价格合理且能长期安全服用的降糖药物。胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键因素，酪氨酸磷酸化是胰岛素效应实现的重要环节，受PTK和PTP共同调节。PTK在胰岛素信号传递中的作用很早即被人们关注，但直到最近，人们才逐渐认识到PTP在糖尿病发病中的重要性。Gold-stein研究表明，胰岛素抵抗患者的胰岛素耙组织中PTP1B和LARPTP表达增加，且能阻断胰岛素受体酪氨酸的激活以及胰岛素的信号转导；Elchebly等发现，PTP1B基因剔除鼠可提高胰岛素的敏感性，且增敏效应具有组织特异性。研究表明，胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键因素，PTP1B在胰岛素信号转导中的负调控作用，现已证实它在T2DM的发生、发展过程中起重要作用，可能成为T2DM的病因新耙点。国际上对PTP1B抑制剂的研究不多，主要有以下几类(1)、肽类含磷酸化酪氨酸残基(pTyr)的肽类底物与PTP1B有较高的亲和性，但其化学和生物稳定性差；(2)、萘醌类Naphthnoquinone:通过修饰PTPase的活性位点来抑制酶的活性；(3)、噻唑烷二酮类Azolidinediones:通过增加耙器官的胰岛素敏感性来改善血糖的控制，主要包括ciglitazone、troglitazone和rosiglitazone，但由于严重的肝脏毒性，ciglitazone已从市场撤出；(4)、Benzo[b]naphthol[2，3-d]furans禾口thiophenes类以benzbromarone为先导化合物进行设计合i^的系列Benzo[b]naphthol[2,3-d]furans和thiophenes类化合物，在小鼠体内表现出良好的降血糖活性，但要最终成为治疗糖尿病药物还需要克服很多障碍，如电负性高、细胞膜通透性差以及选择专一性差等，以上因素都使这些抑制剂的成药性降低；目前尚未见溴酚类化合物作为PTP1B抑制剂抗糖尿病方面的研究报道
发明内容本发明目的在于提供一种新型的胰岛素增敏剂-"海普诺"，该化合物及其衍生物通过抑制蛋白酪氨酸磷脂酶IB的活性，增强胰岛素受体敏感性，可用于治疗胰岛素抵抗类2型糖尿病。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下1、"海普诺"的制备与结构鉴定风干的松节藻i/zo&me/acw7/enwV^样品粉碎后用95%乙醇提取，提取液减压浓縮；浓縮物用蒸馏水悬浮后，用乙酸乙酯萃取，减压浓縮。乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱，直至二者体积比为1:1，改用氯仿-甲醇梯度洗脱，最后用95%乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得14个部分L,Lw。L9部分[氯仿甲醇=4:l]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，重结晶可得纯化合物，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2'，3'-二溴-4',5'-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1,2—二苯酚(中文)；3-bromo-4-[2',3'-dibromo-4'，5'-dihydroxypheny]methyl-5-(ethoxymethyl)1,2-benzenediol(英文)。2二蛋白酪氨酸磷脂酶1B抑制活性测定采用分子生物学方法，构建基因重组的hGST-PTPlB-BL21Co//人类PTP1B工程菌，以GST亲和层析柱纯化hGST-PTPlB蛋白质，利用含有磷酸的多肽para-NitrophenylPhosphate(pNPP)被PTP1B酶解掉一个磷酸后的产物pNP在波长405nm处有吸收峰的原理，以PTPlB作用后生成pNP的量表示PTP1B酶活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况，计算化合物PTP1B酶活力抑制率及IC50。3、急性毒性观察试验采用Hom法对"海普诺"进行毒性观察试验。4、高脂饮食-链脲佐菌素诱导的T2DM大鼠体内降糖试验(1)造模wistar大白鼠适应性饲养1周后分组，实验组饲以高脂饲料，对照组饲以正常饮食，连续喂养8周。实验组禁食24小时后，按照35mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素，诱导糖尿病模型，以血糖大于16.7mmol/L确定为糖尿病模型组。(2)治疗采用随机分组法，将成模大鼠分为模型组，高、中、低剂量组及阳性对照组(文迪雅)；分别得到正常组(l组)、模型组(糖尿病不干预组)(2组)、海普诺低剂量组(3组)、海普诺中剂量组(4组)、海普诺高剂量组(5组)、阳性对照文迪雅组(6组)。1组、2组等体积羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液灌胃，36组分别以海普诺低、中、高剂量和文迪雅灌胃(临床用量的剂量换算，drat=dhumanxRrat/Rhumanx(Whuman/Wrat)1/3，Rrat=90;Rhuman=100)。(3)指标检测每7天测定各组实验大鼠血糖，持续8周。实验结果表明，来源于红藻的卣代化合物"海普诺"(HPN)不仅具有新颖的碳骨架结构，而且能够显著抑制PTP1B酶活性，阻断胰岛素受体与胰4岛素受体底物的去磷酸化，从而增强胰岛素敏感性，达到控制血糖的目的，是一种针对病因靶点并能有效防治胰岛素抵抗T2DM的化合物；此外，毒性试验结果也表明HPN属于低毒化合物，为HPN的临床研究提供了实验基础。与现有临床药物相比，本发明具有作用靶点新颖，安全性高，可长期服用以及价格便宜等明显优势；作为一种新型、高效低毒的胰岛素增敏剂，"海普诺"能够针对病因靶点，并对胰岛素抵抗类T2DM具有良好的防治功效。具体实施例方式实施例1"海普诺"的制备与结构鉴定松节藻(干重20kg)粉碎后用95。/。乙醇100L提取，提取液减压浓縮；浓縮物用10L蒸馏水悬浮后，用等体积乙酸乙酯萃取，减压浓縮。乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮(100:01:1)梯度洗脱，直至二者体积比为1:1(石油醚于石油醚和丙酮混合洗脱液中的体积浓度沿梯度从100%-50%变化)，改用氯仿-甲醇(100:00100)梯度洗脱(氯仿于氯仿-甲醇混合洗脱液中的体积浓度沿梯度从100%-0%变化)，最后用95%乙醇洗脱，薄层色谱检査，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得14个部"Lw。L9部分[氯仿甲醇体积比=4:l]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，重结晶可得纯化合物95mg，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2'，3'-二溴-4',5'-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1,2—二苯酚(简称海普诺),化学结构式如下CH2OEt上述化合物具有以下理化特性。浅黄色针晶(DMSO),熔点mp197-199°C;红外光谱IR(KBr)v應3527,3415，2875，1610,1585,1568，1478,1469，1406,1348,1302,1271,1097,1076,1003，955，872，808cm";低分辨质谱EIMSw/z(%)530,528,526，524[M]+(4,12，12，4),484(11),482(34)，480(34)，478(12),467(9),465(28)，463(31),461(10),403(30),401(58),399(31),384(18),357(17),355(17)，353(7),322(100),320(97),393(15),391(15)，24256)，213(33),184(24)，161(32),160(35)，139(25),121(51)，58(80);高分辨质i普HREIMSw/z523.8466(计算值C16H1579Br305,523.8470);核磁共振NMR(acetowe-^，500MHz)S7.00(1H，s,H-4),4.13(2H,s,H画7),3.40(2H，q，J=7.0Hz,H画9),1.06(3H,t，J=7.0Hz，H-IO)，6.08(1H,s,H-6');核磁共振13CNMR(acetowe-《，125MHz)5144.1(s,C曙l)，142.8(s,C-2),114.4(s,C匿3),128.8(s,C-4),130.5(s,C-5)，114.3(d,C-6),38.8(t,C-7)，70.7(t，C-8),65.5(t,C-9)，14.7(q，C-IO)，131.8(s，C-l')，115.6(s,C-2'),112.9(s，C-3')，142.8(s,C-4'),144.7(s，C-5')，114.3(d，C画6')。本发明所述化合物不仅包括从自然界中发现的天然产物，也包括其它来源如化学合成、生物合成等手段得到的合成产物。实施例2蛋白酪氨酸磷脂酶1B抑制活性测定将待测化合物(3-溴-4-[2'，3'-二溴陽4',5'-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1,2-二苯徵用0]^80配制成不同浓度的供试品溶液，取2pL供试品溶液分别加入到标准的测活体系(50mMTris-HCl,PH6.5,2mMpNPP,2%DMSO,30nMhGST-PTPlB)，阴性对照DMSO，阳性对照正钒酸钠(2pM)，反应温度为30°C，动态测定波长为405nm处的光吸收，时间3min，按如下公式计算化合物PTP1B酶活力抑制率及IC5Q(LOGIT法)。抑制率=(实验组A值-阴性对照组A值)/(对照组A值-阴性对照组A)xlOOX，结果见表l。表l蛋白质酪氨酸磷脂酶1B抑制率(％)及ICsoTable1Inhibition(%)andIC50ofPTP1B项目抑制率(％)ic50浓度200|aM/mL20|aM/mL2nM/mL0.2pM/mL(xM/mL海普诺109.298.989.364.70.83试验结果表明化合物对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶IB具有良好的抑制作用。实施例3急性毒性观察试验20只昆明小鼠，随机分成4组，每组雌性3只，雄性2只，分笼，适应性饲养3d;第四天给药前禁食16h，饮水不限，分别以5000mg/kg，500mg/kg及50mg/kg剂量灌胃ig，观察24h，小鼠死亡数为0。实施例4高脂饮食-链脲佐菌素诱导的T2DM大鼠体内降糖试验(1)实验动物雄性Wistar大鼠(250士20g)，青岛市实验动物中心提供，饲养于青岛大学医学院附属医院SPF级试验动物中心。正常黑夜交替，自由饮食进水。所有动物适应性饲养1周，待进一步研究。将大鼠按体重随机分为6组，1'组饲以普通饮食，2'-5'组饲以高脂饮食(碳水化合物20%,蛋白质21%,脂肪59%)，时间8周。每次测定血糖和注射链脲佐菌素前禁食12小时，但可自由饮水。(2)链脲佐菌素诱导糖尿病模型(STZ-DM)2'-5'组禁食24小时后，按照35mg/kg腹腔注射链脲佐菌(streptozotocin，STZ，购自Sigma公司)诱导糖尿病模型。STZ使用前即时配置，溶解于0.1mmol/L柠檬酸钠缓冲液，PH4.5。注射STZ后48小时测空腹血糖(FBG)，以FBG血糖高于16.7mmol/L确立为糖尿病造模成功。(3)分组与治疗造模成功大鼠按照FBG随机分为5组(2-5组)，每组10只。(正常对照组(l组)、阴性对照组(2组)灌服等体积羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液；治疗组(3、4禾f!5组)分别按照5、10和20mg/kg剂量灌服海普诺，溶媒为羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液。阳性对照组(6组)按照LOmg/kg剂量灌服马来酸罗格列酮(文迪雅)。1组正常对照组(非糖尿病，不治疗)2组糖尿病大鼠阴性对照组(糖尿病，不治疗)3组糖尿病大鼠海普诺5mg/kg剂量组4组糖尿病大鼠海普诺10mg/kg剂量组5组糖尿病大鼠海普诺20mg/kg剂量组6组糖尿病大鼠阳性对照组(罗格列酮1.0mg/kg)药物溶液或溶媒以注射器灌胃，每天一次，共计56天；期间各组大鼠均饲以普通饲料，自由饮食进水。(4)血样采集与生理指标测定在药物治疗的第0、7、14、21、28、35、42、49和56天，于大鼠禁食12小时后，尾静脉取血，用血糖仪(OnetouchUltra,美国)测定FBG，结果见表2。表2海普诺对大鼠血糖的影响(n=10)Table2EffectofHPNonserumglucoseindiabeticmice(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表2可见，与模型组比较，海普诺低、中、高剂量组对链脲佐菌素所致的糖尿病小鼠血糖升高具有明显的抑制作用，具有较好的降血糖治疗作用o该化合物及衍生物通过抑制蛋白酪氨酸磷脂酶IB的活性，增强胰岛素受体敏感性，对胰岛素抵抗类2型糖尿病具有良好的治疗作用。权利要求1.“海普诺”在制备治疗2型糖尿病药物中的应用，其特征在于所述“海普诺”的化学结构式如下其中苯环的6，7和2′位碳所连接的基团为氢；8位碳与乙氧基相接；化学名称中文为3-溴-4-[2′，3′-二溴-4′，5′-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚；英文为3-bromo-4-[2′，3′-dibromo-4′，5′-dihydroxypheny]methyl-5-(ethoxymethyl)1，2-benzenediol；具有PTP1B酶抑制活性的海洋天然产物“海普诺”，能够通过负调控胰岛素信号转导通路，增强胰岛素受体敏感性，使胰岛素生理功能正常发挥，进而调控血糖，达到对胰岛素抵抗类2型糖尿病的治疗功效。2.按照权利要求1所述应用，其特征在于所述胰岛素增敏剂"海普诺"还可为化合物"海普诺"的药物学上可接受的盐、酯或醚等化学等价物的任一单体或混合物用于制备治疗和预防2型糖尿病的医学药物中。3.按照权利要求l所述应用，其特征在于所述"海普诺"及其的药物学上可接受的盐、酯或醚可与医药上可接受的药物载体混合制成片剂、胶囊剂、口服液、栓剂或注射剂。4.按照权利要求l所述应用，其特征在于所述的胰岛素增敏剂"海普诺"，其来源不仅为天然产物，或采用化学合成或生物合成方法的合成产物。全文摘要本发明涉及一种新型的胰岛素增敏剂“海普诺”及其药学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物，所述“海普诺”的化学结构式如图，其中苯环的6，7和2′位碳所连接的基团为氢；8位碳与乙氧基相接；化学名称中文为3-溴-4-[2′，3′-二溴-4′，5′-二羟基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚；英文为3-bromo-4-[2′，3′-dibromo-4′，5′-dihydroxypheny]methyl-5-(ethoxymethyl)1，2-benzenediol；该化合物及衍生物通过抑制蛋白酪氨酸磷脂酶1B的活性，增强胰岛素受体敏感性，对胰岛素抵抗类2型糖尿病具有良好的治疗作用。文档编号A61P3/00GK101559048SQ20081001529公开日2009年10月21日申请日期2008年4月18日优先权日2008年4月18日发明者史大永,敬李,晓范,凤许,郭书举,韩丽君申请人:中国科学院海洋研究所