专利名称：：一种噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物及其作为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物及其作为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用，特别是2-(芳基亚甲基)-5-芳基-7-甲基-3-氧代-2,3二氢-5H-噻唑射3,2-a]嘧啶类化合物与作为Bd-2家族蛋白拮抗剂的应用。该类化合物能够抑制Bcl-2家族蛋白成员Bcl-XL与天然底物多肽(BMBH3多肽)的结合，可作为Bcl-2家族蛋白的小分子抑制剂用于抑制其抗凋亡活性，并有望开发成为一类新型的抗肿瘤药物。
背景技术：
：细胞凋亡(某些情况下又可称为细胞程序性死亡)是一种去除衰老细胞或异常细胞的正常死亡机制，该机制的紊乱与多种疾病的发生有直接的关系。自上世纪90年代以来，人们逐渐发现肿瘤的发生是细胞的增殖与凋亡失衡所致(Okad^H.;Mak,T.W.及ev.Omcer2004，《592-603)。研究表明在多种肿瘤细胞中凋亡机制被抑制，肿瘤细胞因而得以过度增生；另外，凋亡机制被抑制也使得肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性增强(Igney，F.H.;Krammer,P.H.及ev.Omcer2002,2,277-288)。因此，设法恢复肿瘤细胞中的凋亡机制成为当今抗肿瘤药物设计的—条新思路，在国际上得到了广泛重视(Reed，J.C.JV抓Jev.Dn^D^cov.2002，J，111-121;Andersen，M.H.;Becker,J.C.;Straten，R淑及ev.Zfecov.2005,《399-409.)。在与细胞凋亡有关的药物靶点中，Bcl-2(B-celllymphoma2)相关蛋白是较早得到研究的一类。该类蛋白可分为三个家族Bcl-2家族，Bax家族和BH3-only家族。其中，Bcl-2家族成员(Bcl-2，Bc1-Xl，Mcl-l，Bcl-w等)起着抗细胞凋亡的作用，后两个家族的成员起促细胞凋亡的作用。目前人们认为Bcl-2相关蛋白主要是在细胞凋亡的线粒体途径中发挥作用。其中经活化的Bax家族蛋白(Bax、Bak等)可以结合在线粒体膜上使得细胞色素C从线粒体中释放出来从而最终导致凋亡的发生；而Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白则能够与Bax和Bak相结合，使其不能发挥作用；另外，一些BH3-only家族成员(Bim，Bad，Bid，Bik等)又能够与Bcl-2家族成员相结合，抑制其抗凋亡作用。因此，Bcl-2相关蛋白之间的平衡与否对细胞凋亡起着至关重要的调控作用。研究表明，多种类型的肿瘤细胞至少过量表达其中一种Bcl-2家族蛋白，但是在正常细胞中这些蛋白的表达水平则相对较低。使用有机小分子拮抗这些蛋白的功能有望恢复肿瘤细胞中的凋亡机制，从而达到消除肿瘤的目的(Huang，Z.O/at.i>Mg￡fecov.Deve/.2000，3,565-574;Cory，S.;Adams，J.M.及ev.C朋cer2002,2，647-656)。有机小分子对Bcl-2家族蛋白的抑制活性通常用荧光偏振(FluorescencePolarization,简称FP)方法检测(Zhang,H.;Ni画er，P.;Rosenberg,S.H.;Ng,S.C.;Joseph,M.j"a/.2002，307，70-75)。该方法是基于分子在均相溶液中的自由旋转，当一个荧光标记的分子被一个平面的极化光所激发时，其发射光可发射到一个固定的平面，而该发射光的极化水平与分子的旋转速度成反比。荧光标记的小分子在均相体系里处于高速旋转状态，发射光表现为除极化，得到一个较低的极化值，而非荧光标记的大分子旋转速度远远低于荧光标记的小分子，当小分子和大分子发生特异性结合后，复合物的旋转速度与大分子的旋转速度相比变化不明显，而远远低于荧光标记小分子的旋转速度，极化值显著升高。当该方法用于检测小分子抑制Bcl-2家族蛋白与天然底物多肽的结合时，在荧光标记多肽与蛋白共存的体系中加入待测化合物，如果化合物也能够与蛋白特异性结合，则会与荧光标记多肽发生竞争从而抑制其与蛋白的结合，进而导致荧光极化值降低。因此通过检测荧光极化值的变化情况就可以测得化合物的活性。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种新的噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物。本发明的第二个目的是提供一种噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物用于制备抑制Bcl-XL与天然底物多肽结合的小分子抑制剂和抗肿瘤药物的应用。本发明所提供的一种新的噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物具有如下的结构式式中R为(Z)-l-苄基-lH卩引哚-3-亚甲基；R2为4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3,4-二乙酰氧基苯基或2,5-二甲氧基苯基；R3为苯胺基或乙氧基。限制条件是当R3为苯胺基时，&为(Z)-l-苄基-lH卩引哚-3-亚甲基，R2为4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3,4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；当R3为乙氧基时，R！为(Z)-l-节基-lH吲哚-3-亚甲基，R2为4-乙基苯基。本发明的用于制备抑制Bc1-xl与天然底物多肽结合的小分子抑制剂和抗肿瘤药物的噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物没有上述的限制，具体地说是具有如下的结构式的2-(芳基亚甲基)-5-芳基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氢-5H-噻唑射3,2-a]嘧啶类化合物式中Ri为(Z)-l-苄基-lH吲哚-3-亚甲基、(Z)-l-(2-氟苄基)-lH吲哚-3-亚甲基、(E)-l-乙氧羰基甲基-lH吲哚-3-亚甲基、2-吲哚啉酮、(Z)-卩比啶-4-亚甲基、(￡)-5-甲基呋喃-2-亚甲基、(￡)-3-甲基苯基亚甲基、(巧-3-氟苯基亚甲基、(Z)-2，3-二氯苯基亚甲基或(Z)-2,5-二甲氧基苯基亚甲基；R2为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3,4-二乙酰氧基苯基、2,4-二甲氧基苯基、2，5-二甲氧基苯基或噻吩-2-基；R3为苯胺基或乙氧基。没有前述的限制条件。可以进一步描述为如下的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式VI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式VII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式VII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式VIIu实验表明，上述噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物为抑制Bcl-2家族蛋白成员Bcl-x^与天然底物多肽(BidBH3多肽)相结合的有效成分，基于荧光偏振(FP)原理的活性测试表明该类化合物具有微摩尔级的活性。FP方法检测此类化合物抑制Bc1-xl与N端用5-FAM标记的BidBH3多肽(序列为5-FAM-QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)结合的活性如下1)(2)-2-((1-(2-氟苄基)-111-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代-^苯基-5-(噻吩-2-基)-2，3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIa)的抑制常数&为0.53^M;2)(Z)-2-((l-节基1H-卩引哚)-3-亚甲基)-5-(3-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIb)的抑制常数&为1.8^M;3)(Z)陽5-(2,4-二甲氧基苯基)-7-甲基陽3陽氧代-2-(2-氧代吲哚啉-3-亚基)-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIc)的抑制常数&为24.5^M;4)0-2-((1-(2-氟苄基)-111-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-氟苯基)-7-甲基-3-氧代-]^苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIId)的抑制常数&为2.4^M;5)(E)-2-(3-((5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-6-(苯基氨甲酰基)-2,3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-2-亚基)甲基)-lH-吲哚)-l-乙酸乙酯(式VIIe)在10^M下的抑制率为44.1%;6)(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(2，5-二甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代->^-苯基-2,3-二氢-511-噻唑并[3，2-&]嘧啶-6-酰胺(式VIIf)在10下的抑制率为44.1%;7)(￡)-7-甲基-2-((5-甲基呋喃)-2-亚甲基)-3-氧代-乂5-二苯基-2，3-二氢-511-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIg)在10nM下的抑制率为23.4。/o;8)-5-(4-氯苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2-(吡啶-4-亚甲基)-2,3-二氢-511-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIh)在10pM下的抑制率为18.7%;9)(Z)-5-(3-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2-(吡啶-4-亚甲基)-2,3-二氢-511-噻唑并[3,2-3]嘧啶-6-酰胺(式VIIi)在10nM下的抑制率为13.7%;10)(E)-2-(3-氟苯基亚甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIj)在10下的抑制率为6.9%;11)(Z)-2-(2,3-二氯苯基亚甲基)-5-(4-氟苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-511-噻唑并[3,2-3]嘧啶-6-酰胺(式VIIk)在10nM下的抑制率为4.6%;12)(Z)-2-(2，5-二甲氧基苯基亚甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧淀-6-甲酸乙酯(式VII1)在10tiM下的抑制率为2.5%;13)(E)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-2-(3-甲基苯基亚甲基)-3-氧代-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIm)在10pM下的抑制率为1.6%;14)02-((1-苄基-111-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-^苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIn)的抑制常数&为11.6^M;;15)(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-溴苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基陽2,3-二氢-5H-噻挫并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIo)的抑制常数&为3.8^M;;16)(Z)-2-((1-苄基-111-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2,3-二氢-511-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIp)的抑制常数&为1.4pM;17)(Z)-2-((1-苄基-111-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基)苯基-7-甲基-3-氧代-2,3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIq)的抑制常数&为1.218)(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代—5-苯基-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIr)的抑制常数&为4.8^M;19)(Z)-2-((1-节基-11^引哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基陽2，3國二氢-5H-噻唑射3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIs)的抑制常数&为11.2^M;20)(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIt)的抑制常数&为2.6一21)(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代隱N-苯基-2,3隱二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶陽6-酰胺(式VIIu)的抑制常数&为4.5^M;本发明的噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物还可以用于制备抗肿瘤药物。实验表明，噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞显示出抑制活性，是一类具有广泛应用价值的抗肿瘤先导化合物。其中化合物VIIb对MDA-MB-231的CC5o值(50%CytotoxicConcentration,半数细胞毒浓度)为5.45^M;化合物VIIc对MCF-7的CCso值为24.56pM。本发明的有益效果在于所涉及的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物是一类结构新颖的Bcl-2家族蛋白抑制剂，具有微摩尔级的分子水平抑制活性，而且对肿瘤细胞具有较强的细胞毒活性，因此作为先导化合物具有良好的潜力和应用前景，有望开发成为靶向Bcl-2家族蛋白的抗肿瘤药物。图1-图12为噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物(Vna~VIIa)的荧光偏振测活曲线图13-图14为噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物的MTT测活曲线其中，图13为噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物VIIb对MDA-MB-231细胞系细胞毒性测定(CC5o=5.45^M);图14为噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物VIIc对MCF-7细胞系细胞毒性测定(CC50=24.56pM)。具体实施例方式实施例1:(Z)-2-((l-苄基-lH-H引哚)-3-亚甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-23-二氢-5H-噻唑并[3,2-a嘧啶-6-酰胺(式VIIt)的制备一、4-(3，4-二羟基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVd)的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>将1.772g(lOmmol)的乙酰乙酰苯胺，761.2mg(lO腿ol)的硫脲，1.381g(lO腿ol)的3，4-二羟基苯甲醛混合，加入25ml乙醇，再加入250mg(1.45mmol)的对甲基苯磺酸，回流反应24小时，直接抽滤，得灰色粉末状固体式IVd(1.767g，产率50%)。经检测，结构正确，检测结果如下mp162_166。C;IR(KBr):v3195,1568,1479,1444，1384，1332，1286，1236,1194,1152,1118,932，879,752,692,506cm-1;&NMR(300MHz,DMSO—^):59.87(s,1H)，9.64(s,1H)，9.31(s,1H),8.94(s，1H),8.87(s,1H),7.54(d,/=7.5Hz,2H),7.25(t，/=7.8Hz,2H),7.00(t，《/=7.5Hz，1H),6.65(d，/=8.1Hz，2H)，6.50(dd，/=8.4Hz,/=2.1Hz，1H)，5.24(d,/=2.4Hz,1H),2.04(s，3H);13CNMR(100MHz,CD3OD):5175.4，167.9，146.7，146.5,139.2,135.6，135.0，129.7，125.5,121.8,119.2，116.4,114.9，109.9，57.6，16.7;MS(ESI)(一356(M+Pf),378(M+Na+);HRMS(ESI)(附/z):CalcdforC18H18N303S(M+H+):356.1069,Found:356.1069.二、(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(3，4-二乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIt)的合成IV_y__yil<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>将0.118g(0.33mmol)的4-(3,4-二羟基苯基)-6-甲基-^苯基-2-硫代-1,2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVd)，0.032g(0.34mmol)的氯乙酸，0.078g(0.33mmol)的l-节基-lHB引哚-3-甲醛，0.200g(2.44mmo1)的醋酸钠，1.0mL(17.47mmol)的醋酸和0.5mL(5.30mmo1)的醋酸酐搅拌混合，换氩气三次，油浴80度反应过夜，得红褐色溶液，TLC显示原料已经反应完毕，加冰水10mL，得黄褐色悬浊液，抽滤，水洗，乙醇重结晶得化合物式Vllt(深黄色结晶52mg，产率22%)。经检观!l，结构正确，检测结果如下mp247—254°C;IR(KBr):v3277，3059,2924，1771，1706,1641，1598，1568，1519,1502，1467，1440，1385，1370,1335，1257,1214，1186,1162，1111,1013，892,743，701cm";力NMR(300MHz,DMSO—^):(510.06(s,1H),8.12(s,1H),8.07(s，1H)，7.93(d,J=7.5Hz,1H)，7.56(t,/=6.9Hz,3H),7.37—7.16(m,12H),7.07(t,/=7.5Hz,1H),6.26(s,1H),5.62(s，2H)，2.24((!，/=1.5Hz，6H)，2.14(s,3H);13C画R(100MHz,CDC13):(5168.4，168.1,165.5,165.2，154.4,142.6,142.5,142.0,137.9,137.4,136.7,135.7，130.4，129.2，129.1，129.0，129.0，128.5，128.1,127.3，126.8,126.4,125.2,124.8,124.0，123.9,123.0，122.0,120.5，119.2,114.2，113.6，111.7,110.6，55.5，51.1，21.5,20.9,20.7;MS(ESI)(w妙697(M+f),719(M+Na+),735(M+K+);HRMS(MALDI)(w/z):CalcdforC40H33N4O6S(M+H+):697.2121，Found:697.2115.实施例2:式VIIf，VIII，VIIn，VIIo，VIIp，VIIq，VIIr，VIIs和VIIu的制备一、式IVa-c,IVe-i的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在与实施例i中合成IVd类似的条件下，从相应的P二羰基化合物式Ia-c，Ie-i，不同取代的醛式IIa-c，IIe-i和硫脲式III得到化合物式IVa-c，IVe-i:4-苯基-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l，2，3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVa);4-(4-乙基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l，2，3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVb);4-(2，5-二甲氧基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l，2,3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVc);4-(4-甲氧基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVe);4-(4-羟基苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2,3，4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVf);4-(4-溴苯基)-6-甲基-N-苯基-2-硫代-l,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(式IVg);4-苯基-6-甲基-2-硫代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酸乙酯(式IVh);4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酸乙酯(式IVi)。二、式VIIf，VIII，VIIn，VIIo，VIIp，VIIq，VIIr，VIIs和VIIu的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>式VII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>产率\(%)(Z)-l-节基-lHn引哚-3-亚甲基(Z)-2,5-二甲氧基苯基亚甲基(Z)-l-节基-lH口引哚-3-亚甲基(Z)-l-节基-lHB引哚-3-亚甲基(Z)-l-节基-lHn引哚-3-亚甲基(Z)-1陽节基-1HB引哚-3-亚甲基(Z)-1-节基陽1Hn引哚-3-亚甲基(Z)-1-节基隱1H2,5-二甲氧苯胺基2,5-二甲氧吲哚-3-基2,5-二甲氧4-甲氧基苯4-甲氧基苯4-溴苯基4-溴苯基苯胺基苯胺基乙氧基4-乙基苯基乙氧基4-乙基苯基苯胺基4-乙基苯基苯胺基4-乙基苯基l-节基-lH吲哚-3-基l-卡基-lH口引哚-3-基1-苄基-1H吲哚-3-基i-节基-m卩引哚-3-基l-节基-lH口引哚-3-基l-节基-lH2072241917712uB引哚-3-亚甲基(z)-i-节基-m口引哚-3-亚甲基4-乙酰氧基苯胺基4-羟基苯基H引哚-3-基i-节基-mB引哚-3-基29在与实施例1中合成VIIt类似的条件下，从相应的Biginelli产物式IVa陽c，IVe-i和相应的醛式Vf，VI，Vn-s，Vu得到化合物VIIf，VIII，VIIn-s，Iu:(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(2，5-二甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-511-噻唑并[3，2-&]嘧啶-6-酰胺(式VIIf);(Z)-2-(2，5-二甲氧基苯基亚甲基》7-甲基-3-氧代-5-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VII1);(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-甲氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3誦二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIn);(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-溴苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIo);(Z)-2-((l-节基-lH-H引哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代-5-苯基-2,3-二氢-511-噻唑并[3,2-&]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIp);(Z)-2-((l-节基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基)苯基-7-甲基-3-氧代-2，3-二氢-5H-噻唑并[3,2-a]嘧啶-6-甲酸乙酯(式VIIq);(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-7-甲基-3-氧代—5-苯基-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIr);(Z)-2-((l-苄基-lH-吲哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2,3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIs);(Z)-2-((l-节基-lH』引哚)-3-亚甲基)-5-(4-乙酰氧基苯基)-7-甲基-3-氧代-N-苯基-2，3-二氢-5H-噻唑并[3，2-a]嘧啶-6-酰胺(式VIIu)。实施例3:噻唑并[3^2-al嘧啶类化合物对Bcl-化抑制作用的荧光偏振检测谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的Bc1-xl(GST-Bc1-xl)蛋白在大肠杆菌BL21中表达，经谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱亲和层析的方法分离纯化；荧光标记多肽为N端用5-FAM标记的BidBH3多肽(序列为5-FAM陽QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR);化合物VIIf和VII1，VIIn—VIIu用上述方法制备，其余化合物购自SPECS公司。一、化合物式VlIa-VIId，VIIn-VIIu的抑制常数测定在测试缓冲液(1x磷酸盐缓冲溶液，含0.02%(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-xL的lxPBS溶液和化合物不同浓度的DMSO溶液，混匀后室温避光孵育30min;再加入荧光标记多肽的lxPBS溶液(终浓度为10nM)，使各溶液的总体积均为200pL，混匀后室温避光孵育20min;将上述溶液及校正溶液l(1nMfluorescein)和校正溶难2(10mMNaOH)各取60pL转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nM为激发波长，535nM为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP，测得各浓度下的荧光偏振值(mP)并计算抑制率，拟合得到半数抑制浓度/C5Q，抑制常数使用如下公式求得&=50/a丄]50/^l+[尸]0/^l+l)(MM):达到半数抑制时游离的抑制剂的浓度；[丄]50:达到半数抑制时游离的荧光标记多肽的浓度；[户]o:没有抑制时游离的蛋白浓度；蛋白与荧光标记多肽的解离常数)。结果见表1-表12:表l:化合物VIIa的荧光偏振检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7:化合物VIIp的荧光偏振检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>二、化合物VIIe-VIIm的抑制活性检测在测试缓冲液(lx磷酸盐缓冲溶液，含0.02%(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-x^的lxPBS溶液，分别加入DMSO(2pL)和待测化合物的DMSO溶液(终浓度为10pM)，混匀后室温避光孵育30min;再加入荧光标记多肽的lxPBS溶液(终浓度为10nM)，使各溶液的总体积均为200pL，混匀后室温避光孵育20min;将上述溶液及校正溶液l(1nMfluorescein)和校正溶液2(10mMNaOH)各取60pL转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nM为激发波长，535nM为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP，测得各化合物的荧光偏振值(mP)。抑制率—对照(GST-Bcl-xL/DMSO/荧光标记多肽)mP值-待测化合物mP值°—对照(GST-Bcl-xL/DMSO/荧光标记多肽)mP值-荧光标记多肽mP值X结果见表13:表13:化合物VIIe-VIIm的荧光偏振检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例5:噻唑并3J-a嘧啶类化合物对人乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒性检测一、化合物VIIb-VIIe在10下对MCF-7细胞抑制率测定6X104/mlMCF-7细胞悬液100[iL每孔，孵育一天后，与不同的待测化合物溶液混合(终浓度10pM)，37°C，5。/。C02培养4天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶标仪测定OD值，计算细胞抑制率。细胞抑制率％=阴性对照组OD值-化合物组OD值阴性对照组OD值xl00%表8:化合物VIIb-VIIe在10下对MCF-7细胞抑制率测定<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>二、化合物VIIc对MCF-7的细胞毒性检测6xlO"mlMCF-7细胞悬液100jaL每孔，孵育一天后，加入混合了不同浓度化合物的DMEM培养液，37°C，5%0)2培养4天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nmTECANGENiosPro多功能酶标仪测定OD值，计算0:5()值(50%CytotoxicConcentration)为24.56^M。细胞存活率％=实验孔OD值-空白孔OD值对照孑LOD值-空白孔OD值表9:化合物VIIc对MCF-7细胞毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>权利要求1、一类噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物，其特征是具有如下的结构式式中R1为(Z)-1-苄基-1H吲哚-3-亚甲基；R2为4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；R3为苯胺基或乙氧基。限制条件是当R3为苯胺基时，R1为(Z)-1-苄基-1H吲哚-3-亚甲基，R2为4-溴苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基或2，5-二甲氧基苯基；当R3为乙氧基时，R1为(Z)-1-苄基-1H吲哚-3-亚甲基，R2为4-乙基苯基。2、一类噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物用于制备Bcl-2家族蛋白的小分子抑制剂或抗肿瘤药物的应用，所述的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物具有如下的结构式式中为(Z)-l-苄基-lHB引哚-3-亚甲基、(Z)-l-(2-氟卡基)-lH喷哚-3-亚甲基、(J5)-l-乙氧羰基甲基-lHU引哚-3-亚甲基、2-吲哚啉酮、(2)-吡啶-4-亚甲基、(￡)-5-甲基呋喃-2-亚甲基、(￡)-3-甲基苯基亚甲基、(￡)-3-氟苯基亚甲基、(Z)-2,3-二氯苯基亚甲基或(Z)-2,5-二甲氧基苯基亚甲基；R2为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-乙酰氧基苯基、3，4-二乙酰氧基苯基、2，4-二甲氧基苯基、2，5-二甲氧基苯基或噻吩-2-基；R3为苯胺基或乙氧基。3、如权利要求2所述的一类噻唑并[3,2-a]嘧啶类化合物的应用，其特征是所述的Bcl-2家族蛋白是Bc1-xl、Bcl-2或Mcl-l。全文摘要本发明公开了一类噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物及其制备Bcl-2家族蛋白的小分子抑制剂和抗肿瘤药物的应用。本发明的噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物具有如上的结构式该噻唑并[3，2-a]嘧啶类化合物具有微摩尔级的抑制Bcl-x<sub>L</sub>与天然底物多肽(BidBH3多肽)结合的活性，可作为Bcl-2家族蛋白的小分子抑制剂，抑制其抗凋亡活性；而且该类化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞显示出一定的抑制活性，有望开发成为靶向Bcl-2家族蛋白的抗肿瘤药物。文档编号A61P35/00GK101348495SQ20081004190公开日2009年1月21日申请日期2008年8月20日优先权日2008年8月20日发明者飚俞,周炳城,张兴龙,朱翠侠,勋李,李雯雯,王任小,石志敏申请人:中国科学院上海有机化学研究所