一种聚甲基丙烯酸酯及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：一种聚甲基丙烯酸酯及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因治疗用还原性阳离子聚甲基丙烯酸酯载体、其制备方法，本发明还涉及此聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物的构建中的应用及此聚甲基丙烯酸酯在基因治疗方面的应用。
背景技术：
：非病毒载体中的阳离子聚合物载体具有优异的DNA结合能力，具有无免疫原性、装载容量大、容易制备等优点，便于进行靶向性及生物实用性改性，成为基因载体研究中的一个重要研究对象。文献中报道了很多阳离子聚合物载体，如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺、聚氨基酯、壳聚糖等。阳离子聚合物基因载体的阳离子特性对转染效率具有双重影响第一，阳离子聚合物能够提供与DNA自组装的动力，有利于保护DNA免受降解；能够压縮DNA成为比自由DNA体积小的复合物颗粒，有利于进入细胞；通过排斥作用形成稳定的基因纳米复合物；基因纳米复合物与细胞膜之间产生静电吸附，促进基因纳米复合物的内吞。第二，纳米基因复合物的阳离子特性与体液负电组分结合，不利于体内转运；静电组装的纳米复合物阻止DNA释放，不利于编码基因表达；复合物的正电荷也破坏细胞的膜结构，产生溶血毒性。目前改善阳离子聚合物基因载体转染特性的研究领域包括(l)引入亲水基团，提高基因纳米复合物的水溶性；(2)引入响应细胞内环境的可降解基团，研究可降解基团与不可降解聚合物的N/P(聚合物中氮原子数(N)与基因中负电荷数(P)的比例)关系，得封促进DNA縮合及在细胞内可降解的聚合物；(3)引入内涵体破坏性基团或成分如氯喹，膜破坏性肽及聚丙基丙烯酸；(4)引入靶向基团，提高复合物受体介导的内吞；(5)引入赋予阳离子聚合物以脂质特性的基团或成分，增强与细胞膜的结合能力，促进复合物从内涵体中逃逸；(6)引入潜在酸性基团或直接引入阴离子成分，中和载体的正电荷，减弱载体与基因的相互作用，促进DNA的释放；(7)引入不同类型的氨基(如三级胺、咪唑基团或季铵盐)，提高阳离子特性、水溶性以及破环内涵体的能力；(8)阳离子聚合物中引入对氧化还原敏感的二硫键，能够避免细胞或组织中各种酸性补体和酶的降解，在亚细胞还原空间选择性的高效导入，并对各类核酸有缓释性，有利于转染核酸的长期稳定表达。文献[l]用流行性感冒病毒提取的膜破坏性縮氨酸共价连接各种聚甲基丙烯酸酯(pDMAEMA,pDAMA和可降解的pHPMA-DMAE)，并能够维持此类縮氨酸破坏内涵体膜的性质，加入偶合剂^琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)以增加复合物的转染效率。聚縮氨酸浓缩DNA特性用动态光散射和电位测定表明粒度为100—250nm，电位为+15to—20mV。实验结果显示连接縮氨酸的聚甲基丙烯酸酯/DNA复合物单一聚甲基丙烯酸酯更高效的转染C0S-7细胞活性。文献[2]报道了聚(2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯)(PDMAEMA)是一种水溶性的阳离子聚合物，它通过静电作用能够与DNA黏附，作为基因传输试剂。在聚合物/质粒为2时，正电荷复合物的尺寸约0.2)am。PDMAEMA质粒为3-5(w/w)时达到最佳转染，转染效率为3-6%，且PDMAEMA的毒性低。动态光散射研究表明，高分子量PDMAEMA(M300kDa)能有效浓缩质粒DNA(粒度0.15-0.20)am),低分子量PDMAEMA/质粒复合物的粒度为0,5-1.0(im。2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)与AA-乙烯基-吡咯烷酮(NVP)共聚物也可作为转染试剂。与DMAEMA单聚物相比，54mol%NVP共聚物能够提高转染效率并降低毒性。文献[3]报道了pDMAEMA/质粒复合物的传染效率和毒性的关系，研究了不同分子量的聚(2-(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(pDMAEMA)与pCMV-LacZ质粒构成的复合物对C0S-7和0VCAR-3细胞系的转染。对比研究了p(DMAEMA)/质粒、聚(L一赖氨酸)和DEAE右旋糖苷)/质粒复合物的转染效率，聚合物/质粒比例为聚乙烯(L一赖氨酸)5/1，p(DMAEMA)6/1-13/1和DEAE右旋糖苷50/1-200/1时，转染效率最高，细胞存活率为40-70%。在相同物理化学条件下，p(DMAEMA)/质粒基因复合物的转染效率比DEAE右旋糖苷/质粒复合物高两倍，比聚乙烯(L一赖氨酸)/质粒基因复合物高八倍，表明转染效率与物质结构有关。p(DMAEMA)分子量〉300kDa时转染C0S-7andOVCAR-3细胞的效率更高。动态光散射表明高分子量p(DMAEMA)能有效压縮DNA，复合物粒度为0.17-0.21)am。相反，低分子量的p(DMAEMA)/质粒基因复合物的粒度约为1.0pm。文献[4]报道了聚(2-甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯)容易通过胞吞转染细胞(pDMAEMA)，pDMAEMA毒性可以导致细胞死亡的溶菌酶裂解。结果表明(i):pDMAEMA具有高毒性，引起细胞坏死，(ii)通过流动相胞吞进行细胞内在化，(iii)尽管pDMAEMA影响新的内涵体、溶酶体的形态，但是，它不能够在物理上阻止释放基因到细胞质中。文献[5]报道了使用可逆加成-断裂链迁移(RAFT)聚合反应制备了a，o二巯基聚2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)。通过a，ffl-二巯基的氧化得到骨架中含有二硫键的还原性聚2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯(rPDMAEMA)。rPDMAEMA的DNA复合物用动态和静态光散射表征，与不含二硫键的PDMAEMA的DNA复合物相比，显示低结构密度和低DNA含量。评价了体外rPDMAEMA-DNA复合物的转染和毒性，rPDMAEMA在平面细胞系中毒性很小。B16F10细胞和六个胰腺癌细胞系的转染活性试验表明rPDMAEMA复合物具有很好的转染活性。该文献报道的产物仅仅是结构可控的线性聚合物，研究了二硫键交联的rPDMAEMA的转染和细胞毒性，没有研究端巯基寡聚物的细胞转染和细胞毒性，研究了荧光素酶对rPDMAEMA/质粒基因复合物报告基因表达比聚甲基丙烯酸酯(PDMAEMA)高3-4倍转染活性。文献[6]用不同交联剂将低分子量的寡聚胺(d他iobis-succinimidylproprionate,dimethyldithiobis-propionamidate,andhexanedioldiacrylate)交联寡聚得到可溶性聚阳离子。寡聚胺和交联剂的种类影响生物物理特性，如DNA粘结，溶血性、内涵体膜活性、转染效率和基因载体的活性。研究了基于二硫键还原断裂的聚合物降解或酯水解，寡聚乙烯基亚胺(800Da)基聚合物具有最高基因转染效率。文献[7]报道了含有二硫键的生物还原性聚(氨基胺)(SS-PAAs),伯胺与二硫键连接的双丙烯酰胱胺通过Michael聚加成得到SS-PAAs。SS-PAA在生理条件下(pH7.4,150mMPBS，37GQ稳定，在模拟细胞内还原环境的2.5mMDTT溶液中快速降解(pH7.4，[R-SH])5mM，37GC)。SS-PAAs有效浓縮DNA成纳米颗粒(<200nm)和正电性(〉+20mV)复合物，动力光散射和琼脂糖凝胶试验表明，该纳米颗粒在中性条件下稳定而在还原性环境中迅速破坏。在pH7.4-5.1时SS-PAAs复合物的缓冲能力高于聚乙烯亚胺(pEI),并迅速从细胞内涵体中逃逸。体外SS-PAAs转染C0S-7细胞的效率比支化pEI高，在有血清时，孵育时间从lh增大到4h，基因表达显著提高。XTT试验显示SS-PAAs和它的复合物在高转染活性时毒性很低。表明生物还原性SS-PAAs具有高潜力和非毒性聚合物基因载体。文献[8]报道了聚(氨基乙烯基亚胺)，一种新的含有多重二硫键的縮氨酸聚合物(SS-PAEI)，将质粒DNA(pDNA)输送到细胞后能够降解并及时释放基因。双丙烯胱酰胺与三种乙烯基胺单体通过Michael加成得到三种SS-PAEI即，乙二胺(EDA)，二乙烯基三胺(DETA)，三乙烯基四胺(TETA)。用'HNMR、凝胶色谱(GPC)、酸碱滴定和液-质联用色谱(LC-MS)分别测定了每个SS-PAEI的结构、分子量、缓冲能力和分散系数。聚复合物(聚合物/pDNA)的物理化学特性用凝胶电泳，粒度仪和电位仪表征，复合物粒径小于200nm，表面正电位32mV。SS-PAEIs的体外基因转染特性用鼠NIH3T3细胞，牛动脉BAEC细胞和鼠动脉A7R5细胞评价。SS-PAEIs比聚乙烯亚胺(25KD)的基因表达高20%,并且毒性低。现有技术中提及的聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺、聚氨基酯、壳聚糖和聚甲基丙烯酸酯等大多数是线状聚合物和取代支链为非可控的聚合物。
发明内容本发明的目的在于提供一种高细胞转染率、低细胞毒性的还原性聚甲基丙烯酸酯本发明的另一个目的在于提供前述聚甲基丙烯酸酯的其制备方法。本发明的另一个目的在于提供此聚合物在纳米基因传递载体的构建中的应用。本发明的目的还在于提供该还原性聚甲基丙烯酸酯在基因治疗方面的应用。本发明所提供技术内容如下，(l)两种新的RAFT试剂一1,3,5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基)苯和1,3，5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基)苯；(2)两种新聚合物一l,3,5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯端聚-(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TEX-PDMAEMA)和1，3,5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基》苯端聚(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TTP-PDMAEMA)的制备；(3)—种三端巯基聚合物聚[1，3，5.三端巯基(2-丙基苯基-2-(二甲氨基)乙基)]甲基丙烯酸酯](TT-PDMAEMA);(4)—种新的二硫键交联的还原性聚合物(TrPDMAEMA);(5)两类新的基因纳米复合物构建一TT-PDMAEMA/质粒基因纳米复合物TrPDMAEMA/基因纳米复合物方法。试验表明，这两种聚合物能够有效浓縮质粒基因构成纳米复合物，转染HEK293T细胞和Hella细胞的效率在30%以上，毒性试验表明该物质毒性低，细胞存活率大于80%。三端巯基聚合物一TT-PDMAEMA及其二硫键交联的还原性聚合物一TrPDMAEMA的分子结构式如下TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的数均摩尔质量(M。)和重均摩尔质量(Mw)聚分散系数(PDI,Mw/Mn)用凝胶色谱(GPC)表征，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为流动相，流动速率为1.0mL/min，温度35。C。表1是本发明提供的基因传递载体的特征为，TT-PDMAEMA的分子量(Mn)在3500—4500g/mol,Mw/Mn在1.01-1.25;TrPDMAEMA的分子量(Mn)在16500-35700g/mol，Mw/M。在2.5-4.5，对[H+]缓冲容量在2.4-3.9pmol/mg。表1阳离子聚合物的摩尔质量和缓冲容量:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由于TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA都含有2-(二甲氨基乙基)支链片段，因此它们都具有结合缓冲溶液中质子的能力，具有质子海绵的特性，都能够压缩质粒基因成为纳米，粒度在80-150nm之间，该特性会引起纳米复合物带正电性，易于结合带负电性的细胞膜，促进细胞的胞吞作用。TT-PDMAEMA分子骨架中含有巯基，TrPDMAEMA分子骨架中含有体外稳定、体内具有可逆性氧化还原性的二硫键。表2是本发明提供的TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的基因纳米复合物物理化学特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*根据d-3Mw/(4pNARcj3)计算**估计的每个复合物的DNA分子平均数本发明提供的TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA基因传递载体通过以下方法实现1.TT-PDMAEMA的合成(1)1,3,5-三异丙基苯RAFT试剂的两种合成方法1，3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯的合成在四氯化碳作溶剂中加入l,3，5-三异丙基苯，N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰催化剂，回流，过滤，饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸镁干燥，去除溶剂，得到黄色油状液体。在氯仿溶剂中加入上述黄色油状液体，滴加苯硫代黄酰溴化镁，回流，硅胶柱分离，得到l，3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙萄)苯。'H画R(CDC13):1.74,6.82,7.313CNMR(CDC13):12.7.9,129.5，130.5，141.9,218.2，30.8，48.8,121.8合成路线图如下1,3,5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基))苯的合成在四氯化碳溶剂中加入1,3,5-三异丙基苯，N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰催化剂，回流。经过滤、饱和碳酸氢钠洗涤和无水硫酸镁干燥，去除溶，得到黄色油状液体。在四氢呋喃溶剂中加入黄色油状液体和乙基黄原酸钾，经回流、过滤、硅胶柱分离和去除溶剂，得到1,3,5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基))苯。!H丽R(CDC13):1.11,3.57,1.74,6.8213CNMR(CDC13):13.5，60.5,172.0，30.8,45.5，148.1,121.3合成路线图如下(2)2-二甲氨基-甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的RAFT聚合在四氢呋喃溶剂中加入DMAEMA、AIBN(偶氮二异丁腈)引发剂，1,3,5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯，充分去氧，真空密封，60°C水浴中反应。得到新物质l,3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯端聚-(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TEX-PDMAEMA),加入过量己烷沉淀、分离产物。聚合物用^NMR表征(Varianspectrometer,400MHz)，D4-甲醇和D-氯仿为溶剂。采用同样制备方法，用1，3,5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙萄)苯反应物代替1,3,5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯，可以得到l,3，5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基))苯端聚(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯(TTP-PDMAEMA)。!HNMR(CDCI3):1.11,3,57,1.69,2.52,1.39,7.12，2.27,2.64，4.18。'HNMR(CDCl3):7.3,1.69，2.52，1.39,7.12,2.27，2.64,4.18。13CNMR(CDC13):13.5,60.5,172.0,45.5,22.2,52.4,29.4，29.3,118.8,146.3,41.2，58.2,66.1,174.5。"CNMR(CDC13):130.5,127.9,129.5,218.2,48.8，22.2,52.4,29.4,146.3，118.8,41.2,58.2:66.1,174.5。合成路线图如下(3)TT-PDMAEMA的合成TEX-PDMAEMA溶解在四氢呋喃溶液中，加入数滴过硫酸铵溶液，充氮气30min后，加入正丁胺，在氮气保护下搅拌。反应混合物加入过量己烷沉淀、过滤。采用同样方法，用TTP-PDMAEMA代替TEX-PDMAEMA氨解后，也可以制备TT-PDMAEMAo^NMR(CDCl3):1.5,1.69，2.15,1.39，7.12,2.27，2.64，4.1813CNMR(CDC13):24.9，55.1,28.9，29.4，146.3,118.8,41.2,58.2,65.7,174.52.还原性TrPDMAEMA的制备釆用两种方法方法l:二甲基亚砜(DMSO)加入到TT-PDMAEMA的去离子水溶液中，搅拌。除去水后，TrPDMAEMA从DMSO沉淀，干燥后得到TrPDMAEMA。方法2:在溶解TEX-PDMAEMA的甲醇溶液中加入二甲基亚砜(DMSO)和正丁胺，在室温条件下，该混合物溶液在氧气气氛中搅拌13-15天，然后蒸馏除去甲醇，将剩余混合物溶液溶解在四氢呋喃中，加入10倍过量(体积比)的己垸溶剂中沉淀、过滤，并干燥得到TrPDMAEMA同方法2，用TTP-PDMAEMA代替TEX-PDMAEMA也可以得到TrPDMAEMA。TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的合成路线图如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>本发明从TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA的合成路线确认，TEX-PDMAEMA、TTP-PDMAEMA和TT-PDMAEMA是合成TrPDMAEMA的中间体，TrPDMAEMA是TT-PDMAEMA进一步氧化得到的最终产物。上述中间体和产物的共同特点是1,3,5-三苯基超支化聚(2-(二甲氨基)乙基》甲基丙烯酸酯，不同点是TEX-PDMAEMA、TTP-PDMAEMA和TT-PDMAEMA的末端取代基团各异，而TrPDMAEMA则是通过TT-PDMAEMA的末端巯基进一步交联的产物。同时将TrPDMAEMA和TT-PDMAEMA的细胞转染和细胞毒性试验果进行分别阐述。3.TT-PDMAEMA/质粒DNA或TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的构建体系1:TT-PDMAEMA溶解在醋酸钠缓冲溶液(pH=4.0)中，将该缓冲溶液与质粒基因按一定比例(聚合物中氮原子数(N)与基因中负电荷数(P)的比例范围是0.75-4)混合，温浴，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。采用相同方法，在醋酸钠缓冲溶液中构建TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物体系2:TT-PDMAEMA溶解在磷酸钠缓冲溶液(pH=7.2)中，将高分子缓冲溶液与质粒基因按一定比例(聚合物中氮原子数(N)与基因中负电荷数(P)的比例范围是0.75-4)混合，温浴，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。采用相同方法，在磷酸钠缓冲溶液中构建TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物。取上述两种溶液少量，去离子水透析，用扫描电镜观察纳米复合物的形貌。显示纳米复合物的粒度在80-150nm之间，；电位研究显示基因纳米复合物带正电性，易于结合带负电性的细胞膜，促进细胞的胞吞作用。4.TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在十二垸基硫酸钠和氯化钠溶液中的稳定性TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对盐溶液的稳定性用凝胶电泳试验证明。对比研究裸质粒DNA、TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的ln/。十二烷基硫酸钠(SDS)、TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的水溶液、TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的0.5M氯化钠溶液、TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1M氯化钠溶液以及TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1.5M氯化钠溶液。图3显示TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在大于1M氯化钠溶液或1%十二烷基硫酸钠溶液中稳定性差。5.TT-PDMAEMA/质粒DNA或TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的细胞转染和细胞毒性(1)用细胞绿色荧光蛋白表达试验研究细胞转染本发明使用Hela细胞和HEK293T细胞的绿色荧光蛋白表达定量研究转染效果。TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物溶液加入到平面培养的细胞中，转染时间为4h。然后更换新鲜培养基，继续培养24h，在荧光显微镜下计数细胞绿色荧光蛋白表达。TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物溶液加入到平面培养的细胞中，转染时间为4h。然后更换新鲜培养基，继续培养24h，在荧光显微镜下计数细胞绿色荧光蛋白表达。(2)细胞毒性试验在96空板中分别加入TT-PDMAEMA或TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物磷酸钠缓冲溶液(PBS)，pH=7.2,浓度范围是10-60ng/ml，孵育24h，除去培养介质，加入新鲜培养基和MTT溶液，通过酶标仪检测Hela细胞和HEK293T细胞的有效性，与空白细胞对照，计算细胞存活率。在96空板中分别加入TrPDMAEMA和TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物磷酸钠缓冲溶液(PBS)，浓度范围是10-60吗/ml，孵育24h，除去培养介质，加入新鲜培养基和MTT溶液，通过酶标仪检测Hela细胞和HEK293T细胞的有效性，与空白细胞对照，计算细胞存活率。试验表明，这两种聚合物能够有效浓縮质粒基因构成纳米复合物，转染HEK293T细胞和Hella细胞的效率在30。/o以上，毒性试验表明该物质毒性低，细胞存活率大于80%。本发明没有采用技术背景中的各种阳离子聚合物通过修饰来提高转染和降低毒性方法，也没有采用线性结构特点，而是合成具有超支化和类似树枝结构的端巯基TT-PDMAEMA和含有二硫键结构的TrPDMAEMA,具体讲，本发明产物在苯环的1，3，5-三个位置生成结构可控的超支化的端巯基聚合物，通过二硫键交联得到的产物更是类似树枝状的超支链聚合物，形成了与现有技术报道的聚合物具有完全不同的分子量、[H+]缓冲能力的聚合物。此外，本发明还研究了TT-PDMAEMA/质粒基因复合物和TrPDMAEMA/质粒基因复合物的绿色荧光蛋白表达，通过直接转染的细胞数，定量评价对细胞的转染效率，并试验二者在生物学方面的应用，试验发现端巯基产物的转染效率仅仅比二硫键交联的超支化产物的稍低，也没有明显的细胞毒性。本发明所述的超支化和类似树枝结构的还原性阳离子聚甲基丙烯酸酯载体及其二硫键交联产物具有如下具体有益效果1.TT-PDMAEMA和TrPDMAEMA溶解在pH值4.0醋酸钠缓冲溶液或pH值7.2磷酸盐缓冲溶液中，带正电性，分子骨架中的巯基或二硫键易与负电性的细胞膜结合，促进细胞胞吞的能力。2.TT-PDMAEMA/质粒DNA或TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在上述两种缓冲溶液中分散性好、结合基因能力强，转染到细胞之后，还原性二硫键能够在细胞内选择性断裂，阻止细胞内溶酶体破坏基因的能力，有利于基因的释放。3.TT-PDMAEMA/质粒DNA或TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物能够高效转染肿瘤细胞和正常细胞，粒径分布为80-150nm，当浓度达到100吗/ml时没有显著细胞毒性。4.TT-PDMAEMA/质粒DNA或TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在0.5MNaCl溶液中24h内稳定。图1:30|ag/mlTrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对HEK293T细胞的体外转染后显示的绿色荧光蛋白表达。(A)pH:4.0醋酸钠缓冲溶液，(B)pH^7.2磷酸钠缓冲溶液。图2:30pg/mlTTPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对HEK293T细胞的体外转染后显示的绿色荧光蛋白表达。(A)pH-4.0醋酸钠缓冲溶液，(B)pH二7.2磷酸钠缓冲溶液图3:TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物凝胶电泳1是裸质粒DNA;2是TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物+ln/。十二垸基硫酸钠(SDS);3是TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的水溶液；4是TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的0.5M氯化钠溶液；5是TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1M氯化钠溶液；6是TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1.5M氯化钠溶液。具体实施例方式实例1:1，3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯的合成在500ml圆底烧瓶中加入100ml四氯化碳，O.lmoll，3，5-三异丙基苯，0.45mol的N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、20mg过氧化苯甲酰催化剂，回流48h，过滤，饱和碳酸氢钠洗涤三次，无水硫酸镁干燥，蒸馏除去溶剂，得到黄色油状液体，产率85%。将黄色油状液体加入到100ml氯仿溶剂中，加入0.45md的硫代苯磺酰溴化镁，回流48h，柱色谱分离，蒸馏除去溶剂，得到1,3,5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯。实例2:1，3，5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基))苯的合成在500ml圆底烧瓶中加入100ml四氯化碳，O.lmoll,3，5-三异丙基苯，0.45molN-溴代琥珀酰亚胺、20mg过氧化苯甲酰催化剂，回流48h，过滤，饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸馏除去溶剂，得到黄色油状液体，产率80%。将黄色油状液体加入到100ml氯仿溶剂中，加入乙基黄原酸钠，回流48h，柱色谱分离，蒸馏除去溶剂，得到1,3,5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基》苯。实例3:TEX-PDMAEMA的合成在5ml圆底烧瓶中加入DMAEMA(lg)，偶氮二异丁腈(4mg)，1,3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯(80mg)和2ml四氢呋喃，充分去氧，真空密封，放置到60°C水浴中48h。得到l，3，5-端三磺酸酯基聚合物一TEX-PDMAEMA，加入过量己垸沉淀、分离产物。聚合物用&NMR表征，D4-甲醇和D-氯仿为溶剂。实例4:TTP—PDMAEMA的合成在10ml圆底烧瓶中加入DMAEMA(lg),偶氮二异丁腈(4mg)，1,3,5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基))苯(80mg)和2ml四氢呋喃，充分去氧，真空密封，放置到60°C水浴中48h。得到1，3，5-端三磺酸酯基聚合物一TTP-PDMAEMA,加入过量己垸沉淀、分离产物。聚合物用iHNMR表征，D4-甲醇和D-氯仿为溶剂。实例5:TT-PDMAEMA的合成在100ml圆底烧瓶中加入TTP-PDMAEMA(lg)，8mL四氢呋喃，待TTP-PDMAEMA完全溶解后，充氮气30min以便除去氧气。然后上述体系中滴加3-4滴过饱和过硫酸铵水溶液和0.6mL正丁胺，在氮气保护下搅拌5h。反应混合物加入到10倍过量的己垸中，沉淀、过滤，得到TT-PDMAEMA。实例6:还原性TrPDMAEMA的制备方法1在10ml圆底烧瓶中，将0.2mL二甲基亚砜(DMSO)加入到含有0.5gTT-PDMAEMA的去离子水溶液中，搅拌14天。除去水，从DMSO沉淀，干燥后得到TrPDMAEMA。实例7:还原性TrPDMAEMA的制备方法2在10ml圆底烧瓶中，将0.2mLDMSO和0.2mL正丁胺加入到TEX-PDMAEMA甲醇溶液中，在氧气气氛中室温搅拌14天，除去甲醇溶剂，TrPDMAEMA溶解在四氢呋喃中，加入过量己烷沉淀得到。实例8:还原性TrPDMAEMA的制备方法3在10ml圆底烧瓶中，将0.2mLDMSO和0.2mL正丁胺加入到TTP-PDMAEMA甲醇溶液中，在氧气气氛中室温搅拌14天，除去甲醇溶剂，TrPDMAEMA溶解在四氢呋喃中，加入过量己垸沉淀得到。实例9:醋酸钠缓冲溶液中构建TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为0.75混合，在5(^C水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例10:醋酸钠缓冲溶液中构建TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为1.2混合，在50GC水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例11:醋酸钠缓冲溶液中构建TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为2混合，在50QC水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例12:醋酸钠缓冲溶液中构建TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为4混合，在50GC水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例13:醋酸钠缓冲溶液中构建TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TrPDMAEMA与质粒基因按N:P比为0.75混合，在50QC水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例14:醋酸钠缓冲溶液中构建TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TrPDMAEMA与质粒基因按N:P比为1.2混合，在50QC水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例15:醋酸钠缓冲溶液中构建TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TrPDMAEMA与质粒基因按N:P比为2混合，在50GC水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例16:醋酸钠缓冲溶液中构建TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在醋酸钠缓冲溶液中TrPDMAEMA与质粒基因按N:P比为4混合，在50GC水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例17:磷酸钠(PBS)缓冲溶液中构建TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在磷酸钠(PBS)缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为0.75混合，在5(^C水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例18:磷酸钠(PBS)缓冲溶液中构建TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在磷酸钠(PBS)缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为1.2混合，在5()Gc水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例19:磷酸钠(PBS)缓冲溶液中构建TT—PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在磷酸钠(PBS)缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为2混合，在5(^C水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例20:磷酸钠(PBS)缓冲溶液中构建TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物将溶解在磷酸钠(PBS)缓冲溶液中TT-PDMAEMA与质粒基因按N:P比为4混合，在5(^C水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。实例21:TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的体外转染所有的转染实验在24孔板完成，转染实验用HEK293T细胞。每孔中种植50,000细胞，孵育24h后，TT—PDMAEMA与质粒DNA的N:P比例为4，质量浓度为3(Vg/ml。首先用150nL10。/。胎牛血清(FBS)的TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物孵育4h后，更换新鲜培养基继续孵育24h，在荧光显微镜下计数转染效率约30%(如图2)。实例22:TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的体外转染所有的转染实验在24孔板完成，转染实验用HEK293T细胞。每孔中种植50,000细胞，孵育24h，TrPDMAEMA与质粒DNA的N:P比例为4，质量浓度为30叫/ml。用150^L10。/。胎牛血清(FBS)的TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物孵育4h，再加入新鲜培养基继续孵育24h，在荧光显微镜下计数转染效率约40%(如图l)。实例23:TT-PDMAEMA对HEK293T细胞的毒性两万个HEK293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT—PDMAEM浓度依次为10，20，30和50(^g/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100pL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20MTT。在37°C，C02培养箱中细胞孵育4h，加入100pL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，细胞存活率均在78%以上。实例24:TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对HEK293T细胞的毒性两万个HEK293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100|aLDMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的浓度依次为10，20，30和50|ag/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100pL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20pLMTT。在37。C，C02培养箱中细胞孵育4h，加入100pL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，细胞存活率均在82%以上。实例25:TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对Hela细胞的毒性两万个Hela细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的浓度依次为10，20,30和50吗/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100新鲜DMEM代替，每孔分别加入20pLMTT。在37。C，C02培养箱中细胞孵育4h，加入lOOiaL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，细胞存活率均在82%以上。实例26:TT-PDMAEMA对Hela细胞的毒性两万个Hela细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100pLDMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的浓度依次为10，20，30和50ng/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100pL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20MTT。在37。C，C02培养箱中细胞孵育4h，加入100nL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，细胞存活率均在82%以上。实例27:TrPDMAEMA对HEK293T细胞的毒性两万个HEK293T细胞种植在96孔板中，孵育24h,在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA浓度依次为10，20，30和100吗/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100pL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20pLMTT。在37。C，C02培养箱中细胞孵育4h,加入100nL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，每孔的细胞存活率均在85%以上。实例28:TrPDMAEMA对Hela细胞的毒性两万个Hela细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA浓度依次为10，20,30和100吗/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100新鲜DMEM代替，每孔分别加入20MTT。在37°C，C02培养箱中细胞孵育4h，加入100pL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，每孔的细胞存活率均在85%以上。实例29:TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对HEK293T细胞的毒性两万个HEK293T细胞种植在％孔板中，孵育24h，100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的浓度依次为10，20，30和100吗/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100nL新鲜DMEM代替，每孔加入20MTT。在37°C，C02培养箱中细胞孵育4h，每孔分别加入100nL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，每孔细胞存活率均在90%以上。实例30:TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对Hela细胞的毒性两万个Hela细胞种植在96孔板中，孵育24h，100DMEM(Dulbecco，smodifiedeagle'smedium)/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中含TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的浓度依次为10，20，30和100吗/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100pL新鲜DMEM代替，每孔加入20nLMTT。在37。C，C02培养箱中细胞孵育4h，每孔分别加入lOOpL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，每孔细胞存活率均在90%以上。实例31.TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在十二烷基硫酸钠和氯化钠溶液中的稳定性50ng/ml的TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对盐溶液的稳定性用凝胶电泳试验证明。凝胶电泳条孔中依次加入裸质粒DNA;TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1%十二垸基硫酸钠；TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的水溶液；TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的0.5M氯化钠溶液；TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1M氯化钠溶液以及TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1.5M氯化钠溶液，显示TT-PDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在0.5M氯化钠溶液中24h稳定。实例32.TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在十二烷基硫酸钠和氯化钠溶液中的稳定性50ng/ml的TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对盐溶液的稳定性用凝胶电泳试验证明(如图3)。凝胶电泳条孔中依次加入裸质粒DNA;TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1%十二烷基硫酸钠；TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的水溶液；TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的0.5M氯化钠溶液；TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1M氯化钠溶液以及TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物的1.5M氯化钠溶液。显示TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物在0.5M氯化钠溶液中24h稳定。实例33:TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对小鼠肺的体内转染TrPDMAEMA与质粒DNA的N:P比例为4，质量浓度为30iag/ml。对小鼠进行器官滴注TrPDMAEMA与质粒DNA复合物，48h后处死小鼠，取小鼠肺进行切片，在荧光显微镜下计数转染效率约40%。实例34:TrPDMAEMA/质粒DNA纳米复合物对小鼠脊髓内鞘细胞体内转染TrPDMAEMA与质粒DNA的N:P比例为4，质量浓度为30pg/ml。对小鼠脊髓内鞘内注射TrPDMAEMA与质粒DNA复合物，48h后处死小鼠，对小鼠脊髓切片，在荧光显微镜下计数转染效率约40%。实例35:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)纳米复合物对小鼠脾细胞的免疫活性TrPDMAEMA与CpG-ODN的N:P比例为0.75，质量浓度为30ing/ml。小鼠脾细胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN复合物孵育3天，免疫活性增加23%。实例36:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)纳米复合物对鼠胰腺细胞的免疫活性TrPDMAEMA与CpG-ODN的N:P比例为L2，质量浓度为30吗/ml。小鼠脾细胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN复合物孵育3天，免疫活性增加27%。实例37:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)纳米复合物对鼠胰腺细胞的免疫活性TrPDMAEMA与CpG-ODN的N:P比例为2，质量浓度为30吗/ml。小鼠脾细胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN复合物孵育3天，免疫活性增加31%。实例38:TrPDMAEMA/人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)纳米复合物对鼠胰腺细胞的免疫活性TrPDMAEMA与CpG-ODN的N:P比例为4，质量浓度为30pg/ml。小鼠脾细胞用TrPDMAEMA/CpG-ODN复合物孵育3天，免疫活性增加35%。文献A.M.Funhoff，C.F.vanNostrum,M.C.Lok,J.A.Kruijtzer,D丄Crommelin,W.E.HenninkCationicpolymethacrylateswithcovalentlylinkedmembranedestabilizingpeptidesasgenedeliveryvectors,J.Control.Release2005,101(1—3):233-246.P.VanDeWetering,J.Y.Chemg,H.Talsma,D.J.A.Crommelin，W.E.Hennink，2陽(dimethylamino)ethylmethacrylatebased(co)polymersasgenetransferagents,J.Control-Release1998,53，145-153.P.VanDeWetering,J.Y.Cherng,H.Talsma,W.E.Hennink,Relationbetweentransfectionefficiencyandcytotoxicityofpoly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate)/plasmidcomplexes,J.Control.Release1997,49,59-69.R.A.Jones,M.H.Poniris,M.R.Wilson,pDMAEMAisinternalisedbyendocytosisbutdoesnotphysicallydisruptendosomes,J.Control.Release2004，96(3)379—391Y.Z.You,D.S.Manickam，Q.H.Zhou,D.Oupick》，Reduciblepoly(2-dimethylaminoethylmethacrylate):Synthesis,cytotoxicity,andgenedeliveryactivity,J.Control.Release2007,122,217-225J.Kloeckner,E.Wagner,M.Ogris,Degradablegenecarriersbasedonoligomerizedpolyamines，Eur.J.Pharm.Sci.2006,29(5)，414425C.Lin，Z.Zhong,M.C.Lok,X.Jiang,W.E.Hennink,J.Feijen,J.F.Engbersen,Novelbioreduciblepoly(amidoamine)sforhighlyefficientgenedelivery,Bioconjug.Chem.2007,18(1),138-145L.V.Christensen,C.W.Chang,W丄Kim,S.W.Kim,Z.Zhong，C.Lin，J.F.Engbersen,J.Feijen，Reduciblepoly(amidoethylenimine)sdesignedfortriggeredintracellulargenedelivery,Bioconjug.Chem.2006，17(5)，1233—1240权利要求1、一种还原性聚甲基丙烯酸酯，其特征在于，所述的还原性聚甲基丙烯酸酯为TT—PDMAEMA，其分子结构式如下用凝胶色谱表征，TT-PDMAEMA的数均摩尔质量为3500-4500g/mol，聚分散系数为1.01-1.25。2、如权利要求1的一种还原性聚甲基丙烯酸酯的制备方法如下a.2-二甲氨基-甲基丙烯酸酯的可逆加成-断裂链迁移聚合，在四氢呋喃溶剂中加入DMAEMA、偶氮二异丁腈引发剂，RAFT试剂，充分去氧，真空密封，60°C水浴中反应，加入过量己烷沉淀、分离产物；b.将步骤a获得的产物溶解在四氢呋喃溶液中，加入数滴过硫酸铵溶液，充氮气30min后，加入正丁胺，在氮气保护下搅拌，反应混合物加入过量己垸沉淀、过滤，即得到TT-PDMAEMA。3、如权利要求2的一种还原性聚甲基丙烯酸酯的制备方法，其特征在于，所述的RAFT试剂为1,3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯时，步骤a获得的产物为TEX-PDMAEMA:1，3，5-三(2-(硫代苯磺酰基-2-丙基))苯端聚-(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯。4、如权利要求2的一种还原性聚甲基丙烯酸酯的制备方法，其特征在于，所述的RAFT试剂为1,3,5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基))苯时，步骤a获得的产物为TTP-PDMAEMA:1，3，5-三(2-(黄原酸乙酯基-2-丙基))苯端聚(2-(二甲氨基)乙基))甲基丙烯酸酯。5、如权利要求1的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的基因纳米复合物的激光光散射参数为<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>其中*根据d^3Mw/(4p队R/)计算林估计的每个复合物的DNA分子平均数。6、如权利要求5的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的基因纳米复合物的构建方法如下TT-PDMAEMA溶解在缓冲溶液中，将该缓冲溶液与质粒基因按一定比例，聚合物中氮原子数与基因中负电荷数的比例范围是N:P=0.75-4，混合，温浴，静止。7.如权利要求6的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的缓冲溶液为pH=4.0的醋酸钠缓冲溶液。8.如权利要求6的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的缓冲溶液为pH=7.2的磷酸钠缓冲溶液。9、一种权利要求1的还原性聚甲基丙烯酸酯，其特征在于二硫键交联的还原性阳离子产物TrPDMAEMA的分子结构式为-用凝胶色谱表征，其数均摩尔质量为16500-35700g/mo1,聚分散系数为2.5-4.5，对[H+]缓冲容量在2.4-3.9Mmol/mg。10.如权利要求9的一种还原性聚甲基丙烯酸酯的制备方法如下-在TT-PDMAEMA的去离子水溶液中加入二甲基亚砜，搅拌，除去水后，沉淀，干燥后得到TrPDMAEMA。11.如权利要求9的一种还原性聚甲基丙烯酸酯的制备方法如下-在溶解TEX-PDMAEMA的甲醇溶液中加入二甲基亚砜和正丁胺，在室温条件下，该混合物溶液在氧气气氛中搅拌13-15天，然后蒸馏除去甲醇，将剩余混合物溶液溶解在四氢呋喃中，加入10倍体积比的过量的己垸溶剂中沉淀、过滤，并千燥得到TrPDMAEMA。12.如权利要求9的一种还原性聚甲基丙烯酸酯的制备方法如下在溶解TTP-PDMAEMA的甲醇溶液中加入二甲基亚砜和正丁胺，在室温条件下，该混合物溶液在氧气气氛中搅拌13-15天，然后蒸馏除去甲醇，将剩余混合物溶液溶解在四氢呋喃中，加入10倍体积比的过量的己烷溶剂中沉淀、过滤，并干燥得到TrPDMAEMA。13.如权利要求9的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的基因纳米复合物的激光光散射参数为<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>其中，*根据d:3Mw/(4pNAR/)计算**估计的每个复合物的DNA分子平均数。14.如权利要求9的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的基因纳米复合物的构建方法如下TrTOMAEMA溶解在缓冲溶液中，将该缓冲溶液与质粒基因按一定比例，聚合物中氮原子数N与基因中负电荷数P的比例范围是0.75-4,混合，温浴，静止。15.如权利要求14的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的缓冲溶液为pH=4.0的醋酸钠缓冲溶液。16.如权利要求14的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用，其特征在于，所述的缓冲溶液为pH=7.2的磷酸钠缓冲溶液。17.如权利要求1或9的一种还原性聚甲基丙烯酸酯在基因治疗中的应用。全文摘要本发明涉及还原性阳离子聚甲基丙烯酸酯及其制备方法和此聚甲基丙烯酸酯在基因纳米复合物构建中的应用及此聚甲基丙烯酸酯在基因治疗的应用。本发明以1，3，5-三异丙基苯为原料，与N-溴代琥珀酰亚胺、乙基黄原酸钾反应，得取代的1，3，5-三异丙基苯基乙基黄原酸酯，偶氮二异丁腈催化与2-(二甲氨基乙基)甲基并丙烯酸酯通过可逆加成-断裂链迁移聚合、氨解和氧化反应得—聚[1，3，5-三端巯基(2-丙基苯基-2-(二甲氨基)乙基)]甲基丙烯酸酯]及其二硫键交联产物。此聚甲基丙烯酸酯能浓缩质粒基因成纳米复合物，转染HEK293T细胞和Hella细胞效率在30％以上，毒性低，细胞存活率大于80％。文档编号A61K48/00GK101429260SQ20081004197公开日2009年5月13日申请日期2008年8月22日优先权日2008年8月22日发明者于伯章,李文新,马继飞申请人:中国科学院上海应用物理研究所