专利名称：：仙鹤草总黄酮提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及仙鹤草总黄酮提取物，及其制备方法，和该提取物用作抗氧化剂，以及在制备心脑血管药物上的应用。
背景技术：
：仙鹤草，又叫脱力草、瓜香草、老牛筋、狼芽草，为蔷薇科多年生草本植物龙芽草"gr/7M朋/fl丄e&6.)的地上部分。生于山坡林下，路旁、沟边。主产浙江、江苏、湖北。在传统中药中主要药效为收敛止血，截疟，止痢，解毒。用于咳血、吐血、疟疾、脱力劳伤、痈肿。仙鹤草水提取物的药理作用的研究报道较多。现代研究表明，仙鹤草的水提取物具有强心、降压、降血糖、抗菌、杀虫和抗肿瘤作用。其中仙鹤草水提取物具有抗菌、杀虫作用的有效成分是鹤草酚；其抗肿瘤作用的有效成分是仙鹤草素。但是仙鹤草水提取物的强心、降压、降血糖等作用的有效成分和作用机制S前还不清楚。目前文献尚未发现仙鹤草水提取物用作抗氧化剂，以及用作治疗心脑血管疾病药物的报道。仙鹤草醇提取物的药理作用的研究报道相对较少。王德才等(泰山医学院学报，2004,25(1):7-8)出版物描述了仙鹤草乙醇提取物具有显著的抗炎镇痛作用，但其有效成分和作用机制不清楚。目前文献尚未发现仙鹤草总黄酮提取物用作抗氧化剂，以及用作治疗心脑血管疾病药物的报道。自由基(freeradical),从化学结构上看是指含未配对电子的基团、原子或分子。自由基具有高度化学活性。对于生命体来说，自由基是生命活动中多种生化反应的中间产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于产生与清除的动态平衡之中。自由基是机体有效的防御系统，如不能维持一定水平的自由基则会对机体生命活动带来不利影响。但自由基产生过多或清除过慢，它通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，会造成机体分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。最新的研究表明，自由基反应的产物的累积导致了许多病态中的一些疾病，这己被认为部分地是由细胞内自由基增长量诱发细胞损伤引起的。这些包括但不局限于一癌症、心血管疾病、中枢祌经系统紊乱、骨疾、衰老、早老性痴呆、炎症、类风湿性关节炎、自身免疫疾病、呼吸窘迫和肺气肿等。因此，为了清除生命体中的多余自由基，目前普遍应用的自由基清除剂有非酶类自由基清除剂(主要有维生素E、维生素C、(i-胡萝卜素和还原型谷胱甘肽等)和酶类自由基清除剂(主要有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等)。其中维生素E虽然有一定的清除自由基活性但有促进早熟的副作用；维生素C、(3-胡萝卜素的活性较差；酶类自由基清除剂则应用范围过于狭窄。因此，人们在不断地努力寻找新型高效自由基清除剂。目前，人工合成抗氧化剂(BHT、丁基茴香醚等)和天然抗氧化剂(如茶多酚、芝麻酚、米糠素、槲皮素、胚芽油提取物、芸香苷、银杏黄酮等)己被广泛应用在食品、药品和日化用品等中。然而，有的人工合成抗氧化剂具有一定的毒副作用。所以天然抗氧化剂己成为目前抗氧化剂研究开发方向。仙鹤草资源丰富，廉价易得，且尚未见文献报道仙鹤草总黄酮提取物作为抗氧化剂的用途。几种植物的总黄酮提取物可以用于治疗心肌梗塞、心绞痛、心肌缺血等心脑血管疾病和降血脂作用，在以下文献里有描述专利ZL02135573.8、ZL02116910.1、ZL99119344.X和CN1403451。但尚未见文献报道仙鹤草总黄酮提取物用于治疗心肌梗塞、心绞痛、心肌缺血等心脑血管疾病和降血脂作用。
发明内容本发明克服了现有技术的不足，提供了以黄酮类化合物为主要成分的仙鹤草总黄酮提取物。本发明的另一目的是提供仙鹤草总黄酮提取物的制备方法。本发明还提供上述仙鹤草总黄酮提取物在制备自由基清除剂或抗氧化剂的中的应用。本发明还提供上述仙鹤草总黄酮提取物在治疗和/或预防冠心病、动脉粥样硬化、高血压、高脂血症的药物和保健品制备中的用途。本发明所提供的仙鹤草总黄酮提取物是指采用任何方法从植物仙鹤草中提取获得的，以黄酮类化合物作为主要成分(或主要功效成分)的提取物，该提取物中，黄酮类化合物的总重量之和占提取物总重量的25%100%。所述的黄酮类化合物是指化学结构属于黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷醇类、双苯毗酮类，异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类、橙酮类、高异黄酮类的化合物以及它们与单糖或寡糖形成的糖试或其它形式的衍生物。提取物中的各种黄酮类化合物之间的含量比例可以与天然植物中的含量比例一致，也可以与天然植物中的含量比例不尽一致。本发明所述的仙鹤草总黄酮提取物的提取制备方法，用仙鹤草植物作原料，采用水、含水或不含水的有机溶剂作提取溶剂，所述的提取制备过程包括用水、含水或不含水甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、」下丁醇或其类似物之一种或几种任意比例的混合物作溶剂，将仙鹤草植物或其粉碎料加入重量530倍的溶剂中，经浸泡、渗辘、煎熬或回流提取，静置、过滤、浓縮回收有机溶剂得浸膏，然后进行分离纯化。分离纯化方法为①采用丙酮、乙酸乙酯、正丁醇或其类似物之一种或几种任意比例的混合物作溶剂进行萃取，有机相回收溶剂，真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥得总黄酮提取物。或者②采用吸附树脂柱进行纯化处理，上柱过程中任选采用黄酮类显色剂检测流出液以确定树脂是否吸附饱和，先后用1~5倍树脂柱体积的水、0.5~5倍树脂柱体积的体积浓度为5%~20%的乙醇水溶液洗涤(也可不用)，再用3~10倍树脂柱体积、体积浓度为20%~80%的乙醇水溶液洗脱，浓縮，并将浓縮液进行真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，得总黄酮提取物。或者③用无机酸将浓縮液pH值调至3或以下，常温或低温静置，分离沉淀并干燥得总黄酮提取物。上述分离纯化的方法可单独应用得仙鹤草总黄酮提取物，也可任意组合应用得仙鹤草总黄酮提取物。上述方法所得的仙鹤草总黄酮提取物中黄酮类化合物的重量之和为提取物总重量的25%~100%。这些总黄酮提取物，可以进一步采用常规植化方法纯化，例如各种色谱柱层析等，这些方法对于本领域内技术人员来说是不言自明的。因此，本发明总黄酮提取物定义了黄酮类化合物含量，不论各单体化合物的含量如何，只要是从植物仙鹤草中提取、并且黄酮类化合物总含量在上述定义范围内，则该提取物在本发明的范围内。本发明所述的仙鹤草总黄酮提取物的提取工艺中，采用吸附树脂法作为仙鹤草黄酮的分离手段，可除去大量杂质，因而使有效成分富集，同时完成了除杂和浓縮两道工序。这种方法的工序少，可縮短生产周期，而且可去除重金属污染。本发明发现仙鹤草总黄酮提取物具有自由基清除作用和抗氧化作用。因此，本发明提供的仙鹤草总黄酮提取物用于治疗或抑制自由基诱发疾病的药物。本发明首次发现仙鹤草总黄酮提取物具有抗心肌缺血及降血脂作用。因此，本发明提供的仙鹤草总黄酮提取物用于治疗和/或预防某些心血管疾病，如冠心病，其包括心绞痛、冠脉粥样硬化、心肌缺血等病症；高胆固醇血脂症，包括原发或并发于其它病症的高胆固醇血脂症；脑血管病，如脑缺血和/或缺氧症；以及其它相关病症。本发明所述的仙鹤草总黄酮提取物用于食品保鲜剂，如动、植物油脂保鲜，水产品保鲜，果、蔬保鲜，各类方便食品保鲜等，还用于保健品添加剂。提取物抗氧化作用的效果明显，且提取工艺简单、成本低，提取率高，可充分利用廉价的仙鹤草为原料。本发明提供的仙鹤草总黄酮提取物可以是本身和药学上可利用的载体和/或稀释剂和辅料，呈片剂、糖衣片剂、丸剂、胶囊、注射剂、栓剂、膏剂、可被吸入使用的粉末制剂、悬浮液、霜剂和软膏形式。与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点1、本发明人首次发现药用植物仙鹤草中所含的黄酮类化合物是具有重要心血管药理活性和抗氧化活性的化合物类群，发明人采用合适的提取方法获得了具有显著的心脑血管保护作用的仙鹤草总黄酮提取物，一方面有望给心脑血管疾病患者和自由基诱发疾病患者提供一种新的治疗选择，另一方面对于更加有效地利用仙鹤草植物资源，拓宽仙鹤草植物的应用也具有重要意义；2、本发明提供的提取方法工序少，操作简便，生产周期短，而且可去除药材中污染的有害金属或类金属元素；3、本发明提供的仙鹤草总黄酮提取物能够用于治疗和/或预防某些心血管疾病，如冠心病，其包括心绞痛、冠脉粥样硬化、心肌缺血等病症；高胆固醇血脂症，包括原发或并发于其它病症的高胆固醇血脂症；脑血管病，如脑缺血和/或缺氧症；高血压；以及其它相关病症。4、本发明提供的仙鹤草总黄酮提取物的植物资源来源广泛，便宜易得。具体实施例方式下列具体的实施例是对本发明进行更加详细的描述，但不对本发明的范围构成任何限制。实施例1仙鹤草总黄酮提取物的提取和纯化于提取罐中加入仙鹤草全草10kg，水80L，煮沸提取2小时，从提取罐底部放出提取液，再加入50L水在相同条件下提取1.5小时。过滤合并两次提取液。将提取液减压浓縮并干燥得浸膏2kg。于提取罐中加入仙鹤草全草10kg，60。/。乙醇70L，煮沸提取2小时，从提取罐底部放出提取液，再加入60e/。乙醇50L在相同条件下提取1.5小时。过滤合并两次提取液。将提取液减压浓縮并干燥得浸膏1.7kg。将浸膏50g分散在0.5L水中，用0.5L正丁醇萃取，重复3次，合并萃取液减压回收正丁醇，真空干燥得5g仙鹤草总黄酮提取物A。将5g上述仙鹤草总黄酮提取物A分散在0.1L水中，以每小时2倍柱体积的速度上AB-8大孔吸附树脂柱，待树脂将黄酮充分吸附后，先后用4倍柱体积的蒸馏水和2倍柱体积的20%的乙醇水溶液洗脱以洗去大部分杂质，最后用80%的乙醇水溶液洗脱，浓縮，并将浓縮液进行冷冻干燥，得3g仙鹤草总黄酮提取物B。实施例2仙鹤草总黄酮提取物的含量检测标准曲线的制作准确称取芦丁标准品10.0000mg溶于50%的乙醇水溶液，定容至25mL，得400吗/mL的芦丁标准溶液。准确量取上述芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置入10mL容量瓶中，加50%的乙醇水溶液补足5mL，先后加入5%的NaN02和10%的Al(NO3)3各0.3mL,混匀放置5min后，加4%的NaOH溶液4mL，最后用50%的乙醇水溶液定容，混匀放置10min后于510nm测定吸光度A。得标准曲线回归方程y=0.9756x+0.0018,R2=0.9995测定准确称取仙鹤草总黄酮提取物A和B各6.0000mg溶于50。/。的乙醇水溶液，定容至lOmL，得600ng/mL的待测液。准确量取上述待测液lmL置入lOmL容量瓶中，按标准曲线制作中的步骤进行测定得吸光度A。根据上述标准曲线回归方程计算得仙鹤草总黄酮提取物A和B的黄酮含量分别为60.5%和85.1%。实施例3仙鹤草总黄酮提取物的抗氧化活性实验(1)体外清除DPPH，自由基的作用DPPH用无水乙醇配制成0.65mM的溶液，临用时稀释。DPPH溶液的浓度在0.01mM0.08mM范围内与其在517nm处的吸光度线性相关，其线性回归方程为A=0.1337c(DPPH)-0.0091，R2=0.9981。取O.lmL不同浓度的样品溶液，加入1.9mL0.065mM的DPPH溶液混匀。于室温下反应一定时间，在517nm下测定吸光度Ai。以相应溶剂代替样品作为空白对照，吸光度为Amax，相应样品溶液的吸光度为Ao。每个样品做3次平行样，取其平均值。DPPH.自由基的清除活性按下式计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>%"max半数清除浓度(EC5Q)根据实验结果计算，结果见表l。(2)超氧阴离子的清除活性采用核黄素-光-氮蓝四唑体系测定。空白吸光值(A空白)取0.5mLpH7.5的磷酸盐缓冲液，加入0.3mL5xl(T5mol/L核黄素，0.25mL0.02mol/L甲硫氨酸，5.1xl0—4mol/L氮蓝四唑和1.0mL样品溶剂，再加去离子水定容至5.0mL，40W日光灯照射20min，于560nm处比色。样品吸光值(A样品)取0.5mLpH7.5的磷酸盐缓冲液，加入0.3mL5><10-5mo/L核黄素，0.25mL0.02mol/L甲硫氨酸，5.1><10'4mol/L氮蓝四唑和1.0mL样品溶液，再加去离子水定容至5.OmL,40W日光灯照射20min，于560nm处比色。超氧阴离子自由基清除率=(^空白-X样品J/j空白x100。/0半数清除浓度(EC5Q)根据实验结果计算，结果见表l。(3)羟自由基清除能力羟自由基的产生与检测在一系列50mL具塞比色管中分别加入1.5mL结晶紫(0.4mmol丄-1)，2.0mLFeS04溶液(l麵ol丄-1)，1.0mL11202溶液(2.0mmol.L-1)。调pH值到4.0，稀释到50mL并摇匀，放置30min后，测580nm处的吸光度Ab，同时测定不加11202时580nm处的吸光度Ao。则羟自由基的产生量可以用AA:Ao-Ab来表征。表观抗羟自由基清除率的测定在上体系中加11202之前加入一定量的抗氧化试剂,测定其吸光度As。羟自由基清除率=(As-Ab)/(A0-Ab)x100%半数清除浓度(EC5Q)根据实验结果计算，结果见表l。(4)总抗氧化能力采用卩-胡萝卜素-亚油酸体系反应液制备在100mL的圆底烧瓶中加入2mL0.2mg/mL的(3-胡萝卜素氯仿溶液、20pL亚油酸、200pL吐温20，在4(TC下减压蒸发除去氯仿后立即加入100mL的双蒸水，混匀得反应液。需现用现配。在试管中加入4.8mL反应液和200nL样品溶液，不加样品的加入样品溶剂做对照，混匀后在470nm处测定其吸光度，记为A^和A。、然后5(TC水浴2h再在470nm处测定其吸光度，记为Ast和A。t。抑制P-胡萝卜素氧化率-l-(ASQ-AsVA-A》xl00%半数抑制浓度(IC5Q)根据实验结果计算，结果见表l。表1仙鹤草总黄酮提取物的抗氧化能力清除DPPH，自由基的EC5()清除超氧阴离子自由基的EC50清除羟自由基的EC50总抗氧化能力的ic50取仙鹤草总黄酮提取物A7J土0.3吗/mL8.5±0.4ng/mL81.6土7.2pg/mL13.1±0.8ng/mL<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4仙鹤草总黄酮提取物的药效学检测1、仙鹤草总黄酮提取物的抗心肌缺血实验实验方法SD大鼠，灌胃给药(实施例1提取物10mg/kg，给药3天，每天2次)，第4曰麻醉后，开胸结扎冠状动脉，2小时后取心脏，染色，观察心肌梗死区域的大小。实验结果与空白对照组相比，提取物给药组动物在冠脉结扎后心肌梗死区域面积显著减小。表2各组大鼠冠状动脉结扎后心肌梗死区域面积比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与空白对照组比较*p<0.05，**p<0.01(t-test)2、仙鹤草总黄酮提取物调节血脂作用实验实验方法大鼠在实验环境下喂普通饲料1周，眼眶采血，测血脂作为正常值。正常对照组喂普通饲料，高脂模型对照组喂高脂饲料，实验组喂高脂饲料同时给药(实施例1提取物5mg/kg)，灌胃，2周后摘眼球取血，测定各项指标。实验结果提取物给药可以显著降低血清总胆固醇及低密度脂蛋白含量。表3大鼠高血脂模型各组降脂实验结果(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种仙鹤草总黄酮提取物，其特征是从仙鹤草植物中提取获得的黄酮类化合物之总量占提取物总重量的25％～100％。所述的黄酮类化合物是指化学结构属于黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷醇类、双苯毗酮类，异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类、橙酮类、高异黄酮类的化合物以及它们与单糖或寡糖形成的糖试或其它形式的衍生物。2、根据权利要求1所述的仙鹤草总黄酮提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤用水、含水或不含水甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇或其类似物之一种或几种任意比例的混合物作溶剂，将仙鹤草植物或其粉碎料加入重量530倍的溶剂中，经浸泡、渗辘、煎熬或回流提取，静置、过滤、浓縮回收有机溶剂得浸膏，然后进行分离纯化。3、根据权利要求2所述的仙鹤草总黄酮提取物的制备方法，其特征在于分离纯化方法为采用丙酮、乙酸乙酯、正丁醇或其类似物之一种或几种任意比例的混合物作溶剂进行萃取，有机相回收溶剂，真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥得总黄酮提取物。4、根据权利要求2所述的仙鹤草总黄酮提取物的制备方法，其特征在于分离纯化方法为采用吸附树脂进行柱层析，上柱过程中任选采用黄酮类显色剂检测流出液以确定树脂是否吸附饱和，先后用15倍树脂柱体积的水、0.5~5倍树脂柱体积的体积浓度为5%~20%的乙醇水溶液洗潘，再用310倍树脂柱体积的体积浓度为20%80%的乙醇水溶液洗脱，浓缩，并将浓缩液进行真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，得总黄酮提取物。5、根据权利要求2所述的仙鹤草总黄酮提取物的制备方法，其特征在于分离纯化方法为用无机酸将浓縮液pH值调至3或以下，常温或低温静置，分离沉淀并干燥得总黄酮提取物。6、根据权利要求2所述的仙鹤草总黄酮提取物的制备方法，其特征在于分离纯化方法为权利要求3、4、5所述的分离纯化方法任意组合应用得仙鹤草总黄酮提取物。7、根据权利要求1所述的仙鹤草总黄酮提取物的用途，是用于制备用作自由基清除剂或抗氧化剂的药物、保健品和食品添加剂。8、根据权利要求1所述的仙鹤草总黄酮提取物的用途，是用于制备治疗和/或预防冠心病、动脉粥样硬化、高脂血症等心脑血管疾病的药物和保健品。9、根据权利要求l、7、8所述仙鹤草总黄酮提取物的药物或保健品，其特征在于包括仙鹤草总黄酮提取物和药学上可利用的载体和/或稀释剂和辅料，呈片剂、糖衣片剂、丸剂、胶囊、注射剂、栓剂、膏剂、可被吸入使用的粉末制剂、悬浮液、霜剂和软膏形式。全文摘要本发明公开了仙鹤草总黄酮提取物及其提取制备方法，酮类化合物之总量占提取物总重量的25％～100％，用仙鹤草植物作原料，采用含水或不含水的有机溶剂作提取溶剂，提取过程包括提取、用溶剂萃取、吸附树脂柱进行纯化处理或者用无机酸将浓缩液pH值调至3或以下，然后处理得黄酮类提取物。实验证明，仙鹤草总黄酮提取物具有抗氧化作用，和抗心肌缺血及降血脂作用。仙鹤草总黄酮提取物可用作食品保鲜剂、保健品添加剂。仙鹤草总黄酮提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂制备成各种药物剂型，用于抗心肌缺血及降血脂药物，具有工艺简单、治疗效果好等优点，广泛用于治疗和/或预防冠心病、高脂血症、高血压和预防动脉粥样硬化等心脑血管疾病。文档编号A61K36/73GK101229252SQ200810069259公开日2008年7月30日申请日期2008年1月18日优先权日2008年1月18日发明者余正文,王伯初,祝连彩,君谭,蕊贺,婧隋申请人:重庆大学