可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点的制作方法

专利名称：可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学、细胞生物学和基因治疗领域。更具 体地，本发明涉及可用于乙型肝炎病毒感染治疗的RNA干扰(RNAi ) 的42个靼点以及应用这些乾点的重组表达载体和应用这些靼点以各 种方式获得的可用于乙型肝炎病毒感染治疗的药物和方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染是全世界最重要的公共 卫生问题之一。HBV感染引起的相关疾病包括急性或慢性乙型肝炎， 及由慢性乙型肝炎进一步发展引发的肝硬化(HC)、肝细胞癌(HCC) 等。HBV感染的范围很广，目前全世界约有4亿HBV感染者，约20亿 人感染过HBV。慢性HBV携带者中有相当一部份发展成为CHB，部分患 者发展成为HC、HCC，每年因为HBV感染而死亡的人数超过100万(Don Ganem等，新英格兰医学，2004年，35巻1118-1129页)。我国是 HBV感染高发区，HBV感染率约为56. 7%, HBV病毒携带率为9.75%, 约1. 2亿人长期携带HBV( 1992-1995年全国流调)。在各型病毒型肝 炎中，HBV对人类健康的危害最严重。随着HBV疫苗在1982年的问世， HBV的感染率有明显降低，同时抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治 疗取得了一定的进展。然而，由于HBV携带者数量庞大，而且目前的 抗病毒药物尚无法根治HBV感染，因此仍将有大量的HBV携带者面临 可能发展为肝硬化和肝细胞癌的危险。因此，迫切需要发展新的治疗 手段以对付HBV的威胁。RNA干扰(RNA interference, RNAi )是一种由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA )介导的细胞内的序列特异性的抑制基因表达的机制，是1998年在线虫中进行基因表达抑制研究中被首次 提出(FireA等，自然，1998年，391巻806-811页)。在此之后， 进一步的研究发现RNAi广泛存在于高等哺乳动物以及真菌、拟南芥、 水媳、涡虫、锥虫、斑马鱼等几乎所有的真核生物中，是一种普遍存 在和保守的抑制基因表达的机制，可起到调控基因表达、抗病毒入侵、 抑制转座子活动等作用(DykxhoornDM等，自然分子细胞生物学综述， 2003年，4巻457-467页)。目前RNAi作用的机制已基本阐明内 源或外源产生的dsRNA分子在细胞质中纟皮属RNA酶m的Dicer切割成 小干扰RNA (small interfering RNA， siRNA)。典型的siRNA结构 特征为5'端磷酸化，3'端呈对称性突出2-3nt并带羟基，长度为 19-23nt的dsRNA。siRNA分子与RNA谦导的沉默复合体(RNA-inducing silencing complex, RISC)的蛋白复合体进行结合，RISC具有解螺 旋酶和核酸内切酶活性。siRNA分子在复合体中被解聚，其中反义链 与可与之匹配的耙mRNA按碱基配对原则结合，并引导与之结合的RISC 将靶mRNA在与反义链的结合区中部距5'端10nt的位置处酶解，从而 抑制靶基因的表达。目前获得siRNA的方法主要有可表达小发夹RNA (short hairpin RNA， shRM)的质粒和重组病毒载体、化学合成方 法、体外转录等。目前，RMi技术在包括乙型肝炎病毒感染在内的病毒性疾病以及 肿瘤等疾病的防治研究已显示出良好的应用前景。研究已显示靶向 HBV mRM的siRM可在体外培养的人肝癌细胞林中抑制HBV的复制和 病毒基因的表达(Konishi M等，Hepatology， 2003年，38巻842-850 页)。由于HBV的致病机理较为复杂，要达到有效的治疗目的必须能 够高效抑制病毒复制和基因表达。然而，并非所有符合常规设计要求 的RNAi靼点都能够有效抑制耙基因的表达，不同耙点间的抑制效率各 有差别。因此，选择获得合适的具有高抑制效率的RNAi靶点成为RNAi 技术是否能够成功应用于抗HBV治疗的重要因素。选择合适的RNAi 靶点需要从结构特征、抑制效率、非人类基因同源性等方面进行综合 考虑。可使用的辅助方法包括目前已提出的siRNA辅助设计软件、RNA分子结构分析、核酸序列分析比对以及实验经验等，并通过具体的抑 制评估实验予以验证。以RNA干扰技术为基础将有望开发出新型的更有效可用于乙型肝 炎病毒感染治疗的方法，该类型的治疗方法需要提供可有效抑制HBV 复制和表达的RNA干扰靶点。本发明满足了这一要求，提供了可用于 该目的的RNA千扰靶点、重组表达载体等。发明内容本发明提供了靶向HBV的RNA干扰靶点，可用于构建包含或导入 了本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列的表达质粒、重组病毒 载体和细胞，及可用于获得包含有由本发明涉及的RNA干扰靶点获得 的治疗药物。本发明提供的RNA千扰靶点可靶向HBV，可抑制HBV的复制和病 毒基因表达。本发明提供的RNA干扰靶点是通过以下方法获得的选 择设计可粑向HBV的RNA干^靶点序列，通过设计合适的引物构建 shRNA,并克隆入表达栽体获得相应的shRNA表达质粒，将该质粒分别 与HBV感染性克隆质粒进行共转染实验，通过检测HBV蛋白的表达水 平及鉴定抑制特异性等分析筛选获得合适的RNA干扰靶点。本发明提供(特异)靶向HBV的RNA干扰靶点序列，该序列选自(1) SEQID NO: 1 - 42中任何一个所示的序列，或者(2) 与(1)中序列具有至少70% (优选至少80%、 85%、 90 %、 95%、 98%或更高) 一致性的序列，或者(3) 在严紧条件下或者高度严紧条件下与(1)中序列能够杂交 的核苷酸序列，或者(4 )与(1 )中序列仅有1 - 3个(优选1 - 2个，更优选1个)核苷酸不同的序列；或者(5)上述序列的片段或者互补序列。 在一个具体方面，所述RNA干扰靶点序列可以靶向HBV X、 S、 P或者c基因。在一个优选实施方案中，所述RNA干扰乾点选自siHBV7 ( SEQ ID NO: 7)和siHBV12 ( SEQ ID NO: 12)。本发明提供的RNA干扰靶点可以是DM或RNA序列。本发明还提供包含该RNA ，扰靶点序列的核酸构建体或载体如表 达载体。包含该RNA干扰靶点序列的重组表达载体可用于表达本发明 的耙向HBV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。本发明还提供了可表达本发明的靶向HBV的siRNA和/或miRNA 和/或核酶和/或反义寡核苷酸的重组表达载体。在一个实施方案中，本发明重组表达栽体具有以下特征包含了 本发明提供的RNA干扰靶点序列的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/ 或反义寡核苷酸的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列 可操作地连接，使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞，如人细胞， 优选肝细胞和干细胞)中表达所述靶向HBV的siRM和/或miRNA和/ 或核酶和/或反义寡核苷酸。本发明的重组表达载体可以是质粒载体或病毒载体，例如逆转录 病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。本发明还提供依据上述的RNA干扰靶点序列获得的、能够抑制HBV 相应基因的表达和/或HBV的复制和/或感染的siRNA或miRNA或核酶 或反义寡核苷酸。本发明还涉及分离的细胞，其包含(l)本发明RNA干扰靶点序 列，或者(2 )含有本发明RNA干扰靶点序列的核酸构建体或载体如表达载体o本发明还涉及转化或转染或转导了重组表达载体的分离的细胞，所述重组表达载体可表达本发明的靶向HBV的siRNA和/或miRNA和/ 或核酶和/或反义寡核苷酸。本发明还涉及一种改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的 细胞，优选肝细胞和干细胞)，其可表达或包含有本发明siRNA或 miRNA或核酶或反义寡核苷酸。本发明还涉及在基因组中或者基因组外携带本发明涉及的RNA干 扰靶点的编码核酸序列的细胞，包括原核细胞(如细菌细胞，如大肠 杆菌细胞)和真核细胞(如真菌细胞，昆虫细胞，植物细胞，动物细 胞，优选哺乳动物如人的细胞，优选肝细胞和干细胞)，其包含有本 发明涉及的RNA干扰靶点'的编码核酸序列(这些编码核酸序列可与表 达控制序列可操作地连接，使得可在该细胞中表达所述的siRNA和/ 或raiRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸)。本发明还涉及导入了由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA 和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸的细胞，包括原核细胞(如 细菌细胞，如大肠杆菌细胞)和真核细胞(如真菌细胞，昆虫细胞， 植物细胞，动物细胞，优选哺乳动物如人的细胞，优选肝细胞和干细 胞)，其被导入了包含有由本发明涉及的RNA干扰靶点获得的siRNA 和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。在一个优选的实施方案中，含有本发明获得的RNA干扰靶点的编 码核酸序列的shRNA表达元件导入肝细胞后可使细胞获得抑制HBV复 制和病毒基因表达的能力。本发明还涉及包含上述细胞的组织和生物，如动物。本发明还涉 及包含本发明的细l包的药物组合物。另一方面，本发明还涉及制备本发明政造细胞的方法，包括用本 发明的重组表达载体转化或转染或转导细胞(包括动物例如哺乳动物 优选人的细胞，优选肝细胞和干细胞)。在一个实施方案中，所述方法包括用本发明重组病毒载体(例如 慢病毒载体，如慢病毒Lenti-siHBV7等)转导哺乳动物优选人的肝细 月包和千细月包。在上述方法，所述细胞可以是分离的(或离体的)，例如从感染 HBV的患者或者正常个体分离的，或者是在体的，或者是体外培养的 细胞林。本发明还涉及DNA序列的姐合，其包括或者由编码正义RNA片段 的第一 DNA序列和编码反义RNA片段的第二 DNA序列组成，所述正义RNA片段包含本发明靶点序列所编码的RNA序列，反义RNA片段和正 义RM片段能形成双链RNA，该双链RM能抑制HBV基因的表达和/或 HBV的复制和/或感染。本发明还涉及小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA 片段和反义RNA片段'，所述正义RNA片段包含本发明靶点序列编码的 RNA序列，反义RNA片段和正义RNA片段能形成双链RNA,且该双链 RM能抑制HBV相应基因的表达和/或HBV的复制和/或感染。本发明还涉及由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或 miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸在制备治疗HBV感染或者HBV患 者的药物和/或药物组合物中的用途。本发明还涉及由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或 miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸在制备抑制HBV复制或者HBV基 因表达的药物和/或药物组合物中的用途。本发明还涉及本发明RNA干扰靶点序列、或核酸构建体或载体、 或重组表达栽体在制备治疗HBV感染或者HBV患者的药物中的用途。本发明还涉及本发明的经改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优 选人的细胞，优选肝细胞和干细胞)在制备治疗HBV感染或者HBV患 者的药物和/或药物组合物中的用途。本发明还涉及本发明的s iRNA靶序列在筛选抗HBV药物中的应用。本发明还涉及治疗HBV感染或者HBV患者的方法，包括向有需要 的个体给予本发明的RNA:干扰靶点序列、核酸构建体或载体、重组表 达载体、siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸、或细胞。本发明还涉及本发明载体和细胞用于治疗HBV感染或者HBV患者 的用途。本发明还涉及治疗HBV感染或者HBV患者的方法，包括向患者给 予治疗有效量的本发明所述RNA干扰靶点序列、核酸构建体或栽体、 siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸、表达载体、细胞、DNA序列 组合或siRNA。本发明还涉及抑制HBV复制或者HBV基因表达的方法，包括向有需要的个体给予有效量的本发明所述RNA干扰耙点序列、核酸构建体 或载体、siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸、表达载体、细胞、 DNA序列组合或siRNA。本发明还涉及本发明所述RNA干扰靶点序列、核酸构建体或载体、 siRNA或miRfA或核酶或反义寡核苷酸、表达载体、细胞、DNA序刮 组合或siRNA，用于治疗HBV感染或者HBV患者，或者用于抑制HBV复 制或者HBV基因表达。下面结合附图对本发明进行更详细的说明。从下文的详细描述中， 本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。


图1为pSUPER-siRNA系列表达质粒的构建流程示意图。图2显示了分别^向我们获得的42个RM千扰靶点的siRNA表达 质粒在与HBV感染性克隆质粒共转染实验中对HBV基因表达的抑制效 果。结果显示，这些RNA干扰靶点可抑制HBV。图3显示了携带有靶向HBV的siRNA表达序列的表达载体质粒 pSUPER-siHBV7、 pSUPER-siHBV12转染后的HepG2-N10细胞可显示出 抑制HBV表达的能力，可抑制HepG2-NlG细胞中HBsAg的表达。图4显示了携带有靶向HBV的siRNA表达序列的表达载体质粒 pSUPER-siHBV7、 pSUPER-siHBV12转染后的HepG2-N10细胞可显示出 抑制HBV复制的能力，可降低HepG2-N10细胞培养上清中HBV核酸的 拷贝量。图5显示了携带有靶向HBV的siRM表达序列的重组慢病毒 Lenti-siHBV7、 Lenti-siHBV12转导后的HepG2-N10细胞可显示出抑 制HBV表达的能力，可抑制HepG2-N10细胞中HBsAg的表达。图6显示了携带有靶向HBV的siRNA表达序列的重组慢病毒 Lenti-siHBV7、 Lenti-siHBV12转导后的HepG2-N10细胞可显示出抑 制HBV复制的能力，可降低HepG2-N10细胞培养上清中HBV核酸的拷 贝量。10图7显示了携带有靶向HBV的siRNA表达序列的表达载体质粒 pSUPER-siHBV7、 pSUPER-siHBV12注射转导后的小鼠肝细胞可显示出 抑制HBV表达的能力，可抑制HBV感染性克隆质粒的表达，降低血清 中HBsAg的水平。茵,显示了携带有靶向HBV的siRNA表达序列的表迭载体质粒 pSUPER-siHBV7、 pSUPER-s iHBV12注射转导后的小鼠肝细胞可显示出 抑制HBV复制的能力，可抑制HBV感染性克隆质粒的表达，降低血清 中HBV核酸的拷贝量。图9显示了合成的靶向HBV的RNA干扰乾点的siRNA对HBV的抑 制效果。siR-HBV7和siR-HBV12转染后的HepG2-N10细胞可显示出抑 制HBV表达的能力，可抑制HepG2-N1G细胞中HBsAg的表达。图IO显示了合成的靶向HBV的RNA干扰乾点的siRNA对HBV的抑 制效果。siR-HBV7和siR-HBV12转染后的HepG2-N10细胞可显示出抑 制HBV复制的能力，可降低HepG2-N10细胞培养上清中HBV核酸的拷 贝量。图11显示了合成的并经2，-Ome(2，-曱氧基)修饰和/或磷酸化修 饰和/或固醇修饰的耙向HBV的RNA干扰靶点的s iRNA对HBV的抑制效 果。siRpo-HBV7、 siRpo-HBV12、 siRpoC-HBV7、 siRpoC-HBV12转染后 的HepG2-N10细胞可显示出抑制HBV表达的能力，可抑制HepG2-N10 细胞中HBsAg的表达。图12显示了合成的并经2，-0Me修饰和/或磷酸化修饰和/或固醇 修饰的乾向HBV的RNA干扰靶点的siRNA对HBV的抑制效果。 siRpo-HBV7、 siRpo-HBV12、 siRpoC-HBV7、 siRpoC-HBV12转染后的 HepG2-NlQ细胞可显示出抑制HBV复制的能力，可降低HepG2-N10细 胞培养上清中HBV核酸的拷贝量。
具体实施方式
除非特别说明，本发明的术语具有本领域通常使用的含义。 本发明提供了可靶向HBV的RNA干扰靶点，包含如下序列或与其 具有至少70% (优选至少80%、 85%、 90%、 95%、 98%或更高)一致性的序列中的任何一个或几个序列SEQ ID NO: 1-42。一致性(identity)可以按照本领域公知的方法计算。适合于确 定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和 BLAST2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977) Nucl. Acid. Res. Bf3389-3402和Altschul等(1990) J. Mol. Biol. '215: 403-410。 采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST 2. 0可以用于确定本发明的 多核苷酸和多肽的序列 一致性百分数。执行BLAST分析的软件可以通 过国立生物技术信息中心为公众所获得。在其它实施方案中，所述RNA干扰靶点的序列具有在严紧条件下 或者高度严紧条件与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列 能够杂交的多核苷酸序列。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。 为了举例说明的目的，所述杂交的条件是严紧条件，例如与滤膜结合 的DNA在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45。C下杂交，之后在0. 2 x SSC/0.1%SDS中于约50 - 65'C下作一或多次洗涤；高度严紧条件，例 如与滤膜结合的核酸在6xSSC中约45。C下杂交，之后在0. lx SSC/0. 2%SDS中于约68。C下作一或多次洗涤；或本领域技术人员已知 的其它严紧杂交条件(参见例如Ausubel， F.M.等编，1989， Current Protocols in Molecular Biology, 第 1巻，Green Publishing Associates, Inc.， 和 John Wiley & Sons, Inc., 纽约,第 6. 3. 1-6. 3. 6和2. 10. 3页)。本发明还涉及在严紧条件下或者高度严紧条件与SEQ ID NO: 1-42 的任一序列、或其片段、或其互补序列能够杂交的核苷酸序列。在本发明中，siRNA和/或raiRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸 可被设计成靶向目的基因或者调节序列，例如需要抑制其表达的基因 或其调控序列，以便抑制或降低其表达。所针对的基因或其调控序列 可以是需要抑制或降低其表达的任何基因或其调控序列，例如来自病 原体的、或者参与癌症形成和发展的那些，特别是靶向HBV。本发明 的siRNA、 miRNA、核酶和反义寡核苷酸可按照常规方法设计。"依据本发明RNA干扰靶点序列获得的siRNA、 miRM、核酶和反义寡核苷酸，，指的是通过设计表达或设计合成等方式得到的siRNA、 miRNA、核酶和反义寡核苷酸，其所作用的耙序列(可以是DNA或RNA 序列)为或包含有本发明涉及的RNA干扰靶点序列。siRNA的常规设计方法可参考文献(如Reynolds A等，自然生物 技术，2004年，22巻326-330 )或Amhion、 QUgen等公司网站的乂>开 资料或实施例l中的描述。raiRNA的常规设计方法可参考文献(Lo HL 等，基因治疗，2007年，14巻1503-1512页)，选择靶序列的方法与 s iRNA的设计方法相似，例如可将设计的含有靶序列的正义链及相应的 反义链替换到pr i-microRNA上，使构建的miRM可阻止含有靶序列的 mRM的表达。核酶的常规设计方法可参考文献(Haseloff J等，自然， 1988年，334巻585-591页)，例如可将与靶序列的前后序列互补的 核苷酸序列分别置于核酶保守性核心的序列(如锤头结构)前后，使 构建的核酶能在靶序列处切割含有靶序列的核酸。反义寡核苷酸的常 规设计方法可参考文献(Matveeva 0V等，核酸研究，2003年，31巻 4989-4994页)。本发明使用的启动子可以是任何适于在细胞中表达目的基因的启 动子。可以是组成型的，也可以是诱导型的。还可以是复合启动子， 如双启动子。"可操作地连接"是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预 期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实 现表达控制序列对基因编码序列的表达控制作用。"表达控制序列"是实现基因表达所需要的控制序列，是本领域 熟知的。通常必须包括启动子，常常也包括转录终止序列，也可以包 含其他序列，如增强子序列。基因寿、达对于siRNA、 miRNA、核酶和反 义寡核苷酸等是指转录，也可以包括转录后加工；对于蛋白质编码序 列通常是指转录和翻译，产生成熟的蛋白质。本发明提供可靶向HBV的RNA干扰靶点以及根据该靶点设计的 siRNA、 miRNA、核酶和反义寡核苷酸。本发明的siRNA、 miRNA、核酶 和反义寡核苷酸包括对构成s iRNA、 miRNA、核酶和反义寡核苷酸的磷酸骨架和/或核糖和/或碱基等构成部分进行化学修饰的修饰产物，修饰方法是本领域已知的，可以为硫代修饰和/或固醇修饰和/或PEG修 饰和/或糖修饰和/或LNA^务饰等，可参见文献DykxhoornDM等，生 物医学工程年度综述，2006年，8巻377-402页；BehlkeMA等，分 子治疗，2006年，13巻644-670页。在一个具体实施方案中，本发明涉及小分子干扰核糖核酸 (siRNA),其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段 包含本发明RNA干扰靶点编码的RNA序列，反义RNA片段和正义RNA 片段能形成双链RNA，且该双链RNA能抑制HBV相应基因的表达和/或 HBV的复制和/或感染。在本发明中，术语"小分子核糖核酸"、"小分子千扰核糖核酸" 或"siRM"可互换使用，它们都指能够抑制HBV靶基因表达、包括正 义RNA片段区域和反义RNA片段区域的核糖核酸(RNA)。相关地，本发明还提供DNA序列的组合，其包括或者由编码正义 RM片段的第一 DM序列和编码反义RNA片段的第二 DNA序列组成， 所述正义RNA片段包含本发明靶序列所编码的RNA序列，反义RNA片 段和正义RM片段能形成双链RNA，且该双链RNA能(通过RNA干扰) 抑制HBV基因的表达和/或HBV的复制和/或感染。在本发明的这方面，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在 于两条不同的RNA链上或者存在于一条RM链上，例如在一个单链RNA 分子包含正义RNA片段和反义RNA片段。例如，本发明的s iRNA可以为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA 片段和反义RM片段之间的互补区域形成双链RNA区域。正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8-50个核苷酸，优 选10 - 30 (更优选15 - 27， 19-23，如19、 20或者21)个。但也可以更长或者更短。在正义RNA片段和反义RNA片段形成的双链RNA的互补区域至少 有1Q个(优选15个，更优选18个，如19、 20或者21个)碱基对。 优选地，所述正义RNA片段与反义RM片段之间的互补区域含19、 20、或21对互补碱基。在一个实施方案中，在正义RNA片段和反义RM片段之间允许有 少量的错配，例如1 - 5个，如1个或2个或3个或4个碱基错配。在 一个优选实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段完全互补。在一个实施方案中，本发明的siRNA为具有10-30 (优选，15-27，更优选19-23)对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个 (优选15个，更优选18个)碱基互补配对。在一个优选的实施方案中，正义RM片段和反义RNA片段的GC 含量为35%-75%，例如40 - 60 %、 45 - 55 %、 48 - 52 %,如约50%。在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知 人类基因和基因表达片段无显著的一致性。显著的一致性是指至少60 % ，例如70, 80、 90%—致性。优选的是，所述正义RNA片段自5，端开始的19个核苷酸序列中 的碱基为鸟噤呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数 量之和占除去3，端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35%-75% (即G/C比例)，所述反义RM片段及其一个核苷酸的突变体与已知 人类基因和基因表达片段无显著一致性。在本发明重组表达栽体的一个实施方案中，本发明重组表达载体 包含本发明涉及的RNA千扰靶点的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在动物细胞(特别是哺乳动物 细胞，如人细胞，如肝细胞或干细胞)中表达所述靶向HBV的siRNA 和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。类似地，在制备本发明改造细胞的方法中，可以通过用包含本发 明涉及的RNA千扰靼点的编码核酸序列的表达载体转化或转染或转导 细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞，优选肝细胞和干细胞) 来获得本发明改造细胞，只要最终得到的细胞包含本发明涉及的RNA 干扰靶点的编码核酸序列即可。也可以通过在所述细胞中导入包含有由本发明提供的RNA干扰靶 点获得的siRNA和/或raiRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸来获得本发明改造细胞，只要得到的细胞包含有由本发明提供的RNA干扰耙点 获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸即可。本发明的重组表达载体可以是质粒栽体，或病毒载体(例如逆转 录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等)。本发明的改造的细胞优选是哺乳动物(优选人)的细胞，优选肝 细胞，优选干细胞。所述细胞在基因组中或基因组外携带本发明涉及 的RNA干扰耙点的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列 可操作地连接，使得可在该细胞中表达所述siRNA和/或miRNA和/或 核酶和/或反义寡核*酸。本发明的重组载体和改造细胞可以用于对HBV感染的治疗。在具体的实施方案中，涉及以下内容 1.靶向HBV的RNA干扰靶点序列siHBVl :AGGACCCCTGCTCGTGTTACA(SEQ ID NO.l)s細V2 :GGACCCCTGCTCGTGTTACAG(SEQIDN0.2)siHBV3 :GACCCCTGCTCGTGTTACAGG(SEQ ID N0.3)siHBV4 :ACCCCTGCTCGTGTTACAGGC(SEQ ID N0.4)siHBV5 :AGAGTCTAGACTCGTGGTGGA(SEQ ID N0.5)siHBV6 :AGTCTAGACTCGTGG丁GGACT(SEQ ID N0.6)siHBV7 :GAGTCTAGACTCGTGGTGGAC(SEQ ID N0.7)siHBV8 :GTCTAGACTCGTGGTGGACTT(SEQ ID N0.8)s細V9 :AGACTCGTGGTGGACTTCTCT(SEQ ID N0.9)s腿VlO :GACTCGTGGTGGACTTCTCTC(SEQIDNO.10)siHBVl 1 :ACTCGTGGTGGACTTCTCTCA(SEQ ID NO.ll)siHBV12 :GATGTGTCTGCGGCGTTTTAT(SEQIDNO.12)siHBV13 :GGATGTGTCTGCGGCGTTTTA(SEQIDN0.13)s腿V14 :ATGTGTCTGCGGCGTTTTATC(SEQ ID N0.14)siHBV15 :GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT(SEQIDN0.15)siHBV16 :ATCCTGCTGCTATGCCTCATC(SEQ ID NO. 16)s細V17 :GCTGCTATGCC丁CATCTTCTT(SEQIDN0.17)s腿V18 :AAGGTATGTTGCCCGTTTGTC(SEQIDN0.18)siHBV19 :AGGTATGTTGCCCGTTTGTCC(SEQ IDN0.19)siHBV20 :GGTATGTTGCCCGTTTGTCCT(SEQIDNO.20)siHBV21 :GTATGTTGCCCGTTTGTCCTC(SEQIDN0.21)siHBV22 :ATGTTGCCCGTTTGTCCTCTA(SEQIDN0.22)siHBV23GCCGATCCATACTGCGGAACT(SEQIDN0.23)siHBV24 siHBV25 siHBV26 siHBV27 siHBV28 siHBV29 siHBV30 siHBV31 siHBV32 s細V33 siHBV34 siHBV35 siHBV36 siHBV37 siHBV38 siHBV39 siHBV40 siHBV41 siHBV42GTGTGCACTTCGCTTCACCTCGTGCACTTCGCTTCACCTCTGGCACTTCGCTTCACCTCTGCAACTTCGCTTCACCTCTGCACGGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGAGAACTCCCTCGCCTCGCAGAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGATCCATACTGCGGAACTCCTAACTCCCTCGCCTCGCAGACG(SEQIDN0.24) (SEQ ID N0.25) (SEQIDN0.26) (SEQ ID N0.27) (SEQ ID N0.28) (SEQIDN0.29) (SEQ ID NO.30) (SEQIDN0.3I) (SEQ ID N0.32) (SEQ ID N0.33) (SEQIDN0.34) (SEQ ID N0.35) (SEQIDN0.36) (SEQIDN0.37) (SEQ ID N0.38) (SEQIDN0.39) (SEQ ID NO.40) (SEQ ID N0.41) (SEQ ID N0.42)2.表达载体，优选病毒载体，可用于改造肝细胞或干细胞.可表达单个或多个siRNAs、和/或miRNAs、和/或靶向HBV的核酶的 重组病毒载体。该病毒载体在肝细胞和/或干细胞上的应用.可用于稳定表达抗 HBV的分子，如可在肝细胞和/或干细胞中特异阻断HBV复制的siRNA。3.改造的细胞，如肝细胞和干细胞，其包含有本发明涉及的RNA 干扰靼点的编码核酸序列，可表达所述的siRNA和/或miRNA和/或核酶 和/或反义寡核苷酸；或被导入了由本发明提供的RNA干扰靶点获得的 siRM和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。RM干扰耙点的序列(SEQ ID NO: 1-42)实施例实施例1.靶向HBV的siRNA表达载体质粒的设计与构建靶向HBV的RNA干扰靶点序列的设计以HBV参考序列为靼序列， 选择保守性好的区域进行步移设计siRNA序列；将初选获得的siRNA 序列在GenBank中进行BLAST检索，选择与非靶向序列具有3个或3 个以上碱基相异的序列作为候选序列。siRNA表达质粒的构建本实施例中，以pSUPER栽体(oligoengine" 公司Cat.No VEC-PBS-0001/0002 )为例构建siRNA的表达载体，具体 的构建过程可参见该公司的 pSUPER栽体实验指南 (www.oligoengine.com)，构建简要流程可见示意图1。分别合成带 有RNA干扰序列的引物，将互补引物经退火处理后连接到经Bgl II 和Hind III双酶切的pSUPER载体，经酶切和测序鉴定获得正确的 siRNA表达质粒。对照siRNA表达质粒的构建以特异乾向luciferase基因的 siRNA序列siRNA-luc (具体序列是5，-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3，)以 及不与HBV和人类基因相匹配的无关siRM序列siRNA-Nk(具体序列 是5，-TGCATCGGAAAATAGATGT-3，)作为对照。通过上述方法合成引物构 建至pSUPER载体上，经酶切和测序鉴定后分别获得相应的siRNA表达 质粒pSUPER-luc和pSUPER-Nk。实施例2.共转染实验筛选获得可抑制HBV的RNA干扰靶点pN31-N10质粒(该质粒包含约1.4倍HBV基因组(GenBank登录 号AY707087 )。构建方法简述如下哺乳动物细胞表达载体质粒 pCDNA3. 1(+) ( Invitrogen/>司Cat.No V790-20 )以Spel酶切后， 回收载体自连获得质粒pN31。分别以Nlf (ACT AGT GGA TCC TTC GCG GGA CGT CC ) /Nlr ( GAA TTC CAC TGC ATG GCC TGA G ) 、 N2f ( GAA TTC CAC TGC CTT CCA CC ) /N2r (GAT ATC CAC ATT GTG TAA ATG G )、 N3f (GAT ATC CTG CCT TAA TGC CTT TG ) /N3r ( GGG CCC ACA AAT TGT TGA CAC C)这3对引物对HBV基因组进行PCR扩增，产物分别克隆入 T载体获得pTNl、 pTN2、 pTN3。 pTN3以EcoRV和Apal酶切后获得的 片段与pN31经EcoRV和'ApaI酶切后回收的载体连接获得pN31-N3。 以Spel和EcoRI酶切pTNl回收的片段与Spel和EcoRI酶切pN31-N3回收的载体连接获得pN31-NlN3。 pTN2以EcoRI和EcoRV酶切后回收 片段，与pN31-NlN3经EcoRI和EcoRV双酶切后回收的栽体连接获得 pN31-N10)为HBV感染性克隆质粒，在转染合适的哺乳细胞后(如人 肝来源细胞HepG2细胞、huh7细胞等)具有可表达HBV病毒蛋白及病 毒粒子的能力。HBsAg是HBV的膜蛋白，通过检测细胞上清中的:U&sAg 蛋白的含量可以反映病毒蛋白和病毒粒子的表达水平，也与病毒效价 呈正相关。因此可将siRNA表达质粒分别和HBV感染性克隆质粒 (pN31-N10质粒，也可以使用其它HBV感染性克隆质粒)在Huh-7细 胞中进行共转染实验，通过检测共转染后细胞的HBsAg蛋白的表达水 平来对不同siRNA抑制HBV表达复制的效率进行检验。Huh-7细胞(Japanese Collection of Research Bioresources， JCRB0403 )培养于24孔细胞培养板中，培养基为DMEM培养基(添加 10°/oFBS, 2mM L-glutamii>e， 0. ImM MEM Non-Essential Amino Acids 及1% penicillin-streptomycin)，汇合率约为70%。 12h后每孔细 胞转染0. ljig pN31-N10质粒和l^ig的siRNA表达质粒，转染试剂为 Lipofectamine 2000 ( Invitrogen Cat. No 11668-027 ),转染方法 参见该试剂的操作指南。在共转染48h后分别收集细胞培养上清，经 梯度稀释后用HBsAg蛋白检测试剂盒(北京万泰、国药准字S 10980090 )或HBeAg蛋白检测试剂盒(北京万泰、国药准字S 10980088 ) 检测细胞培养上清中HBsAg或HBeAg蛋白的活性。以共转染了对照 siRNA表达质粒和HBV感染性克隆质粒的Huh-7细胞的培养上清中的 HBsAg或HBeAg蛋白的活性为对照，计算各siRNA对HBV的抑制效率。 通过比较，获得了 42个可抑制HBV的RNA千扰靶点。附图2显示了分 别以这42个RNA千扰靶点序列裨建获得的s iRNA表达质粒在转染入细 胞后对HBV病毒基因表达的抑制效率。下面是我们获得的可用于抑制HBV的RM千扰耙点序列siHBVl : AGGACCCCTGCTCGTGTTACA (SEQIDNO.l)siHBV2 : GGACCCCTGCTCGTGTTACAG (SEQIDN0.2)siHBV3 : GACCCCTGCTCGTGTTACAGG (SEQIDN0.3)siHBV4 : ACCCCTGCTCGTGTTACAGGC (SEQIDN0.4)s細V5 : AGAGTCTAGACTCGTGGTGGAsiHBV6 : AGTCTAGACTCGTGGTGGACTsiHBV7 : GAGTCTAGACTCGTGGTGGACsiHBV8 : GTCTAGACTCGTGGTGGACTTsiHBV9 : AGACTCGTGGTGGACTTCTCTsiHBV10 : GACTCGTGGTGGACTTCTCTCsiHBVll : ACTCGTGGTGGACTTCTCTCAsiHBV12 : GATGTGTCTGCGGCGTTTTATsiHBV13 : GGATGTGTCTGCGGCGTTTTAs腿V14 : ATGTGTCTGCGGCGTTTTATCsiHBV15 : GTGTCTGCGGCGTTTTATCATsiHBV16 : ATCCTGCTGCTATGCCTCATCsiHBV17 : GCTGCTATGCCTCATCTTCTTsiHBV18 : AAGGTATGTTGCCCGTTTGTCsiHBV19 : AGGTATGTTGCCCGTTTGTCCsiHBV20 : GGTATGTTGCCCGTTTGTCCTsiHBV21 : GTATGTTGCCCGTTTGTCCTCsiHBV22 : ATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAsiHBV23 : GCCGATCCATACTGCGGAACTsiHBV24 : GTGTGCACTTCGCTTCACCTCsiHBV25 : GTGCACTTCGCTTCACCTCTGsiHBV26 : GCACTTCGCTTCACCTCTGCAsiHBV27 : ACTTCGCTTCACCTCTGCACGsiHBV28 : GGAGGCTGTAGGCATAAATTGsiHBV29 : GAGGCTGTAGGCATAAATTGGsiHBV30 : AGGCTGTAGGCATAAATTGGTsiHBV31 : AAGCCTCCAAGCTGTCCCTTGsiHBV32 : AGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGsiHBV33 : AGAAGAAGAACTCCCTCGCCTsiHBV34 : GAAGAAGAACTCCCTCGCCTCsiHBV35 : AAGAAGAACTCCCTCGCCTCGsiHBV36 : AGAAGAACTCCCTCGCCTCGCsiHBV37 : GAAGAAGAACTCCCTCGCCTCsiHBV38 : AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGsiHBV39 : AGAACTCCCTCGCCTCGCAGAs腿V40 : GAACTCCCTCGCCTCGCAGACsiHBV41 : GATCCATAdTGCGGAACTCCTsiHBV42 : AACTCCCTCGCCTCGCAGACG(SEQ ID N0.5) (SEQ ID N0.6) (SEQ ID N0.7) (SEQIDN0,8) (SEQ ID N0.9) (SEQ ID，.IO) (SEQ ID NO.ll) (SEQ ID N0.12) (SEQIDN0.13) (SEQ ID NO. 14) (SEQIDN0.15) (SEQ ID N0.16) (SEQ ID N0.17) (SEQIDN0.18) (SEQ ID N0.19) (SEQIDNO.20) (SEQ ID N0.21) (SEQIDN0.22) (SEQIDN0.23) (SEQIDN0.24) (SEQ ID NO.25) (SEQIDN0.26) (SEQ ID NO.27) (SEQIDN0.28) (SEQ ID N0.29) (SEQ ID NO.30) (SEQ ID N0.31) (SEQ1DN0.32) (SEQIDN0.33) (SEQIDN0.34) (SEQ ID N0.35) (SEQIDN0.36) (SEQIDN0.37) (SEQ ID N0.38) (SEQIDN0.39) (SEQIDNO.40) (SEQIDN0.41) (SEQ ID NO.42)通过上面的实验，我们证明了本发明的42个RNA干扰靶点可用于抑 制HBV基因的表达。在以下的实验中，我们从上述RM干扰靶点选取了 s iHBV7 ， s iHBV12 为例，进一步分别构建可表达靶向siHBV7， siHBVU的siRM的重组病 毒载体。我们以构建可表达耙向siHBV7， siHBV12的si:RNA的重组'匱病 毒为例，构建方法见实施例3和实施例4。实施例3.表达siRNA的重组病毒表达载体的构建.我们以构建可表达靶向siHBV7， siHBV12的siRNA的重组慢病毒 表达载体为例。表达载体在该实施例中，我们使用的慢病毒系统的表达载体 pDEST-MR (专利申请号:200510112917.1;公开号CN1948475 )包 含了由Hl启动子控制的可用于表达siRNA的表达框。表达载体pDEST-siHBV7、 pDEST-siHBV12的构建方法 分别合成siHBV7、 siHBV12基因片段(这里分别包括了实施例2 中所示的RNA千扰靶点序列siHBV7 ( SEQ ID N0: 7 ) 、 siHBV12 ( SEQ ID NO: 12)作为示例，但是也可以包括其他本发明提供的RNA干扰靶点序 列)，片段的5，端添加Age I位点，3，端添加Sma I位点；基因片段 经Age I、 Sma I酶切后与经同样酶切的pDEST-MR质粒连接，构建获 得表达栽体pDEST-siHBV7、 pDEST-siHBV12。实施例4.表达siRNA的重组病毒的构建我们以构建可表达靶向siHBV7， siHBV12的siRNA的重组慢病毒 为例。除可表达靶向HBV的siRNA的表达载体质粒，构建重组慢病毒所 需的其它质粒为pLPl、 pLP2、 VSVG,从Invitrogen^^司购买，品名 为pLenti4/V5-DEST Gateway Vector Kit,货号V469-10。重组慢病毒的制备方法(1 )用氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法大量提取四种质粒 pVSVG、 pLPl、 pLP2、表达载体质粒(如该实施例中作为示例的pDEST-siHBV7质粒、pDEST-siHBV12质粒)(提取方法参见《分子克 隆实验指南》，J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社，2002 );(2 ) 293FT细胞(Invitrogen， Catalog* R700-07 )培养于DMEM 培养基中(添力口 10%FBS, 2mML-glutamine, 0. ImM MEM Non-Essent ial Amino Acids及1% penici11 in-streptomycin);(3) 将293FT细胞培养于直径10cm的细胞培养板上，汇合率约 70%。 12h后用磷酸钙转染方法介导lOpg pLPl、 lOpg pLP2、 lOjig pVSVG、 20jtg表达载体质粒共4种质粒进行共转染(方法参见《分子 克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社，2002 );(4) 转染48h后收集细胞培养上清，0. 45nm的滤膜过滤；用 SW28转头(BECKMAN公司)以25， 000 rpm在4。C离心90min;(5) 弃去上清，加50(VL PBS溶解沉淀；(6) 分装病毒收集液，贮存于-8(TC备用。由此获得可分别表达靶向siHBV7、 siHBV12的siRNA的重组慢病 毒，分别称为Lenti-siHBV7、 Lenti-siHBV12。实施例5.靶向HBV的siRNA通过表达载体质粒导入HepG2-NlG细胞 株对HBV的抑制作用HepG2-N10细胞林(潘金水等，世界华人消化杂志，2006年，I4 巻1172-1177页)为人肝细胞来源，携带有HBV基因组，可表达HBV 抗原蛋白和HBV病毒粒子，我们应用HepG2-N10细胞验证siRNA对HBV 的抑制效果。我们以可表达靶向HBV的siRM的表达栽体质粒为例(在本实施 例中，我们以可分别表达靶向siHBV7、 siHBV12的siRNA的表达载体 质粒pSUPER-siHBV7、 pSUPER-siHBV12作为示例，但是也可以包括其 他可表达靶向本发明提供的RNA干扰靶点的siRNA的表达载体质粒)， 说明靶向HBV的siRNA通过表达载体质粒转染细胞的方式，改造细胞 使细胞获得抑制HBV基因表达和复制的能力。实验方法将siRM表达质粒pSUPER-siHBV7、 pSUPER-siHBV12在HepGlNlO中进行转染实验，通过检测转染后细胞上清中的HBsAg 与HBeAg蛋白活性和HBV DNA拷贝数来对不同siRNA抑制HBV表达复 制的效率进行检验。HepG2-Nl0培养于24孔细胞培养板，培养基为DMEM 培养基(添力口 10%FBS, 2mM L-glutamine， 0. ImM MEM Non-Essential Amino Acids及1% penicillin— streptomycin)，、)匚合率纟勺为80%。 12h后每孔细胞转染2jig的siRNA表达质粒，转染试剂为 Lipofectamine 2000 ( Invitrogen Cat. No 11668-027 )，转染方法 参见该试剂的操作指南。在转染48h后分别收集细胞培养上清，经梯及应用乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量试剂盒(上海科 华生物工程股份有限公司。、国药准字S 20030059 )检测细胞培养上清 中HBV DNA的拷贝量。实验对照为未转染的HepG2-N10细胞和转染了 对照siRNA表达质粒pSUPER-Nk的HepG2-NlQ细胞。结果如图3、图4所示，pSUPER-siHBV7、 pSUPER-siHBV12转染 后的HepG2-N10细胞均可显示出抑制HBV表达和复制的能力。这表明 在携带有靶向HBV的siRNA表达序列的表达载体质粒转染后的细胞中 抗HBV的siRNA在这些细胞中获得了表达，从而抑制HBV的表达和复 制。实施例6.靶向HBV的siRNA通过重组病毒导入HepG2-NlG细胞林对 HBV的抑制作用我们以可表达靶向HBV的siRNA的重组慢病毒为例(在本实施例 中，我们以可分别表达靶向siHBV7、 siHBV12的siRNA的重组慢病毒 LenU-siHBV7、 Lenti-siHBV12作为示例，但是也可以包括其他可表 达靶向本发明提供的RNA干扰靶点的siRNA的重组病毒)，说明靶向 HBV的siRNA通过重组病毒转导细胞的方式，改造细胞使细胞获得抑 制HBV基因表达和复制的能力。实验方法'f曼病毒Lenti-siHBV7、 Lenti-siHBV12以moi = 40分 别转导HepG2-N10细胞，600g离心60min后换液；带有乾向luciferase基因的siRM表达元件的对照重组慢病毒Lenti-luc(靼向lucifezase 基因的siRNA表达元件序列同实施例1;按照实施例3和4的方法制 备该对照病毒)以moi = 40转导HepG2-N1Q细胞，600g离心60rain后 换液；转导后的HepG2-N10细胞在37。C培养，在72h后采集细胞培养 上清，用HBsAg蛋白检测试剂盒检测细胞培养上清中HBsAg蛋白的含 量。同时，应用乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)焚光定量试剂盒检测细 胞培养上清中HBV DNA的拷贝量。实验对照为未转导的HepG2-N10细 胞和对照重组慢病毒Lenti-luc转导的HepG2-N10细胞。结果如图5、图6所示，重组慢病毒Lenti-siHBV7、 Lenti-siHBV12 转导后的HepG2-NlO细胞均可显示出抑制HBV表达和复制的能力。这表 明在携带有靶向HBV的SiRM表达序列的重组慢病毒转导后的细胞中抗 HBV的siRNA在这些细胞中进行了表达，从而抑制HBV的表达和复制。实施例7.靶向HBV的siRM在小鼠模型体内对HBV的抑制作用实验动物SPF级Balb/c小鼠，为7 ~ 8周龄，体重约为18 ~ 22g。 每组6只，重复3次。在本实施例中，我们以可分别表达靼向siHBV7、 siHBV12的siRNA 的表达载体pSUPER-siHBV7、 pSUPER-siHBV12作为示例，i兌明靶向HBV 的siRM导入活体小鼠细胞后，可使细胞获得抑制HBV的能力。实验方法将siRNA表达质粒pSUPER-siHBV7 ( 40 ji g/只)、 pSUPER-siHBV12 (40jag/只)，对照质粒pSUPER-Nk (40pg/只)分 别与pN31-N10质粒(20jjg/只)通过小鼠尾静脉高压注射方法 (hydrodynamic transfection)进行共注射，注射总体积约2ml，在 5秒内注射完毕。在注射前及注射后每天采集小鼠血清，用HBsAg蛋 白检测试剂盒检测小鼠血清中HBsAg蛋白的含量，用乙型肝炎病毒核 酸扩增(PCR)荧光定量碌剂盒检测小鼠血清中HBVDM的拷贝量。实 验对照为正常的Balb/c小鼠和仅注射pN31-N10质粒的Balb/c小鼠和 共注射pN31-N10质粒与对照siRNA表达质粒pSUPER-Nk的Balb/c小 鼠0检测结果(图7、图8)显示，注射表达粑向HBV的siRNA的表达 质粒的小鼠可抑制HBsAg的表达，同时也抑制了小鼠血清中的HBV DNA 栽量。这表明在携带有靶向HBV的siRNA表达序列的表达载体转导后 的体内细胞中产生的抗HBV的siRNA可抑制HBV的表达和复制。实施例8.化学合成的siRNA对HBV的抑制效果我们从上述RNA干扰耙点选取了 siHBV7， siHBV12为例(这里分 别包括了实施例2中所示的RNA干扰靶点序列siHBV7(SEQIDNO:7)、 siHBV12 (SEQIDN0:12)作为示例，但是也可以包括其他本发明提供 的RNA干扰靶点序列)，合成了可分别靶向siHBV7、 siHBV12的siRNA， siRM的正义RNA片段分别包含本发明靶序列siHBV7( SEQ ID NO: 7 )、 siHBV12 ( SEQ ID NO: 12 )所编码的RNA序列，反义RNA片段可与正义 RM片段互补形成双链RNA (在本实施例中反义链与正义链完全互补， 但是也可以允许反义链和正义链有少量的错配，如1个或2个或3个 或4个)，在正义RNA片段和反义RNA片段的3，末端分别添加dTdT。 上述siRM分别命名为siR-HBV7和siR-HBV12。同时，合成了靼向不 与HBV和人类基因相匹配的无关RNA干扰乾点siRNA-Nk的siRNA (siR-Nk) ( siRNA-Nk的序列同实施例1 )作为对照。siRNA的合成方法简述如下采用p-乙腈亚磷酸胺化学合成法， 使用全自动DNA合成仪分別合成siRNA的正义RNA片段和反义RNA片 段，合成好的正义RNA片段和反义RNA片段等摩尔比混合，在PCR仪 上经过变性、退火过程，得到所需的siRNA。实验方法将合成的siR-HBV7、 siR-HBV12和siR-Nk分别转染 HepG2-N10细胞，通过检测转染后细胞上清中的HBsAg与HBeAg蛋白 活性和HBV DNA拷贝数来对不同siRNA抑制HBV表达复制的效率进行 检验。HepG2-N10细胞培养于24孔细胞培养板，汇合率约为80%。 12h 后每孔细月包转染50pM的jiRNA，转染试剂为Lipofectamine 2000, 转染方法参见该试剂的操作指南。在转染48h后分别收集细胞培养上 清，用HBsAg检测试剂盒检测细胞培养上清中HBsAg蛋白的活性，及应用乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量试剂盒检测细胞培养上清 中HBV DNA的拷贝量。实验对照为未转染的HepG2-N10细胞和转染了 对照siR-Nk的HepG2-N10细胞。结果如图9、图10所示，合成的siR-HBV7、 siR-HBV12转染 HepG2-N10细胞后，均可抑制HBV表达和复制。实施例9.化学合成并经修饰的siRNA对HBV的抑制效果我们从上逸RNA干扰靶点选取了 siHBV7， siHBV12为例(这里分 别包括了实施例2中所示的RNA干扰靶点序列siHBV7(SEQIDNO:7)、 siHBV12 (SEQ IDNO: 12)作为示例，但是也可以包括其他本发明提供 的RNA干扰乾点序列)，合成了可分别耙向siHBV7、 siHBV12的siRNA， siRNA的正义RNA片段分别包含本发明耙序列s iHBV7 ( SEQ ID NO: 7 )、 siHBV12 (SEQ ID NO: 12)所编码的RNA序列，反义RNA片段和正义 RNA片段互补形成双链RNA (在本实施例中反义链与正义链完全互补， 但是也可以允许反义链和正义链有少量的错配，如1个或2个或3个 或4个)，在正义RNA片段和反义RNA片段的3，末端分别添加dTdT。 同时合成过程中分别采用了不同的修饰方式。其中，siRpo-HBV7和 siRpo-HBV12为经过2，-OMe修饰(2，-甲氧基修饰)和磷酸化修饰的分 别乾向siHBV7、 siHBV12的siRNA (合成方法采用卩-乙腈亚磷酸胺 化学合成法，使用全自动DNA合成仪分别合成siRNA的正义RNA片段 和反义RNA片段，其中正义RNA片段和反义RNA片段的5，端三个碱基 和3，端dTdT前面的三个碱基用2，-0Me修饰的单核苷酸合成，反义RNA 片段的5，末端碱基进行磷酸化处理。合成好的正义RNA片段和反义RNA 片段等摩尔比混合，在PCR仪上经过变性、退火过程，得到所需的 siRNA) ; siRpoC-HBV7和siRpoC-HBV12为经过2，-0Me修饰和磷酸化 修饰和固醇修饰的分别耙向siHBV7、 siHBV12的siRM (合成方法同 上，不同的地方是在合成正义RM片段时，3，端dTdT前面的三个碱基 不进行2，-0Me修饰，用含有胆固醇-氨基己酸-吡咯烷 (cholesterol-aminocaproic-acid-pyrrolidine )接头的Glass担体作为合成支持物，在3，端dTdT前面的碱基通过硫代磷酸酯连接胆 固醇基团。其余步骤均与上述合成siRpo-HBV7和siRpo-HBV12的方法 相同)。同时，分别合成了靶向不与HBV和人类基因相匹配的无关RNA 干扰靼点siRNA-Nk的并经同样修饰的siRNA( siRpo-Nk和siRpoC-Nk) 作为对照。这里分別色括了对靶向实施例2中所示的RNA干扰靶点序 列siHBV7 ( SEQ ID NO: 7 ) 、 si丽12 ( SEQ ID NO: 12 )的合成的siRM 进行2'-0Me修饰和/或磷酸化修饰和/或固醇修饰作为示例，但是也可 以包括对耙向其他本发明提供的RNA干扰靶点序列的合成的siRNA进 行其它不同方式的修饰。
实验方法将合成的siRpo-HBV7、 siRpo-HBV12、 siRpoC-HBV7、 siRpoC-HBV12、 siRpo-Nk、 siRpoC-Nk分别转染HepG2-N1Q细胞，通 过检测转染后细胞上清中的HBsAg与HBeAg蛋白活性和HBV DNA拷贝 数来对不同siRNA抑制HBV表达复制的效率进行检验。HepON10细 胞培养于24孔细胞培养板，汇合率约为80%。 后每孔细胞转染 50pM的siRNA，转染试剂为Lipofectamine 2000，转染方法参见该试 剂的操作指南。在转染48h后分别收集细胞培养上清，用HBsAg检测 试剂盒检测细胞培养上清中HBsAg的活性，及应用乙型肝炎病毒核酸 扩增(PCR)荧光定量试剂盒检测细胞培养上清中HBV DNA的拷贝量。 实验对照为未转染的HepG2-N10细胞和转染了对照siRpo-Nk、 siRpoC-Nk的HepG2-N10细胞。
结果如图11、图12所示，合成的siRpo-HBV7、 siRpo-HBV12、 siRpoC-HBV7、 siRpoC-HBV12转染入HepG2-N10细胞后，均可抑制HBV 表达和复制。
本领域的技术人员应当明了 ，尽管为了举例说明的目的本文描述 了本发明的具体实施方案，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明 的精神和范围。因此，本发明的具体实施方案和实施例不应当视为限 制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的 所有文献均完整地并入本文作为参考。序列表
<110〉厦门大学
〈120〉可用于乙型肝炎病毒感染治疗的RNA干扰耙点
<130〉 IDC080012
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<170〉 Patentln version 3.3
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aactccctcg cctcgcagac g 2权利要求
1.靶向HBV的RNA干扰靶点序列，其选自(1)SEQ ID NO1-42中任何一个所示的序列，或者(2)与(1)中序列具有至少70％(优选至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列，或者(3)在严紧条件下或者高度严紧条件与(1)中序列能够杂交的核苷酸序列，或者(4)与(1)中序列仅有1-3个(优选1-2个，更优选1个)核苷酸不同的序列；或者(5)上述序列的片段或者互补序列。
2. 包含权利要求1的序列的核酸构建体或载体如表达载体。
3. 依据权利要求1所述的RNA干扰靶点序列获得的、能够抑制 HBV相应基因的表达和/或HBV的复制和/或感染的siRNA或miRNA或 核酶或反义寡核苷酸。
4. 一种重组表达载体，其可表达权利要求3的siRNA或miRNA 或核酶或反义寡核苷酸。
5. 权利要求4的重组表达载体，其包含耙向HBV的siRM或raiRNA 或核酶或反义寡核苦酸的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控 制序列可操作地连接，使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞，如 人细胞，优选肝细胞)中表达所述的siRNA或miRNA或核酶或反义寡 核苷酸。
6. 权利要求4或5的重组表达载体，其是质粒载体或病毒载体， 例如逆转录病毒载体，包括慢,病毒载体。
7. 转化或转染或转导了权利要求4-6任一项的重组表达载体的 分离的细胞。
8. —种改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞，优选 肝细胞和干细胞)，其可表达或包含有权利要求3的siRNA或miRNA 或核酶或反义寡核普酸。
9. 权利要求8的改造的细胞，其在基因组中或者基因组外携带包含权利要求1中所述的RNA干扰靶点序刮的编码核酸序列，这些编码 核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在该细胞(包括动物 例如哺乳动物优选人的细胞，优选肝细胞和干细胞)中表达所述siRNA 或miRNA或核酶或反义寡核苷酸。
10.制备权利要求8 - 9任一项的细胞的方法，包括用权利要求4 -6的重组表达载体转化或转染或转导细胞(包括动物例如哺乳动物 优选人的细胞，优选肝细胞和千细胞)。
11. 权利要求10的方法，其中细胞是分离的，例如从HBV感染者 或者正常个体分离的，或者是在体的。
12. DNA序列的组合，其包括或者由编码正义RNA片段的第一 DNA 序列和编码反义RNA片段的第二 DNA序列组成，所述正义RNA片段包 含权利要求1的靶点序列所编码的RNA序列，反义RNA片段和正义RNA 片段能形成双链RNA，该双链RM能抑制HBV基因的表达和/或HBV的 复制和/或感染。
13. 小分子干扰核糖核酸(siRNA),其包括正义RNA片段和反义 RNA片段，所述正义RNA片段包含权利要求1的靶点序列编码的RNA 序列，反义RNA片段和正义RNA片段能形成双链RNA，且该双链RNA 能抑制HBV相应基因的表达和/或HBV的复制和/或感染。
14. 权利要求1所述的RM干扰靶点序列、或权利要求2的核酸 构建体或载体、或权利要求3的siRNA或miRM或核酶或反义寡核苷 酸、或权利要求4-6任一项的重组表达载体、或权利要求7-9任一 项的细胞、或权利要求12的DNA序列组合、或权利要求13的siRNA 在制备治疗HBV感染或者HBV患者或者抑制HBV复制或者HBV基因表 达的药物中的用途。
15. 权利要求1所述的RNA干扰靶点序列、或权利要求2的核酸 构建体或载体、或权利要求3的siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷 酸、或权利要求4-6任一项的重组表达载体、或权利要求7-9任一 项的细胞、或权利要求12的DM序列组合、或权利要求13的siRNA 在筛选抗HBV药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及可用于乙型肝炎病毒感染治疗的42个不同的靶向HBV的RNA干扰靶点，可用于制备可用于乙型肝炎病毒感染治疗的药物。本发明提供了可用于表达靶向HBV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸的重组表达载体。本发明涉及具有抑制HBV病毒基因表达能力的可表达和/或被导入了以本发明提供的RNA干扰靶点为依据获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸和/或药物的细胞。
文档编号A61K31/713GK101603042SQ20081011068
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月13日 优先权日2008年6月13日
发明者夏宁邵, 军 张, 张雅丽, 通 程, 季 苗, 蔡毅君 申请人:厦门大学;养生堂有限公司