专利名称：：一种新的三萜皂苷类抗肿瘤化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是从植物中分离有生物活性的化合物，具体地说是从九节龙中提取分离到的一种新的三葙皂苷类抗肿瘤化合物。技术背景九节龙(^4&^—/&1久1)0)为紫金牛科紫金牛属植物，分布于中国南部地区，具有淸热解毒的功效，药用全草。紫金牛属植物主要含有三絡皂苷化合物，且被证明是其主要有效成分。已有人对九节龙中的三菘皂苷进行过研究,并报道分离鉴定了3种原生的三萜皂苷(指非经过酸水解等4t学方法而获得的三萜皂苷)，即九节龙皂苷I(aidipusflloside1)^九节龙皂苷II(arfipusfflosiden)和一个未命名的四糖三萜皂苷，其中九节龙皂苷II作为新化合物被报道过2次(张淸华，王晓竭，缪振春，等.药学学报，1993,28(9):673^678和缪振春，冯锐，周永新，等.波谱学杂志，1999，16(5):395-402>,但从化学结构上看其实是同一个化合物。这3种化合物被证实对多种肿瘤显示较强的抑制作用。但相比于紫金牛属其他植物，对九节龙的三菘皂苷类化学成分的研究尚不充分。我们对九节龙中的三萜皂苷进行了系统分离，获得了一种新的三萜皂苷类化合物，其化学结构和抗肿瘤活性未见有过报道。I类创新药救单体化合物药物辦制的大量实践和报道证实化学结构决定药理作用，新的化学结构很可能预示着更强的生物活性、更低的毒副作用或更适于在临床使用。虽然1993年已报道了九节龙龟苷I和九节龙皂苷n的结构和提取分离，但与已从紫金牛属其他植物分离获得大量的三裕皇苷化学成分相比，对九节龙的三萜龟苷类成分的研究尚不充分，而且也未见到有将这3种三萜皂苷成分进行更深入的新药开发的报道，说明3种已知成分在抗肿瘤新药开发方面还是遇到了一些障碍。因此迫切需要对九节龙的化学成分进行更深入研究.从中获得更多新化合物特别是具有较强,瘤作用的新化合物。
发明内容本发明的目的旨在m^具有iyt瘤作用的、提取分离自九节龙的一种新的三ss龟苷类抗胂瘤化合物。本发明的目的是这样实现的，一种新的三箱皂苷类抗肿瘤化合物，其特征是式l所示化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式i上述结构其化学名称为3^0很-1>吡喃葡萄糖基<1-*2》很-1>吡喃木糖基<1—2Hp-D"吡喃葡萄糖基"(l—3)^"D"吡喃葡萄糖基"(1—3)hp-D"吡喃葡萄糖基"(l_^4)}《丄-吡喃阿拉伯糖基i-16a-羟基-13fl,环氧-齐墩果烷-30"醛(3HMp-I>glucopyranosyKl—2HN>xylopyranosyKl~*2Hp-D"glucopyranos>i"(l~*3)"P-D"glucopyranosyl"(l~*3)l"P-D"glucopyranosyKl"^4)》-a-Lrarabinqpyfanosylj-16a-hydnwy-13pj28"epoxy"Oleanan-30-al),是从九节龙中提取分离的新的三菘皂昔类化合物，以下简称其为HEOA。所述的从九节龙中提取分离Jd^三薛皂苷类化合物的方法，其步骤如下(1)提取将九节龙原料粉碎后，按重量体积比加入35倍原料重的甲醇或乙醇，经回流提取，共提取3次，每次24小时，合并提取液，回收溶剂，得甲醇或乙酵提取物，提取物分散于按重量体积比510倍的水中，分別用和水等体积的石油醻萃取3次，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收J^剂后得到总皂苷提取物(2)分离-上述总帛苷应用硅胶柱层析，以^比为7:2:16.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，薄层层析检測，收集含式I化合物HEOA的流份.再用SephadexLH-20Jl^柱层析，以WK比为2:31:I的甲醇-水洗脱以除去多糖和其质，合并含式I化合物HEOA的流份，再经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为2:83:7的甲醇-水或体积比为1.5:8_52.5:7.5的乙腈-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合物HEOA的纯品。所述的式I化合物HEOA对HL"60人白血病、U251MG人恶性胶质瘤等8种不同的肿癍细胞株均显示显著的抑制作用，半数有效抑审欣度(IC邻值难0.75938(iniol/L之间。本发明的特点是.-式l化合物HEOA与从九节龙中提取分离的3种已知三菘皂苷的化学结构均不相同，也未见从天然界分离得到或通过合成的手段得到过。而式I化合物HEOA对多种不同肿瘤细胞株的显著抑制作用也表明其可以进一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。对九节龙总皂苷的提取方法虽然是阜苷类成分的常用提取方法，但并未见用于含式I化合物HEOA的总龟苷的提奴。已报道的对九节龙单体是苷成分的分离方法中，未见采用SephadexLH-20,柱层析，而该层析方法的应用对于除去多糖和其^k杂质有显著作用，可以高度富^tI化合物HEOA,这也是本发明能够获得在九节龙中含量较少的式I化合物HEOA的重要原因。本发明从九节龙中通过提取、分离纯化得到式t化合物HEOA,该化合物可用于制备治疗上述痛症的药物，为研制新的抗肿瘤药物提供了先导化合物。下面结合实施例附图对本发明做进一步说明.图1是化合物的提取和分离工艺MS图。具体实施方式下面结合具体实施例来说明本发明的实质。应理解，这些实施例仅用于证实本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所皿的IH^。化合物的提取和分离实施例化^ft的提取和分离工艺iSig如图l所示,实施例l采集四川夹江县的九节龙全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取3公斤，加入10升浓度为95%的乙醇进行回流提取,共提取3次，每次2小时。合并提取液，减压回收Jt娵减压回收即本行业通常所采用的袖滤方法，下同)，得乙醇提取物I20克。提取物分散于I升水中，用石油醚萃取3次，每次l升，萃取后的水相再用正丁酵萃取3次，每次l升，合并正丁醉萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物10克，将总皂，行硅胶柱层析，以諷仿-甲酵-水混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为7:3:1和6.53.5:1(均取下层作为洗脱液)，按100mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检靴薄层展开溶剂为氣仿-甲酵-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105TC加热显色)，收集含如下式I化合物HEOA的第13~15流份，减压蒸干溶剂后得0.9克样品。样品进行SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱(100克)层析，以体积比为2:3的甲^水混合溶剂洗脱，薄层层析检测，合并含如下式1化合物HEOA的流斷120毫克)，再经高效液相色谱仪(岛津公司)分离纯化(HPLC条件为大连依利特公司SinoChromODS"BP色谱柱10x250mm，25%甲醇为流动相，2mL/min,室温，206nm紫外检翻)，得到如下式1化合物HEOA的纯品63毫克。式I上述结构其化学名称为邓^0《p-IX吡喃葡萄糖基"(1—2MP-D-吡喃木糖基"(1—2HP-D"吡喃葡萄糖基^—3)"P"D"妣喃葡萄糖基"0—3)h^D"吡喃葡萄糖基<1^4"sx-L-吡喃阿拉伯糖基卜16a-羟基-13p28"环氧-齐墩果烷-30"醛(3p^Hp-D"glucopyranos^"(1—2HN>xyk>pyranosyl~(l~2HP~D~g!uoopyranosyKl~3>^-D~gluoo{iyranosyl~(l—3)W-D~g)ucopyrano—(I—4"a-Iyarabinoftyranos^}-16a-hydn、xy-l3P^28^epoxyolean油-30^a])，是从九节龙中提取分离的新的三裕皂苷类化合物，简称其为HEOA。实麄例2:采集四川夹江县的九节龙全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取l公斤，加入4升甲醇进行回流提取，共提取3次，每次3小时，合并提取液，减压回收溶剂，得甲醇提取物30克。提取物分散于200毫升水中，用石油醸萃取3次，每次200毫升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次200毫升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物3克.将总皂苷进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水混合^^进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为7:2:1，7.3:1和6.5:3.5:1(均取下层作为洗脱液)，按50mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检湖(薄层展开溶剂为氣仿-甲醇-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的琉酸-甲酵溶液，喷显色剂后于105TC加热显色)，收集含实施例1式1化合物HEOA的第1214流份，减压蒸干溶剂后得03克样品。样品进行ScphadexLH-20葡聚糖凝胶掛50克)层析，以体枳比为1:1的甲&水混合溶剂洗脱，薄层层析检測，合并含实施例1式I化合物HEOA的流份(30毫克)，再经高效液相色谱仪(岛津公司份离纯化(HPLC条件为大连依利特公司SinoChromODS"BP色谱柱10x250mm,20%乙腈为流动相，流速2mL/min,室温，206nm紫外检劂)，得到实施例1式I化合物HEOA的纯品27毫克。实施例3:采集四川夹江县的九节龙全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取l公斤，加入5升浓度为95%的乙酵进行回流提取，共提取3次，每次4小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物32克*提取物分散于160毫升水中，用石油醚萃取3次，每次160毫升-萃取后的水相再用正丁酵萃取3次，每次160毫升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物3.5克-将总皂皿行硅胶柱层析，以氯仿-甲^水混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为7:3:1和6.5:3.5:l(均取下层作为,液)，按35mL为一个流份接收，并用#^薄层层析检溯(薄层展开溶剂为氯仿-甲醇-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为f^比为1:4的琉酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105X:加热显色)，收集含实施例1式I化合物HEOA的第1315流份，减压蒸千溶剂后得032克样品。样品进行SephadexLH-20葡聚糖繊柱(50克展析，以柳比为2:3的甲醇-水混合溶剂麵，薄层层析检测，合并含实施例I式l化合物HEOA的流份(43毫克)，再经高效液相色谱仪(岛津公司)分离纯化(HPLC条件为大连依利特公司SfaioChromODSrBP色谱柱10x250mm，30%甲醇为流动相，流速2mL/min,206mn紫外检溯)，得到实施例1式I化^ftfHEOA的纯品22毫克。化^ftf的结构鉴定实施例1式l化合物HEOA为白色无定形粉末，分子式为CHW032，熔点为265~266效°C;[o]D-23_2°(c0.15,MeOH),Uebermann-Burehaid反应和Molish反应均为阳性。对化合物进行酸水解和糖衍生物的分析，具体方法为采用2mol/L三氟乙酸进行酸水解并常法制备水解产物(糖部分)的三甲基硅醸化衍生物，以L^ChirasB-Val气相色谱柱(25mx0.32nun.)进行GC分析，标准瞎制备的相应衍生物作对照，标准糖衍生物的色谱保留时间分别为8.沐9.60min(EMH拉伯糖X8.76,9.64min(L-阿拉伯糖X10.84，11.86min(1>木糖)，10.87，11.91min(L"木糖X14.56min(IMS錄瞎X!4.50min(Wi€>,可以看到，采用J^M能够分辨不同绝对构型的糖-分析表明本发明化合物的寡糖链由3种糖基组成，即L-阿拉伯糖，1>木糖和1>,,组成比约为1丄4。通过高分辨质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱的综合解析，确定了该化^的结构。其波谱数据如下ESI-MS(正离子模式)w/z:1407[MhNar;ESI-MS(负离子模式)m/r1383[M-HT;MS/MS(负离子模式，母离子为m/2l383)m^:1251[1383-Xy!T，1221[1383-Gter,10粉[122卜Xyir,1059[122卜Glcr,927[1089~<31;]",765[927-Gk一，603[765"Gkr，4603-Arar([aglyconc-Hr);HR-ESI-MS(正离子模式)m/r1407.6410P^fNar(计算值CwH,"NaOj2:1407.6408),其'H和"C核磁共,据见表1。表1实施例1式1化合物HEOA的'H和'3C核磁共振数据(測试溶剂慨代耽啶)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Ara:阿拉伯糖，(He:TO糖(其中，Gfcl连接于Ara的2位，GkII连接于Aia的4位，CHcm连接于Gkll的3位，GtelV连接于Glcm的3位)，Xyl:木糖，J:偶合常数。化合物体外鰣癯作用的研究对实施例1式I化合物HEOA进行了体外抗肿瘤试验，试验所采用的细胞株分别为HL"60人白血病、A-549人肺痛、MKN-28人胃癌、HCT-116人结肠癌、BEL-7402人肝痛、MDA-Mfr435人乳腺癌、K-562人白血病、IC5IMG人恶性胶质瘤细胞。其中，对前6种肿瘤细l&采用SRB法，对后2种肿瘤细H&采用MTT法測试。(1)SRB法賴试根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以邻Ml/孔接种于邻孔培养板，貼壁生长24小时，加不同浓度的本发明化合物IOniy孔，每个浓度设3个复孔，并设生理盐水对照和无细胞调^l。肿瘤细胞在37TC、5%C02条件下培养72小时，然后倾去培养液，用l(m冷TCA固定细胞，41C放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然，。然后加入由"4醋酸配制的浓度为4mg/mL的SRB(Sigma公司滩液100pli孔，室温中染色I5分钟，去上淸液，用1%醱酸洗潘5次，空气中千燥，加入150nL/孔的Tris溶液。将96孔坂置标仪上賴定各孔在520鹏处的吸光度(OD难。按下式计算被測物对肿瘤细胞生长的抑制率肿瘤抑制率-(l—治疗组OD值/对照组OD值)X100%半数有效抑制浓度1Qo值采用Logit法计算。试验结果见表2。(2)MTT法獮试根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以4000个细J!S/孔接种于邻孔培养板，貼壁生长34小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度本发明化合物的溶液200jiL,每个浓度设3个复孔，并设生理盐水对照和无细胞调零孔。肿癯细胞在37t:、5%CCV95%2条件下培养48小时，然后加入PBS溶解的浓度为I0mg/mL的MTT(Sigma公司)20jiL,在同样条件下孵育4小时。最后，每孔加入200ML的二甲基亚讽,混匀。将96孔板置瞎标仪上測定各孔在490nm处的吸光度(OD)值。按下式计算被測物对肿瘤细胞生长的抑制率肿瘤抑制率-(l一治疗组OD值/对照组OD值)X100%丰数有效抑制浓度ICso值采用Logit法计算。试验结果见表2。_表2实施例1式I化合物HEOA对肿瘤细胞的抑制作用_肿瘤Htr0A-5MKN-2SHCT-1WBEL>72MDA-MB>435LT251MG细胞株0.75±0-20t33t0jn9_J8±2,29L7i:0-56a^SiOJS&15±1.730.88±0.142>57±01Onnol/L)权利要求1.一种新的三萜皂苷类抗肿瘤化合物，其特征在于化学结构式如下式I上述式I结构其化学名称为3β-O-{β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-{β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)}-α-L-吡喃阿拉伯糖基}-16α-羟基-13β，28-环氧-齐墩果烷-30-醛(3β-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-{β-D-xylopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-(1→4)}-α-L-arabinopyranosyl}-16α-hydroxy-13β，28-epoxy-oleanan-30-al)，以下简称其为HEOA。2.权利要求1所述一种新的三菘皂苷类,瘤化合物，其制备方法是-(0提取以九节龙为原料，原料经粉碎后，按重量^l比加入35倍原料重的甲醇或乙醇，回流提取，共提取3次，每次24小时；合并提取液，回收溶剂，得甲醇或乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比510倍的水中，分别用和水等体积的石油醸萃取3次，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂后得到总皂苷提取物；(2)分离上述总皂苷应用硅胶腿析，以体积比为7:2.1~6.53.5:1的氯仿-甲^水混合溶剂洗脱，薄层层析检溯，收集式l化合物HEOA的流份，再用SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比为2:31:1的甲昏水洗脱以除去多糖和其他杂质，合并含式I化合物HEOA的的流份,再经高效液相色谱仪分离纯化,体积比为2:83:7的甲^水或体积比为1.5:8.52.5:7.5的乙腈-水混合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合物HEOAW纯品-3.权利要求l所述一种新的三絡皂苷类抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种新的三萜皂苷类抗肿瘤化合物，分子式C<sub>64</sub>H<sub>104</sub>O<sub>32</sub>。采用高分辨质谱和二维核磁共振谱等光谱技术，确定了该化合物的化学结构。体外抗肿瘤试验表明，该化合物对HL-60人白血病和U251MG人恶性胶质瘤等8种肿瘤细胞有明显的抑制作用。本发明可为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，可望成为治疗癌症的药物。文档编号A61P35/00GK101333242SQ20081015053公开日2008年12月31日申请日期2008年8月4日优先权日2008年8月4日发明者张淑瑜,文爱东,汤海峰,王晓娟,冶田申请人:中国人民解放军第四军医大学