专利名称：：聚核苷酸组合物佐剂的制作方法
技术领域：
：本发明属生物医药领域，涉及聚核苷酸组合物佐剂，即聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸PIC、卡那霉素组合物佐剂。提供了安全、有效，低廉的佐剂及免疫原组合物，包括佐剂的组分，含量，免疫原物质，免疫途径，免疫对象等。用于人和动物的预防性疫苗，治疗性疫苗，抗毒素，抗血清的制备。
背景技术：
：免疫佐剂随着疫苗的研究而发展起来。1926年，Glermy用铝盐作为佐剂应用于白喉类毒素；1937年，Freimd发展了福氏完全佐剂。佐剂与抗原同时应用，能非特异地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，增强该抗原的免疫原性，而佐剂本身并无抗原性。佐剂能提高疫苗质量，降低成本，提高产量。不仅细胞内寄生病原体疫苗，重组弱免疫原性疫苗需要佐剂，传统纯化疫苗同样需要佐剂。广为应用的铝佐剂只能诱导体液免疫，不能有效地诱导细胞免疫，且对蛋白亚单位等疫苗诱导抗体产生的能力较弱，故新佐剂的研究异常活跃。目前，数百种天然和合成的物质被证实有佐剂活性，因为安全性，成本等问题，只有铝佐剂被FDA批准用于人。欧盟近年批准了AS04用于乙肝疫苗，意大利批准了MF59用于流感亚单位疫苗。免疫应答是机体免疫系统对抗原刺激产生的以排除抗原为目的的生理过程，包括抗原递呈、淋巴细胞活化、免疫分子形成及免疫效应发生等一系列反应。免疫系统由胸腺、脾脏和淋巴组织等组成，当病原体侵入人体后，首先启动的是天然免疫反应，如天然杀伤细胞、单核一巨噬细胞可对其进行攻击并杀灭之，这种免疫反应是非特异性的。随着人体免疫系统对病原体的识别，启动了针对病原体的免疫反应，即获得性特异免疫反应，包括特异性体液免疫和特异性细胞免疫。前者产生特异性的免疫球蛋白，后者主要产生一些杀伤性T淋巴细胞及细胞因子用以杀死入侵的病原体。B淋巴细胞直接识别抗原，经辅助因子刺激增殖分化产生特异性抗体，中和毒素，促进巨噬细胞吞噬，介导体液免疫。T细胞介导细胞免疫。T细胞不能直接识别抗原，只能识别经抗原提呈细胞APC加工、处理后的抗原肽。APC被抗原激活后，产生IL-12，IFN-α等，刺激NK细胞产生IFN-γ；上调APC表面的MHC及共刺激分子的表达，递呈抗原，Th细胞激活后增殖分化成Th效应细胞。CD4+T细胞被MHCII-抗原肽活化后，分化成Thl和Th2细胞亚群。Thl反应的特征是分泌IFN-y、IL-2等，IFN-γ活化巨噬细胞，介导细胞免疫；IL-2辅助B细胞产生鼠IgG2a、人IgG，诱导人IgG抗胞内病原体免疫。Th2反应的特征是分泌IL-4等，辅助B细胞产生鼠IgGl、人IgE，诱导人IgE抗寄生虫免疫。⑶8+T细胞被MHCI-抗原肽激活后，产生IL-2，刺激细胞毒T细胞CTL增殖分化，激活CTL；Thl产生的IL-2间接刺激CTL。特异性细胞免疫的效应细胞主要是Thl型⑶4+T和⑶8+CTL细胞，前者经活化巨噬细胞，诱生免疫炎症；后者藉分泌细胞毒素及诱导细胞凋亡，以杀死带抗原的靶细胞。特异的细胞免疫应答在清除胞内病原体感染及抗肿瘤免疫反应中起重要作用。在Th细胞分化过程中，细胞因子是影响Thl/Th2极化的重要因素。活化APC产生的IL-12，IFN-a刺激NK细胞产生IFN-γ，诱导Thl分化和IFN-γ等产生，IFN-γ进一步激活ΜΦ细胞增强其产生IL-12的能力；Thl细胞因子促进CTL分化，并诱导人IgG抗体产生。IL-12，IFN-α等细胞因子促使Thl及CTL分化，在诱导体液免疫和细胞免疫应答中起重要作用。机体通过免疫应答，达到清除“抗原异物”的目的。免疫佐剂可刺激抗原递呈细胞APC，释放细胞因子和趋化细胞因子，能募集这些细胞到局部组织和淋巴结，增强体液免疫及细胞免疫。理想的免疫佐剂除了能增强体液免疫应答外，还能增强由Thl和CD8+T介导的细胞免疫应答。PIC能诱导抗原提呈树突细胞DC成熟，维持DC分泌高水平IL-12[1]；产生IFN_a[2]，高表达MHC和共刺激分子[1]，诱导T细胞增殖；并有效的提呈MHC-I多肽抗原，诱导较强的CTL反应[3]；可活化NK细胞，增强IgG2a及IgGl的产生M。免疫系统的功能就是识别“自我”与“非我”，如何理解一些非己抗原的免疫原性如此弱。近年，Janeway等提出了模式识别理论，将天然免疫针对的主要靶分子称为病原相关分子模式PAMP(pathogenassociatedmolecularpatterns),PAMP禾口模式i只别受体PRR相互作用，激活天然免疫应答，促进炎性细胞因子的产生，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统。PAMP主要指广泛存在于病原体细胞表面的分子标志，他们在进化中趋于保守，是对病原体生存极为根本的结构，如LPS等。识别PAMP的PRR包括Toll样受体TLR及非Toll样受体。目前共有10多种TLR及非Toll样受体被证实，多数疫苗佐剂是TLR配体，佐剂通过PRR而行使作用。配体具有活化表达PRR细胞的功能，尤其有活化DC的功能，配体与DC作用后，DC活化产生IFN等细胞因子及趋化因子，并可上调DC和递呈抗原给初始T细胞。研究表明PIC在DC表面及胞浆有TLR3及非Toll样受体MDA5[5][6]。PIC在TLR3及MDA5介导下，通过MyD88依赖和非依赖性信号传导途径[7]，激活NF_kB，MAPK和ISP-I引起细胞因子IL-12，I型IFN等释放，上调DC表面的⑶80，⑶86，IFN等共刺激分子，诱导DC分化成熟，最终激活特异性免疫[8]，诱导Thl极化应答，在抗原特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答中增强体液免疫及细胞免疫功能，最终导致抗病毒效应及佐剂效应的发挥[9]。早在60年代已发现PIC能诱导干扰素，但在人和灵长类动物，由于核酸酶的降解作用，而不能用于人体。此后将PIC与poly-L-lysine和carboxymethlycellulose复合形成PICLC，PICLC能有效的诱导干扰素，但毒性太大，在人体试验中有发热，低血压等严重副作用，亦不能用于人体。后经研究发现，PIC、卡那霉素等组合物能诱导人干扰素，现PIC已作为抗病毒制剂Av-pick用于人。理想的佐剂应是安全、有效、方便、经济。为此提供了聚核苷酸PIC、卡那霉素组合物佐剂。该佐剂与抗病毒制剂Av-pick相比具有高浓度，低热源的特点。PIC在制成高浓度时常伴有大于24S的高分子量产生，易产生过敏反应，经过大量的探索试验，研制了高浓度，稳定，分子大小在4-13S的PIC[1°]，提供了安全，有效的PIC、卡那霉素组合物佐剂。参考文献[l]PolyI:CusedforhumandendriticcellmaturationpreservestheirabilitytosecondarilysecretebioactiveIL-12.RedouaneRouasetal.Internationalimmunology,2004，16(5):767-773.[2]GeneticsusceptibiIitytopolyI:C_inducedIFNα-dependentaccelerateddiseaseinlupus-pronemice.TNJorgensenetal.Immunity.2006,7555-567.[3]polyI:CinducesstablematurationoffunctionalIyactivehumandendriticcelIs.VerdijkRMetal.Jimmunol1999,163(1)57-61.[4]TheroleofNKcellsduringinviveantigen—specificantibodyresponses.JAWiIderetal.TheJournalofImmunology,1996,156(1)146-152.[5]GenesandProductionofIFN-α；byhumanandmurinemastcellsinducedbydouble-strandedRNAEvidenceforactivationforthroughtol1-1ikereceptor-3(TLR-3).M.kulla.JournalofAllergyandClinicalimmunology.2003,113(2):S48.[6].Essentialroleofmda_5intypeIIFNresponsetopolyl:Candencephalomyοcarditispicornavirus.LeonidGitlinetal.ProcNatlAcadSciUSA.2006，103(22):8459-8464.[7].Recognitionofdouble-strandedRNAandactivationofNF~kBbyToll一1ikereceptor3.AlexopoulouLetal.Nature.2001,413:732-8.[8].Toll-likereceptor3mediatorsamorepotentantiviralresponsesthanToll-likereceptor4.DoyleSEetal.JImmunol.2003,170(7):3565-71.[9].Stimulationofhumoralandcellularantibodyformationinmicebypolyl:C.Turner,Wetal.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1970，133:334_338.[10]·欧洲专利JP1238597.
发明内容以Th极化应答及模式识别理论为基础，发明提供了安全，有效，低廉的聚核苷酸组合物佐剂。该组合物佐剂为聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸、卡那霉素组合物PICK(polyriboinosinic-polyribocytidylicacicUkanamycin)。该PICK佐剂可增强抗原特异的体液免疫和细胞免疫。所述聚核苷酸组合物佐剂分子大小和分子量呈异质性，分子大小介于约4S至13S沉降系数范围内，分子量介于约23，OOOD至310，OOOD道尔顿范围内。所述PICK佐剂，以液体形式存在。含量为PIC:2.0—15mg/ml，卡那霉素500IU/ml—5000IU/ml,PH6.0-8.O。PICK佐剂终浓度建议不高于0.2mg/ml。PICK佐剂的制备涉及过滤，层析，热处理，电泳等技术。PICK佐剂细菌内毒素≤100EU/剂。增色值大于55%；231、267nm有最小和最大紫外吸收。所述PICK佐剂中，卡那霉素可与一种或多种抗生素共同使用或被一种或多种抗生素取代。这些抗生素是氨基甙类抗生素包括小诺霉素，奈替霉素，妥布霉素，核糖霉素，大败霉素，新霉素，潮霉素，丁胺卡那霉素，双去氧卡那霉素，庆大霉素，暗霉素，嘌呤霉素，链霉素，链脲霉素，西索霉素，依替米星，阿贝卡星，美它酰胺，硫酸丁酰苷菌素，蒽环霉素等。提供一种免疫原组合物，由所述聚核苷酸组合物佐剂及抗原组成。该抗原是vero细胞狂犬病毒纯化抗原。该抗原可被其它单一抗原或联合抗原取代。这些抗原是病原体抗原或类毒素。病原体抗原可以是细菌，病毒，癌肿等抗原；包括灭活或减毒的病原体或纯化成分或重组亚单位或合成多肽抗原。所述免疫原组合物，是液体剂型，亦或是冻干剂型或喷雾剂型或口服剂型。所述免疫原组合物，免疫途径可是以下组群中的一种肌肉注射，腹腔注射，皮下注射，皮内注射；呼吸道吸入；胃肠道口服。所述免疫原组合物，免疫对象是人，用于预防性疫苗，治疗性疫苗；该免疫原组合物免疫对象亦可是动物，用于预防性疫苗，抗毒素，抗血清的制备。PICK佐剂具有以下优点1.PICK的安全性经Av-pick的应用已得到证明。2.PICK为水溶性，注射局部吸收好无硬结无免疫病理，优于铝佐剂。3.能增强抗原特异的体液免疫及细胞免疫，有效性经动物试验结果已显示=PICK能明显提高狂犬疫苗效价和中和抗体ED5tl，优于铝佐剂及无佐剂。4.PICK是液体剂型，使用方便。5.—人份狂犬疫苗PICK佐剂Img的成本在2角左右，非常低廉经济。6.PICK佐剂的合成制备工艺，重复性好，批间差小，适于规模化大生产。附图1灭活Vero细胞狂犬病毒感染液在S印haroSe-4FF柱层析的洗脱图。附图2=PICK佐剂在S印hacrylS-200上的洗脱图。附图3:PICK佐剂在200_300nm的扫描图。附图4=PICK佐剂的PAGE电泳图。具体实施例方式实例1.效力ED5tl测定配苗灭活Vero细胞感染液经S印haroSe-4FF柱层析纯化获得狂犬原液；PICK佐剂以不同浓度加入狂犬疫苗原液制成佐剂苗PK-V；同时配制铝佐剂苗AL-V及无佐剂苗IPRV0效力ED5tl测定用NIH法各实验苗做5、25、125倍稀释，每稀释度16只小鼠，14_16g，于0，7天腹腔免疫二次，0.5ml/只，14天脑腔攻毒，0.03ml/只，并做攻毒对照，记录小鼠死亡数，28天判定，按Reed-Muench法计算ED5tl及LD5tl。200μgPICK提高狂犬疫苗效价ED5(12倍，见表1。表1.效力ED50什口HL.U50PICK(ug/ml)IPRV19.531.6AL-V16.8PKl-V29.750PK2-V40.9100PK3-V62.8200PK4-V87.1300实例2.效力热稳定ED5tl测定铝佐剂苗AL-V、无佐剂苗IPRV、PICK佐剂苗PK-V，各实验苗分别同时放置4°C两周，37两周，用NIH法测定效力热稳定ED5tl各实验苗做5、25、125倍稀释，每稀释度16只小鼠，于0，7天腹腔免疫，0.5ml/只，14天脑腔攻毒，0.03ml/只，并做攻毒对照，记录小鼠死亡数，28天判定，按Reed-Muench法计算ED5tl及LD5(1。0.2mg/mlPICK苗ED5(137°C2W后高于4°C2W无佐剂苗一倍。见表2、表3。表2效力热稳定ED5tl测定(1)表3.效力热稳定ED50测定(2)实例3.中和抗体ED5tl测定免疫及采血(1)铝佐剂苗AL-V、无佐剂苗IPRV、PICK佐剂苗PK-V(300μgPICK)，三组苗分别皮下免疫小白鼠，8只/组，按0、3、7、14、30天免疫5次，0.Iml/只，于7、14、30、60天从小鼠眼眶静脉采血，分离血清，56°C30分灭活后冻存。(2)无佐剂苗IPRV、佐剂苗PK-V(120μgPICK)分别皮下免疫小白鼠，8只/组，于0、3、7、14、30天免疫5次，0.2ml/只；二组于7、14、45天从小鼠眼眶静脉采血，分离血清等份混合后灭活冻存。中和抗体ED5tl测定用小鼠中和试验进行7天血清做2、6、18、54、162倍稀释；14天血清做40、80、160、320、640倍稀释；30天、45天、60天血清做80、160、320、640、1280倍稀释，每一稀释度6只小鼠，10-12g。系列稀释的血清与CVS病毒37°C中和1小时后小鼠脑腔注射，0.03ml/只，14天后据小鼠死亡数按Reed-Muench法计算ED5tl及LD5(1。PICK佐剂苗中和抗体ED5tl高于铝佐剂苗及无佐剂苗。见表4、表5。表4中和抗体ED5tl测定(1)表5.中和抗体ED5tl测定(2)实例4.异常毒性试验小鼠18-22g，豚鼠250-350g，不同剂量的PICK苗，小鼠腹腔注射0.5ml/只，5只/组，7天后体重全增长为合格，豚鼠腹腔注射5ml/只，2只/组，7天后体重全增长为合格。建议PICK的终浓度不高于0.2mg/ml。见表6。表6.异常毒性试验实例5.过敏试验小鼠6只，18-22g，0.2mg/mlPICK苗皮下注射0.2ml/只，两周后尾静脉注射0.2ml，观察15分钟。豚鼠6只，250_350g，0.2mg/mlPICK苗腹腔间日致敏三次，0.5ml/次，3只/组分别于第14天，21天静脉注射Iml/只，观察15分钟。无过敏反应。见表7。表7.过敏试验实例6.脾淋巴细胞转化试验免疫及分组铝佐剂苗41^-￥、无佐剂苗1卩1^、卩10(佐剂苗卩1(-￥(20(^8卩10()，三组苗分别皮下免疫小白鼠，3只/组，0.5ml/只，10天处死小鼠，无菌取脾研磨，过滤，洗涤。用1640培养液调细胞浓度到1X106/ml,0.Iml/孔加入96孔板。转化和对照各3复孔，0.Iml/孔，ConA:100μg/ml,1640培养液为对照孔，37°C，5%CO2孵育48小时，每孔加MTT(5mg/ml)10μ1，继续培养4小时，IOOOrpm离心5分钟，弃上清加二甲基亚砜，0.Iml/孔，慢振10分钟，酶标仪570nm测吸收度A，以此计算淋巴细胞的增殖能力。ConA可刺激T细胞转化增殖，刺激指数SI=转化三复孔A平均值/对照三复孔A平均值。PICK苗的SI明显高于无佐剂苗及铝佐剂苗，PICK佐剂可诱导细胞免疫。见表8。表8.脾淋巴细胞转化实验PK-V与AL-V比**Ρ<0·01，与IPRV比ΔΔΡ<0·01，AL-V与IPRV比:Ρ>0·05。权利要求一种聚核苷酸组合物佐剂，由聚核糖肌苷聚核糖胞苷酸PIC、卡那霉素组成。2.权利要求1所述聚核苷酸组合物佐剂，其分子大小和分子量呈异质性，分子大小介于约4S至13S沉降系数范围内，分子量介于约23，000D至310，000D道尔顿范围内。3.权利要求1至2所述组合物佐剂，以液体形式存在。其中PIC2.0—15mg/ml，卡那霉素500IU/ml—5000IU/ml，PH6.0-8.0。该佐剂的终浓度建议不高于0.2mg/ml。4.权利要求1至3所述组合物佐剂，细菌内毒素彡100EU/剂，增色值大于55%，231、267nm有最小和最大紫外吸收。5.权利要求1至4所述佐剂中，卡那霉素可和一种或多种抗生素共同使用或被一种或多种抗生素所取代，这些抗生素是氨基甙类抗生素包括妥布霉素，小诺霉素，核糖霉素，大观霉素，西索霉素，奈替米星，依替米星，阿贝卡星，庆大霉素，链霉素，新霉素，潮霉素，丁胺卡那霉素，双去氧卡那霉素，暗霉素，嘌呤霉素，链脲霉素等。6.一种免疫原组合物，由权利要求1至5任一项所述聚核苷酸组合物佐剂及抗原组成。该抗原是vero细胞狂犬病毒纯化抗原。该抗原可被其它单一抗原或联合抗原取代。这些抗原是病原体抗原或类毒素。病原体抗原可以是病毒，细菌，癌肿等抗原；包括减毒或灭活的病原体或纯化成分或重组亚单位或合成多肽。7.权利要求6所述免疫原组合物是液体剂型，亦或是冻干剂型或喷雾剂型或口服剂型。8.权利要求6至7所述免疫原组合物，免疫途径可是以下组群中的一种肌肉注射，腹腔注射，皮下注射，皮内注射；呼吸道吸入；胃肠道口服。9.权利要求6至8所述免疫原组合物，免疫对象是人，用于预防性疫苗，治疗性疫苗。10.权利要求6至8所述免疫原组合物，免疫对象亦可是动物，用于预防性疫苗，抗毒素，抗血清的制备。全文摘要本发明涉及聚核苷酸组合物佐剂，即聚核糖肌苷酸-聚核糖胞苷酸、卡那霉素组合物佐剂；属生物医药领域。该佐剂能增强抗原特异的体液免疫及细胞免疫，能明显提高狂犬疫苗效价和中和抗体ED50。提供了安全、有效，方便，经济的佐剂及免疫原组合物，用于人和动物的预防性疫苗，治疗性疫苗及抗毒素抗血清的制备。文档编号A61K39/205GK101890161SQ200810161680公开日2010年11月24日申请日期2008年10月7日优先权日2008年10月7日发明者于洪涛,付博,戚风春,李宇辉,胡晓明,董雪林,袁延宝,郑晓丽,郝国荣,郭岩,郭立君,陈维金,隋红申请人:郝国荣