专利名称：异硫氰酸酯类化合物在制备治疗白血病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及异硫氰酸酯类化合物的用途，尤其涉及异硫氰酸酯类化合物在制备治疗白血 病的药物中的应用。
背景技术：
异硫氰酸酯(isothiocyanates)广泛存在于各种十字花科如青花菜、羽衣甘蓝、抱子甘蓝、 花椰菜、辣根和水田芥等植物中。十字花科植物富含硫代葡萄糖苷(glucosinolates)，这种物 质经植物黑芥子酶或胃肠微生物水解后会产生具有生物活性的水解产物，即异硫氰酸酯。
异硫氰酸酯类化合物主要包括异硫氰酸苄基酯(BITC)、异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)、 异硫氰酸丙烯基酯(AITC)、莱腹硫烷(SFN)、及苷油三芥酸酯(Erucin)等几种。异硫氰 酸苄基酯(BITC)的分子式是CsH7NS ，结构式是
;异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)的分子式是C9H9NS，结
构式是 结构式是:
式是
；异硫氰酸丙烯基酯(AITC)的分子式是C4H5NS，
~ ;莱腹硫烷(SFN)的分子式是C6HnNOS2，结构
P
;苷油三芥酸酯(Emcin)的分子式是
C6HUNS2，结构式是 " 。
白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，占我国成人恶性肿瘤死亡率第六位，占儿童恶性肿 瘤死亡率第一位。根据流行病学调査结果表明，白血病的发病率为十万分之四，该病的主要 发病年龄在35岁以下，其中50%以上是儿童。全世界每年新增、复发白血病约100万人。全 国每年新增白血病患者约4万人，每年死于白血病约3万人。由于逐年攀升的发病率和死亡 率，寻找有希望的治疗策略成为白血病研究的重点和热点。因此，白血病是全球亟待重点防 治的疾病之一。近年来，国内外均采用化疗和放疗等方法抑制白血病细胞生长，延长患者的 寿命。但是，这类方法的毒副作用大，复发率高，不但给病人带来极大的痛苦，而且给其家 庭、社会造成了沉重的负担。六十年代开始国际上就将骨髓移植运用于白血病的治疗，我国 在近十年也开展了骨髓移植运用于白血病治疗的方法，并取得了良好的效果。但是，由于治 疗费用昂贵，并受到配型来源的限制，仍有许多患者因为得不到合适配型的骨髓或交不起昂
3贵的治疗费用，未能得到及时有效的治疗而导致死亡。
发明内容
本发明的目的就在于提供异硫氰酸酯类化合物在制备治疗白血病的药物中的应用。
本发明所述的异硫氰酸酯类化合物可以为异硫氰酸苄基酯(BITC)、异硫氰酸苯基乙基 酯(PEITC)、异硫氰酸丙烯基酯(AITC)、莱腹硫垸(SFN)或苷油三芥酸酯(Erucin)。
本发明所述的异硫氰酸酯类化合物可以从市场中直接购得，也可以通过如下反应制得 即采用卤代烃与硫氰酸盐发生亲核取代反应，来制得异硫氰酸酯(通式为RSCN)，反应式为
RX + R，SCN — RSCN + R，X
其中R为苄基，则RSCN为异硫氰酸苄基酯(BITC); R为苯乙基，则RSCN为异硫氰 酸苯基乙基酯(PEITC); R为丙烯基则RSCN为异硫氰酸丙烯基酯(AITC); R为甲硫酰丁 基，则RSCN为莱菔硫烷(SFN); R为甲硫代丁基，则RSCN为苷油三芥酸酯。
上述反应釆用四丁基溴化铵做相转移催化剂，通过硫氰酸钠和烃基氯在水溶液中进行相 转移催化反应，制备烃基硫氰酸酯中间体，然后升温、回流，使硫氰酸酯异构成异硫氰酸酯。
上述的异硫氰酸酯类化合物在制备成治疗白血病的药物时，可以按本领域公知的方法制 备成胶丸。
上述胶丸可以制成每丸含有效成分异硫氰酸酯类化合物100、 200毫克两种规格。 上述的白血病包括^同类型的急性白血病(包括急性髓性白血病、急性T淋巴白血病以 及急性早幼粒细胞白血病等)和慢性白血病。
上述胶丸在治疗白血病中的具体用法、用量为
口服，每日一次，AITC、 BITC、 PEITC、 SFN和Erucin的有效用量按人体重计分别为 10.0、 7.5、 7.0、 16.5、 10.5mg/kg。
为了更好地理解本发明，下面将通过各种异硫氰酸酯类化合物的药理试验及其结果来说 明本发明。
异硫氰酸酯类化合物在制备治疗白血病的药物中的用途，其针对白血病的作用机理如下 一、本发明中的异硫氰酸苄基酯(BITC)、异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)、异硫氰酸丙烯 基酯(AITC)、莱腹硫垸(SFN)或苷油三芥酸酯(Erucin)均能诱导急性白血病细胞凋亡， 并存在明显的量效关系和时效关系
急性白血病细胞(U937或Jurkat细胞)分别经上述五种异硫氰酸酯处理后，采用AnnexinV /PI双染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。研究结果表明，上述五种异硫氰酸酯均能诱导急性 白血病细胞发生凋亡并存在明显的量效关系(见图I-IA、图l-2A、图l-3A、图l-4A和图 l-5A)。其中急性T淋巴白血病Jurkat细胞对异硫氰酸苄基酯(BITC)和莱腹硫烷(SFN) 更敏感，而急性髓性白血病U937细胞则对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)、异硫氰酸丙烯基酯(AITC)、及苷油三芥酸酯(Erucin)更敏感。BITC、 PEITC、 ATC、 SFN及Erucin诱导 急性白血病细胞发生凋亡的最大作用剂量分别为8 UM、8 WM、20 txM、40 u M、及20 n M。
时效关系研究结果表明，这五种异硫氰酸酯化合物引起急性白血病细胞发生凋亡的最大 作用时间也是不相同的(见图I-IB、图l-2B、图l-3B、图l-4B和图l-5B)。例如，BITC处 理Jurkat细胞后6小时就引起约55%的细胞发生凋亡，12小时后基本达到了最大作用即引起 约70%的细胞发生凋亡。PEITC和Erucin具有相似的时间依赖性，即PEITC和Erucin处理 U937细胞3小时后就分别引起约60%和40%的细胞发生凋亡，6小时后基本达到了最大作用 即分别引起约80%和75%的细胞发生凋亡。SFN处理Jurkat细胞后6小时就引起近50%的 细胞发生凋亡，12小时和24小时就分别引起约60%和85%的细胞发生凋亡。而AITC处理 U937细胞后6小时只引起约30%的细胞凋亡，12小时引起约40%的细胞凋亡，24小时达到 最大作用即引起约55%的细胞发生凋亡。
二、 本发明中的五种异硫氰酸酯化合物均可诱导凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解的增加，并促进其对凋亡作用底物PARP (poly ADP-ribose polymerase,多聚ADP-核糖聚合酶)的降解增加
采用Western Blot方法研究上述五种异硫氰酸酯对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶 (Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8， Caspase-9，以及凋亡作用底物PARP表达的 影响。研究结果表明(见图I-IC、图l-2C、图l-3C、图l-4C、图l-5C、 I-ID、图l-2D、图 l-3D、图l-4D和图l-5D)，上述五种异硫氰酸酯均可诱导凋亡蛋白酶〔Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9的活化/降解，以及凋亡作用底物PARP的降解增加，并存在 明显的量效关系和时效关系。
三、 BITC, PEITC， SFN，及Erucin均可抑制抗细胞凋亡蛋白Mcl-1的表达，而AITC 则诱导细胞周期调控蛋白p21的表达
细胞凋亡是受一系列基因控制的程序化细胞死亡方式。Bcl-2家族基因是细胞凋亡相关 基因研究中研究得最多的一类蛋白质，这些Bcl-2家族基因在调控细胞凋亡过程中其着极其 重要的作用。Bcl-2家族基因主要分为两类 一类是抗细胞凋亡蛋白如Bcl-2， Bcl-xL， Mcl-1, XIAP等；另一类则是促细胞凋亡蛋白如Bax， Bad, Bim,Bid等。为了探讨Bcl-2家族基因在异 硫氰酸酯类化合物诱导急性白血病细胞凋亡中的作用机制，我们研究了上述五种异硫氰酸酯 处理急性白血病细胞后对Bcl-2家族基因表达的影响。研究结果表明(见图2-lA、图2-3A、 图2-4A、图2-5A、 2-lB、图2-3B、图2-4B和图2-5B)， BITC, PEITC, SFN,和Erucin均可抑 制抗凋亡蛋白Mcl-1的表达，并存在着明显的量效关系和时效关系。而AITC则不影响Mcl-1 的表达。研究结果还显示，这五种异硫氰酸酯均不影响其它Bcl-2家族基因如XIAP， Bcl-2,Bcl-xL, Bax, Bad, Bim等表达的改变。上述结果显示，抗凋亡蛋白Mcl-l可能在BITC, PEITC, SFN，和Erucin诱导急性白血病细胞凋亡过程中起着重要的作用。
本发明人还研究了上述异硫氰酸酯类化合物对细胞周期调控蛋白p21表达的影响。p21 是细胞内具有最广泛激酶抑制活性的CDK抑制剂，它可与cyclinD2/cdk4复合物结合,抑制其憐 酸化Rb蛋白的功能,从而使细胞周期停滞在Gl期,抑制细胞增殖。p21也与细胞凋亡关系密切。 为了探讨p21在异硫氰酸酯类化合物诱导急性白血病细胞凋亡中的作用机制，本发明人研究 了上述五种异硫氰酸酯处理急性白血病细胞后对p21表达的影响。研究结果表明(见图2-2A 和图2-2B)， AITC可诱导p21的表达，并存在明显的量效关系和时效关系，而BITC, PEITC, SFN,和Erucin则不影响p21表达的改变。
四、 上述五种异硫氰酸酯均能引起Akt磷酸化水平的降低，及JNK磷酸化水平的增加 PI3K/Akt/mTOR信号转导通路在肿瘤发生发展中起着重要的作用，该通路的活化可以抑
制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进细胞的生存和增殖。目前， PI3K/Akt/mTOR信号转导通路已经成为预防和治疗癌症的非常有发展前景的耙点。促有丝分 裂原活化蛋白激酶(Mitogen - activated protein kinases ,MAPKs)家族是真核细胞转导细胞外信 号到细胞内引起细胞反应的一类重要的酶蛋白信号系统。目前己经在哺乳动物细胞中发现至 少4种类型的MAPK途径，即细胞外信号调节蛋白激酶通路(extm cellular regulated protein kinases, ERK) 、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK) 、P38 MAPK通路和ERK5/ 大丝裂素活化蛋白激酶(BMK1)通路。其中前三条途径已成为目前研究的热点。MAPKs通路 与细胞生长和凋亡密切相关。总体上说,ERK由生长因子所活化,对细胞的增殖和存活起着非 常重要的作用。另一方面，p38和JNK通路可导致细胞凋亡。
为了探讨PI3K/Akt/mTOR和MAPK等信号转导通路在异硫氰酸酯类化合物诱导急性白 血病细胞凋亡中的作用机制，本发明人研究了五种异硫氰酸酯处理急性白血病细胞后对Akt 和JNK等磷酸化(phosphoiylation)的影响。研究结果表明(见图2-lC、图2-2C、图2-3C、图 2-4C、图2-5C、图2-lD、图2-2D、图2-3D、图2-4D和图2-5D)，五种异硫氰酸酯均可引起 Akt磷酸化水平的降低，及JNK磷酸化水平的增加并存在明显的量效关系和时效关系。但是， 五种异硫氰酸酯不影响mTOR、 ERK和p38磷酸化水平的改变，或引起一些无规律的变化。 上述研究结果表明，PI3K/Akt和JNK信号通路可能在异硫氰酸酯类化合物诱导急性白血病细 胞凋亡中起着重要的作用。
五、 异硫氰酸酯可作用于不同类型的急性白血病细胞，诱导其细胞凋亡 为了探讨异硫氰酸酯是否对其它急性白血病细胞也有作用，本发明人研究了上述五种异
硫氰酸酯对三种不同类型的急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血 病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)凋亡的影响。研究结果表明(见图3-1A、图3-2A、图3-3A、图3-4A和图3-5A)，虽然三种急性白血病细胞对五种异硫氰酸酯的敏感 性不同，异硫氰酸酯均可诱导三种急性白血病细胞发生凋亡。Western blot研究结果表明(见图 3-lB、图3-2B、图3-3B、图3-4B和图3-5B)，五种异硫氰酸酯均可诱导三种急性白血病细胞 中凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8， Caspase-9的活化/降解，以及 凋亡作用底物PARP的降解。上述五种异硫氰酸酯还可引起三种急性白血病细胞中抗凋亡蛋 白Mcl-l的下调(do丽egulation)(见图3-lC、图3-2C、图3-3C、图3-4C和图3-5C)。最后， 上述五种异硫氰酸酯还可引起三种急性白血病细胞中Akt磷酸化水平的降低，和JNK磷酸化 水平的增加(见图3-lD、图3-2D、图3-3D、图3-4D和图3-5D)。
六、 PI3K/Akt抑制剂LY294002可增强上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡 为了进一步证实PI3K/Akt信号转导通路在上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡中起
着非常重要的作用，本发明人采用PI3K/Akt的药理抑制剂LY294002来研究PI3K/Akt通路的 抑制对上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡的影响。研究结果表明(见图4-lA、图4-2A、 图4-3A、图4-4A和图4-5A)，当用LY294002预处理和上述异硫氰酸酯处理急性白血病细胞 后，其细胞凋亡的发生率明显增加。研究结果还显示(见图4-lB、图4-2B、图4-3B、图4-4B 和图4-5B),预处理LY294002可明显地增强上述异硫氰酸酯诱导的凋亡蛋白酶(Caspase) 包括Caspase-3， Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9的活化/降解，以及凋亡作用底物PARP的降解。 同时，预处理LY294002还可明显地增强上述异硫氰酸酯引起的抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或 p21的表达增力n(见图4-lC、图4-2C、图4-3C、图4-4C和图4-5C)。最后研究结果还显示(见 图4-lD、图4-2D、图4-3D、图4-4D和图4-5D)，预处理LY294002还可明显地增强上述异 硫氰酸酯对Akt活化(磷酸化)的抑制，并增强上述异硫氰酸酯诱导的JNK的活化。上述结 果显示，PDK/Akt通路在上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡中起着非常重要的作用。
七、 Akt的过量表达可以阻断上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡 本发明人还通过分子克隆的手段建立Akt过量表达或显性失活的急性白血病细胞株来研
究Akt的过量表达对异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡的影响。研究结果表明(见图5-lA、 图5-2A、图5-3A、图5-4A和图5-5A)，正常细胞株(pcDNA3.1)和Akt显性失活细胞株(Akt-DN) 经上述异硫氰酸酯处理后，其细胞凋亡的发生率明显增加。但是，Akt过量表达的细胞株经 上述异硫氰酸酯处理后，其细胞凋亡的发生率明显低于pcDNA3.1和Akt-DN。这一结果说明， Akt过量表达可以阻断上述异硫氰酸酯诱导的急性白血病细胞凋亡。研究结果还表明(见图 5-lB、图5-2B、图5-3B、图5-4B和图5-5B)， Akt过量表达还可以阻断上述异硫氰酸酯诱导 的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解，以及 凋亡作用底物PARP的降解。同时，Akt过量表达还可以阻断上述异硫氰酸酯引起的抗凋亡 蛋白Mcl-l的下调，或p21的表达(见图5-lC、图5-2C、图5-3C、图5-4C和图5-5C)。最后，Western blot结果(见图5-lD、图5-2D、图5-3D、图5-4D禾Q图5-5D)显示，Akt过量表达的细 胞株，其总Akt和Akt磷酸化水平明显高于正常细胞株(pcDNA3.1)。
pcDNA3.1和Akt-DN
细胞株经上述异硫氰酸酯处理后，其Akt磷酸化水平明显降低，JNK磷酸化水平明显增加。 但是，Akt过量表达的细胞株其Akt磷酸化水平未受到Akt异硫氰酸酯的影响，而JNK磷酸 化受到完全阻断。上述结果进一步证实PI3K/Akt通路在上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞 凋亡中起着非常重要的作用。PI3K/Akt可能成为上述异硫氰酸酯预防和治疗白血病的非常有 发展前景的靶点。
八、 JNK抑制剂SP600125可明显地阻断上述异硫氰酸酯诱导的急性白血病细胞凋亡 上述研究结果表明，上述异硫氰酸酯处理急性白血病细胞后可诱导JNK信号通路的活化，
提示JNK信号通路可能在上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡中起着重要的作用。为了 进一歩阐明JNK信号通路在上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡中的作用机理，本发明 人采用JNK的药理抑制剂SP600125来研究JNK信号通路的抑制对上述异硫氰酸酯诱导急性 白血病细胞凋亡的影响。研究结果表明(见图6-lA、图6-2A、图6-3A、图6-4A和图6-5A)， 预处理SP600125明显阻断了上述异硫氰酸酯诱导的急性白血病细胞凋亡。研究结果还表明 (见图6-lB、图6-2B、图6-3B、图6-4B和图6-5B)，预处理SP600125还明显阻断了上述异 硫氰酸酯诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活 化/降解，以及凋亡作用底物PARP的降解。预处理SP600125也明显阻断了上述异硫氰酸酯 引起的抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或p21的表达(见图6-lC、图6-2C、图6-3C、图6-4C和图
6- 5C)。最后，预处理SP600125还明显阻断了上述异硫氰酸酯诱导的JNK的活化(见图6-lD、 图6-2D、图6-3D、图6-4D和图6-5D)。上述结果进一步证实，JNK信号通路在上述异硫氰 酸酯诱导急性白血病细胞凋亡中起着重要的作用。
九、 JNK的过量表达可以增强上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡 本发明人还通过分子克隆的手段建立JNK过量表达的急性白血病细胞株来研究JNK的
过量表达对上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡的影响。研究结果表明(见图7-lA、图
7- 2A、图7-3A、图7-4A和图7-5A)，正常细胞株(pcDNA3.1)经上述低浓度异硫氰酸酯处理后， 其细胞凋亡的发生率只轻微增加(约25%)。但是，JNK过量表达的细胞株(JNK1和JNK1/2) 经相同低浓度的异硫氰酸酯处理后，其细胞凋亡的发生率明显增加。研究结果还表明(见图 7-lB、图7-2B、图7-3B、图7-4B和图7-5B)， JNK过量表达可明显地增强异硫氰酸酯诱导 的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9的活化/降解，以及 凋亡作用底物PARP的降解。JNK过量表达还可明显地增强上述异硫氰酸酯引起的Mcl-l的 下调(见图7-lC、图7-3C、图7-4C和图7-5C)。最后，JNK过量表达还可明显地增强上述异 硫氰酸酯引起的JNK的活化(见图7-lD、图7-2C、图7-3D、图7-4D和图7-5D)。上述研究
8结果进一步证实JNK信号通路在上述异硫氰酸酯诱导急性白血病细胞凋亡中起着重要的作 用。JNK可能成为上述异硫氰酸酯预防和治疗白血病的非常有发展前景的靶点。 根据上述研究结果，本发明的有益效果为-
1、 本发明提供了异硫氰酸酯类化合物的一个新的医药用途，即在制备治疗白血病的药物 中的应用；
2、 用本发明提供的异硫氰酸酯类化合物制备治疗白血病的药物，其药理作用强，具有广 谱、特效和低毒的特点，具有很好的药用前景；且上述的白血病包括不同类型的急性白血病
(包括急性髓性白血病、急性T淋巴白血病以及急性早幼粒细胞白血病等)和慢性白血病；
3、 本发明中的异硫氰酸酯类化合物对正常细胞无明显影响，只作用于肿瘤细胞。五种异 硫氰酸酯均可诱导急性白血病和慢性白血病患者外周血细胞和骨髓单核细胞发生凋亡(见本 发明中的实施例1、实施例2);
总之，上述研究表明可以将上述异硫氰酸酯类化合物制备成特效、广谱、低毒的治疗白 血病药物。
图I-IA为采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸节基酯(BITC)诱导 急性白血病细胞发生凋亡的量效关系；图1-1B为采用AnnexinV / PI双染色法和流式细胞仪 检测异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导急性白血病细胞发生凋亡的时效关系；图1-1C为异硫氰 酸苄基酯(BITC)对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶(Caspase)以及凋亡作用底物PARP表达 的影响的量效关系；图1-1D为异硫氰酸苄基酯(BITC)对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶 (Caspase)以及凋亡作用底物PARP表达的影响的时效关系；图2-1A为异硫氰酸苄基酯 (BITC)抑制抗凋亡蛋白Mcl-l的表达的量效关系；图2-lB为异硫氰酸苄基酯(BITC)抑 制抗凋亡蛋白Mcl-l的表达的时效关系；图2-1C为异硫氰酸苄基酯(BITC)处理急性白血 病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation)的影响的量效关系；图2-1D为异硫氰酸节 基酯(BITC)处理急性白血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation)的影响的时效 关系；图3-1A为异硫氰酸苄基酯(BITC)对三种不同类型的急性白血病细胞(急性髓性白 血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)凋亡 的影响；图3-1B为异硫氰酸苄基酯(BITC)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937 细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中凋亡蛋白酶 (Caspase)包括Caspase-3, Caspase國7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解，以及凋亡作用底物 PARP的降解情况；图3-1C为异硫氰酸苄基酯(BITC)对三种急性白血病细胞(急性髓性白 血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中抗 凋亡蛋白Mcl-l的影响；图3-1D为异硫氰酸苄基酯(BITC)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞) 中Akt磷酸化水平的和JNK磷酸化水平的影响；图4-1A为利用PI3K/Akt信号转导通路的药 理抑制剂LY294002来证实PI3K/Akt通路的抑制对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导急性白血病 细胞凋亡的影响；图4-1B为预处理LY294002对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导的凋亡蛋白酶
(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物 PARP的降解的影响；图4-lC为预处理LY294002对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导抗凋亡蛋 白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；图4-1D为预处理LY294002对异硫氰酸苄基酯
(BITC)抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导JNK的活化的影响；图5-IA为Akt过量表达 或显性失活对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1 为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图5-1B为Akt 过量表达对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降角孕的影响；其中pcDNA3.1为 正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图5-1C为Akt过 量表达对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响； 其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株； 图5-1D为Akt过量表达对异硫氰酸节基酯(BITC)抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导JNK 的活化的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过量 表达的细胞株；图6-1A为利用JNK信号转导通路的药理抑制剂SP600125来证实JNK通路 的抑制对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；图6-1B为预处理 SP600125对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；图6-1C为预处理 SP600125对异硫氰酸节基酯(BITC)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响； 图6-1D为预处理SP600125对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导JNK的活化的影响；图7-1A为 JNK过量表达对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1 为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-1B为JNK过量表达对异硫氰酸 苄基酯(BITC)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7, Caspase-8， Caspase-9 的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1 和JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-1C为JNK过量表达对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导 抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和 JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-1D为JNK过量表达对异硫氰酸苄基酯(BITC)诱导JNK
的活化的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图8-1A
为采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸苄基酯(BITC)处理6例急性髓性白血病(AML)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-1B为采用Annexin V/PI 双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸苄基酯(BITC)处理3例急性淋巴细胞白血病(ALL) 患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-1C为采用AnnexinV/PI双染色法和流 式细胞仪检测异硫氰酸苄基酯(BITC)处理3例慢性髓性白血病(CML)患者外周血或骨髓 的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-1D为采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫 氰酸苄基酯(BITC)处理4例正常人骨髓并分离得到造血干细胞(CD34+)后细胞凋亡的情 况；图8-1E为采用异硫氰酸苄基酯(BITC)和生理盐水对照组处理急性白血病U937细胞 NOD/SCID小鼠后的肿瘤发生率；图8-1F为采用异硫氰酸苄基酯(BITC)和生理盐水对照组 处理急性白血病U937细胞NOD/SCID小鼠后的肿瘤重量；
图l-2A为采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱 导急性白血病细胞发生凋亡的量效关系；图l-2B为采用AnnexinV / PI双染色法和流式细胞 仪检测异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导急性白血病细胞发生凋亡的时效关系；图l-2C为异 硫氰酸丙烯基酯(AITC)对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶(Caspase)以及凋亡作用底物PARP 表达的影响的量效关系；图l-2D为异硫氰酸丙烯基酯(AITC)对急性白血病细胞中凋亡蛋 白酶(Caspase)以及凋亡作用底物PARP表达的影响的时效关系；图2-2A为异硫氰酸丙烯 基酯(AITC)诱导细胞周期调控蛋白p21的表达的量效关系；图2-2B为异硫氰酸丙烯基酯 (AITC)诱导细胞周期调控蛋白p21的表达的量效关系；图2-2C为异硫氰酸丙烯基酯(AITC) 处理急性白血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation)的影响的量效关系；图2-2D 为异硫氰酸丙烯基酯(AITC)处理急性白血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation) 的影响的时效关系；图3-2A为异硫氰酸丙烯基酯(AITC)对三种不同类型的急性白血病细 胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病 HL60细胞)凋亡的影响；图3-2B为异硫氰酸丙烯基酯(AITC)对三种急性白血病细胞(急 性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60 细胞)中凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8， Caspase-9的活化/降解， 以及凋亡作用底物PARP的降解情况；图3-2C为异硫氰酸丙烯基酯(AITC)对三种急性白 血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞 白血病HL60细胞)中抗凋亡蛋白Mcl-l的影响；图3-2D为异硫氰酸丙烯基酯(AITC)对 三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性 早幼粒细胞白血病HL60细胞)中Akt磷酸化水平的和JNK磷酸化水平的影响；图4-2A为 利用PI3K/Akt信号转导通路的药理抑制剂LY294002来证实PI3K/Akt通路的抑制对异硫氰酸 丙烯基酯(AITC)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；图4-2B为预处理LY294002对异硫氰酸 丙烯基酯(AITC)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9
11的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；图4-2C为预处理LY294002对异硫氰酸 丙烯基酯(AITC)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；图4-2D为预处 理LY294002对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导JNK的活化 的影响；图5-2A为Akt过量表达或显性失活对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导急性白血病 细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过 量表达的细胞株；图5-2B为Akt过量表达对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导的凋亡蛋白酶
(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物 PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt 为过量表达的细胞株；图5-2C为Akt过量表达对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导抗凋亡蛋 白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显 性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图5-2D为Akt过量表达对异硫氰酸丙烯基酯(AITC) 抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导JNK的活化的影响;其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN 为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图6-2A为利用JNK信号转导通路的药理 抑制剂SP600125来证实JNK通路的抑制对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导急性白血病细胞 凋亡的影响；图6-2B为预处理SP600125对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导的凋亡蛋白酶
(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物 PARP的降解的影响；图6-2C为预处理SP600125对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导抗凋亡 蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；图6-2D为预处理SP600125对异硫氰酸丙烯基 酯(AITC)诱导JNK的活化的影响；图7-2A为JNK过量表达对异硫氰酸丙烯基酯(AITC) 诱导急性白血病细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表 达的细胞株；图7-2B为JNK过量表达对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导的凋亡蛋白酶
(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物 PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株； 图7-2C为JNK过量表达对异硫氰酸丙烯基酯(AITC)诱导3NK的活化的影响；其中pcDNA3.1 为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图8-2A为采用Annexin V/PI双染色 法和流式细胞仪检测异硫氰酸丙烯基酯(AITC)处理6例急性髓性白血病(AML)患者外周 血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-2B为采用Annexki V/PI双染色法和流式细胞仪 检测异硫氰酸丙烯基酯(AITC)处理3例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血或骨髓的 单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-2C为采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫氰 酸丙烯基酯(AITC)处理3例慢性髓性白血病(CML)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞 凋亡的情况；图8-2D为采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸丙烯基酯
(AITC)处理4例正常人骨髓并分离得到造血干细胞(CD34+)后细胞凋亡的情况；图l-3A为采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱 导急性白血病细胞发生凋亡的量效关系；图l-3B为采用AnnexinV / PI双染色法和流式细胞 仪检测异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱导急性白血病细胞发生凋亡的时效关系；图l-3C为异 硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶(Caspase)以及凋亡作用底物 PARP表达的影响的量效关系；图l-3D为异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)对急性白血病细胞中 凋亡蛋白酶(Caspase)以及凋亡作用底物PARP表达的影响的时效关系；图2-3A为异硫氰 酸苯基乙基酯(PEITC)抑制抗凋亡蛋白Mcl-l的表达的量效关系；图2-3B为异硫氰酸苯基乙 基酯(PEITC)抑制抗凋亡蛋白Mcl-l的表达的时效关系；图2-3C为异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC) 处理急性白血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation)的影响的量效关系；图2-3D 为异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)处理急性白血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation) 的影响的时效关系；图3-3A为异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)对三种不同类型的急性白血病细 胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病 HL60细胞)凋亡的影响；图3-3B为异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)对三种急性白血病细胞(急 性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60 细胞)中凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解， 以及凋亡作用底物PARP的降解情况；图3-3C为异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)对三种急性白 血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞 白血病HL60细胞)中抗凋亡蛋白Mcl-l的影响；图3-3D为异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)对 三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性 早幼粒细胞白血病HL60细胞)中Akt磷酸化水平的和JNK磷酸化水平的影响；图4-3A为 利用PI3K/Akt信号转导通路的药理抑制剂LY294002来证实PI3K/Akt通路的抑制对异硫氰酸 苯基乙基酯(PEITC)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；图4-3B为预处理LY294002对异硫氰 酸苯基乙基酯(PEITC)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；图4-3C为预处理LY294002 对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；图 4-3D为预处理LY294002对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导 JNK的活化的影响；图5-3A为Akt过量表达或显性失活对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱导 急性白血病细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞 株，Akt为过量表达的细胞株；图5-3B为Akt过量表达对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱导 的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋 亡作用底物PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细 胞株，Akt为过量表达的细胞株；图5-3C为Akt过量表达对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱
13导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN 为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图5-3D为Akt过量表达对异硫氰酸苯基 乙基酯(PEITC)抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导JNK的活化的影响；其中pcDNA3.1为正 常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图6-3A为利用JNK 信号转导通路的药理抑制剂SP600125来证实JNK通路的抑制对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC) 诱导急性白血病细胞凋亡的影响；图6-3B为预处理SP600125对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC) 诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以 及凋亡作用底物PARP的降解的影响；图6-3C为预处理SP600125对异硫氰酸苯基乙基酯 (PEITC)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；图6-3D为预处理SP600125 对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱导JNK的活化的影响；图7-3A为JNK过量表达对异硫氰 酸苯基乙基酯(PEITC)诱导急性fl血病细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1 和JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-3B为JNK过量表达对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱 导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解以及 凋亡作用底物PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量 表达的细胞株；图7-3C为JNK过量表达对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l 的下调或增加p21的表达的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表 达的细胞株；图7-3D为JNK过量表达对异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)诱导JNK的活化的影 响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图8-3A为采用 A皿exin V/PI双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)处理6例急性髓性白血 病(AML)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-3B为采用A皿exin V/PI 双染色法和流式细胞仪检测异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)处理3例急性淋巴细胞白血病(ALL) 患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-3C为采用AnnexinV/PI双染色法和流 式细胞仪检测异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)处理3例慢性髓性白血病(CML)患者外周血或骨 髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-3D为采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测异 硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)处理4例正常人骨髓并分离得到造血干细胞(CD34+)后细胞凋亡 的情况；图8-3E为采用异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)和生理盐水对照组处理急性白血病U937 细胞NOD/SCID小鼠后的肿瘤发生率；图8-3F为采用异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)和生理盐 水对照组处理急性白血病U937细胞NOD/SCID小鼠后的肿瘤重量；
图l-4A为采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测莱腹硫烷(SFN)诱导急性白血 病细胞发生凋亡的量效关系；图l-4B为采用AnnexinV / PI双染色法和流式细胞仪检测莱腹 硫烷(SFN)诱导急性白血病细胞发生凋亡的时效关系；图l-4C为莱腹硫垸(SFN)对急性 白血病细胞中凋亡蛋白酶(Caspase)以及凋亡作用底物PARP表达的影响的量效关系；图l-4D为莱腹硫垸(SFN)对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶(Caspase)以及凋亡作用底物PARP表 达的影响的时效关系；图2-4A为莱腹硫烷(SFN)抑制抗凋亡蛋白Mcl-l的表达的量效关系； 图2-4B为莱腹硫烷(SFN)抑制抗凋亡蛋白Mcl-l的表达的时效关系；图2-4C为莱腹硫烷
(SFN)处理急性白血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation)的影响的量效关系； 图2-4D为莱腹硫烷(SFN)处理急性白血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation) 的影响的时效关系；图3-4A为莱腹硫垸(SFN)对三种不同类型的急性白血病细胞(急性髓 性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞) 凋亡的影响；图3-4B为莱腹硫烷(SFN)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细 胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中凋亡蛋白酶
(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解，以及凋亡作用底物 PARP的降解情况；图3-4C为莱腹硫垸(SFN)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937 细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中抗凋亡蛋白 Mcl-l的影响；图3-4D为莱腹硫垸(SFN)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937 细胞、急性T淋巴白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中Akt磷酸化 水平的和JNK磷酸化水平的影响；图4-4A为利用PI3K/Akt信号转导通路的药理抑制剂 LY294002来证实PI3K/Akt通路的抑制对莱腹硫垸(SFN)诱导急性白血病细胞凋亡的影响； 图4-4B为预处理LY294002对莱腹硫垸(SFN)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；图4-4C 为预处理LY294002对莱腹硫烷(SFN)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影 响；图4-4D为预处理LY294002对莱腹硫烷(SFN)抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导 JNK的活化的影响；图5-4A为Akt过量表达或显性失活对莱腹硫烷(SFN)诱导急性白血病 细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过 量表达的细胞株；图5-4B为Akt过量表达对莱腹硫烷(SFN)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase) 包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的 影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细 胞株；图5-4C为Akt过量表达对莱腹硫烷(SFN)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21 的表达的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过量 表达的细胞株；图5-4D为Akt过量表达对莱腹硫垸(SFN)抑制Akt的活化(磷酸化)以及 诱导JNK的活化的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株， Akt为过量表达的细胞株；图6-4A为利用JNK信号转导通路的药理抑制剂SP600125来证实 JNK通路的抑制对莱腹硫烷(SFN)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；图6-4B为预处理 SP600125对莱腹硫烷(SFN)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7, Caspase-8,
15Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；图6-4C为预处理SP600125 对莱腹硫烷(SFN)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；图6-4D为预 处理SP600125对莱腹硫烷(SFN)诱导JNK的活化的影响；图7-4A为JNK过量表达对莱 腹硫垸(SFN)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和 JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-4B为JNK过量表达对莱腹硫烷(SFN)诱导的凋亡蛋白 酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物 PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株； 图7-4C为JNK过量表达对莱腹硫垸(SFN)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达 的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-4D为 JNK过量表达对莱腹硫垸(SFN)诱导JNK的活化的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株， JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图8-4A为采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪 检测莱腹硫烷(SFN)处理6例急性髓性白血病(AML)患者外周血或骨髓的单核细胞后细 胞凋亡的情况；图8-4B为釆用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测莱腹硫烷(SFN)处 理3例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-4C 为采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测莱腹硫垸(SFN)处理3例慢性髓性白血病
(CML)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-4D为釆用Annexin V/PI双 染色法和流式细胞仪检测莱腹硫烷(SFN)处理4例正常人骨髓并分离得到造血干细胞
(CD34+)后细胞凋亡的情况；
图l-5A为采用A皿exinV/PI双染色法和流式细胞仪检测苷油三芥酸酯(Erucin)诱导急 性白血病细胞发生凋亡的量效关系；图l-5B为采用A皿exinV / PI双染色法和流式细胞仪检 测苷油三芥酸酯(Erucin)诱导急性白血病细胞发生凋亡的时效关系；图l-5C为苷油三芥酸 酯(Erucin)对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶(Caspase)以及凋亡作用底物PARP表达的影 响的量效关系；图l-5D为苷油三芥酸酯(Erucin)对急性白血病细胞中凋亡蛋白酶(Caspase) 以及凋亡作用底物PARP表达的影响的时效关系；图2-5A为苷油三芥酸酯(Erucin)抑制抗 凋亡蛋白Md-1的表达的量效关系；图2-5B为苷油三芥酸酯(Erucin)抑制抗凋亡蛋白Mcl-l 的表达的时效关系；图2-5C为苷油三芥酸酯(Erucin)处理急性白血病细胞后对Akt和JNK 等磷酸化(phosphorylation)的影响的量效关系；图2-5D为苷油三芥酸酯(Erucin)处理急性白 血病细胞后对Akt和JNK等磷酸化(phosphorylation)的影响的时效关系；图3-5A为苷油三芥 酸酯(Erucin)对三种不同类型的急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴 白血病Jurkat细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)凋亡的影响；图3-5B为苷油三芥 酸酯(Emcin)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat 细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7,Caspase-8， Caspase-9的活化/降解，以及凋亡作用底物PARP的降解情况；图3-5C为苷油三 芥酸酯(Erucin)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat 细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中抗凋亡蛋白Mcl-l的影响；图3-5D为苷油三 芥酸酯(Erucin)对三种急性白血病细胞(急性髓性白血病U937细胞、急性T淋巴白血病Jurkat 细胞、及急性早幼粒细胞白血病HL60细胞)中Akt磷酸化水平的和JNK磷酸化水平的影响； 图4-5A为利用PI3K/Akt信号转导通路的药理抑制剂LY294002來证实PI3K/Akt通路的抑制 对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导急性白血病细胞凋亡的影响；图4-5B为预处理LY294002对 苷油三芥酸酯(Erucin)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3， Caspase-7， Caspase-8， Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；图4-5C为预处理LY294002 对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；图4-5D 为预处理LY294002对苷油三芥酸酯(Emcin)抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导JNK的 活化的影响；图5-5A为Akt过量表达或显性失活对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导急性白血病 细胞凋亡的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt为过 量表达的细胞株；图5-5B为Akt过量表达对苷油三芥酸酯(Emcin)诱导的凋亡蛋白酶 (Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物 PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN为Akt显性失活细胞株，Akt 为过量表达的细胞株；图5-5C为Akt过量表达对苷油三芥酸酯(Erudn)诱导抗凋亡蛋白 Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；其中pcDNA3.1为.iH常细胞株，Akt-DN为Akt显性 失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图5-5D为Akt过量表达对苷油三芥酸酯(Erucin) 抑制Akt的活化(磷酸化)以及诱导JNK的活化的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，Akt-DN 为Akt显性失活细胞株，Akt为过量表达的细胞株；图6-5A为利用JNK信号转导通路的药理 抑制剂SP600125来证实JNK通路的抑制对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导急性白血病细胞凋亡 的影响；图6-5B为预处理SP600125对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase) 包括Caspase-3， Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的 影响；图6-5C为预处理SP600125对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调 或增加p21的表达的影响；图6-5D为预处理SP600125对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导JNK 的活化的影响；图7-5A为JNK过量表达对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导急性白血病细胞凋亡 的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-5B为 JNK过量表达对苷油三芥酸酯(Erucin)诱导的凋亡蛋白酶(Caspase)包括Caspase-3, Caspase-7， Caspase-8, Caspase-9的活化/降解以及凋亡作用底物PARP的降解的影响；其中pcDNA3.1为 正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-5C为JNK过量表达对苷油三芥酸 酯(Erucin)诱导抗凋亡蛋白Mcl-l的下调或增加p21的表达的影响；其中pcDNA3.1为正常
17细胞株，JNK1和JNK1/2为过量表达的细胞株；图7-5D为JNK过量表达对苷油三芥酸酯 (Erucin)诱导JNK的活化的影响；其中pcDNA3.1为正常细胞株，JNK1和JNK1/2为过量 表达的细胞株；图8-5A为采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测苷油三芥酸酯 (Erucin)处理6例急性髓性白血病(AML)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情 况；图8-5B为采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测苷油三芥酸酯(Erucin)处理3 例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-5C为 采用Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测苷油三芥酸酯(Erucin)处理3例慢性髓性白 血病(CML)患者外周血或骨髓的单核细胞后细胞凋亡的情况；图8-5D为采用Annexin V/PI 双染色法和流式细胞仪检测苷油三芥酸酯(Erucin)处理4例正常人骨髓并分离得到造血干 细胞(CD34+)后细胞凋亡的情况；
图中control均表示对照组。
具体实施例方式
下面结合附图，通过具体的试验来说明本发明，但本发明的内容完全不局限于此。 实施例1
采集6例急性髓性白血病(AML)、 3例急性淋巴细胞白lM病(ALL)和3例慢性髓性白 血病(CML)患者外周血细胞或骨髓，分离得到单核细胞。同时采集4例正常人骨髓并分离 得到造血干细胞(CD34+)。采用AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测本发明中五种异硫 氰酸酯类化合物处理细胞后细胞凋亡的发生，五种化合物的浓度分别为BITC 8 ^M，AITC20 ^M， PEITC 8 pM， SFN 40 ^M, Erucin 20 pM,;作用时间为24小曰寸。研究结果见图8-1A、图 8-2A、图8-3A、图8-4A、图8國5A、图8-lB、图8-2B、图8-3B、图8-4B、图8-5B、图8-lC、 图8-2C、图8-3C、图8-4C、和图8-5C，结果表明五种异硫氰酸酯均可诱导AML， ALL，和 CML细胞发生凋亡，但对正常细胞无明显影响(见图8-lD、图8-2D、图8-3D、图8-4D和图 8-5D)。结果显示，异硫氰酸酯具有广泛的抗白血病作用。
实施例2
选用4-5周龄NOD/SCID小鼠60只，雌性，并建立急性白血病U937细胞NOD/SCID小 鼠异种移植瘤模型。NOD/SCID小鼠右后背皮下接种0.2 ml急性白血病U937细胞悬液(含细 胞约2 X106个)，接种细胞后3天按小鼠体重随机分为对照组、BITC处理组、和PEITC 处理组。对照组小鼠经腹腔注射生理盐水；处理组小鼠分别经腹腔注射BITC和PEITC，剂 量为12 pmol/天，每周注射3次，共4周。结果表明，BITC和PEITC处理组肿瘤发生率分 别为42.5%和45%，而生理盐水对照组肿瘤发生率为87.5% (见图8-1E和图8-3E); BITC 和PEITC处理组肿瘤重量为1.33 ± 1.90和1.30 ± 1.87， 对照组为6.93 ± 2.98 (P < 0.01 )(见 图8-1F和图8-3F)。 BITC和PEITC对小鼠无毒副作用。结果提示，BITC和PEITC对人急性白血病细胞NOD/SCID小鼠异种移植瘤的生长有明显的抑制作用。 实施例3
按本领域技术人员公知的胶丸方法制备异硫氰酸酯胶丸；其中所述胶丸中按实际需要能 制成含有50%异硫氰酸苄基酯(BITC)、异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)、异硫氰酸丙烯基酯 (AITC)、莱腹硫烷(SFN)或苷油三芥酸酯(Erucin)的胶丸，也可加大或减少异硫氰酸节 基酯(BITC)、异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)、异硫氰酸丙烯基酯(AITC)、莱腹硫烷(SFN) 或苷油三芥酸酯(Erucin)的含量。使用市售的异硫氰酸酯类化合物，取1500克异硫氰酸节 基酯(BITC)、异硫氰酸苯基乙基酯(PEITC)、异硫氰酸丙烯基酯(AITC)、莱腹硫垸(SFN) 或苷油三芥酸酯(Erucin)， 418克大豆油，400克明胶，400克纯化水，70克蜂蜡，10克红 氧化铁，IO克氧化铁黑，2克羟苯乙酯，200克甘油，按公知制备胶丸技术制备成胶丸，艮卩
采用大豆油和蜂蜡为基质制备囊内容物；明胶加适量水溶胀；红氧化铁、氧化铁黑加水使溶
解；羟苯乙酯加少量乙醇使溶解备用。明胶液于80。C加热使溶解完全，加入红氧化铁、氧化 铁黑溶液，加入甘油及剩余纯化水、羟苯乙酯液，搅拌均匀；另取大豆油和蜂蜡加热至熔融， 搅拌均匀，加入单体异硫氰酸酯单体药物异硫氰酸苄基酯(BITC)、异硫氰酸苯基乙基酯 (PEITC)、异硫氰酸丙烯基酯(AITC)、莱腹硫垸(SFN)或苷油三芥酸酯(Erucin)，再次 搅拌，胶体磨处理得到均匀的软胶囊内容物，用旋转轧囊机压制得胶丸。
权利要求
1、异硫氰酸酯类化合物在制备治疗白血病的药物中的应用。
2、 根据权利要求1所述的应用，其中所述异硫氰酸酯类化合物为异硫氰酸节基酯、 异硫氰酸苯基乙基酯、异硫氰酸丙烯基酯、莱腹硫垸或苷油三芥酸酯。
全文摘要
本发明涉及异硫氰酸酯类化合物在制备治疗白血病的药物中的新用途。用本发明提供的异硫氰酸酯类化合物制备治疗白血病的药物，其药理作用强，具有广谱、特效和低毒的特点，具有很好的药用前景；且本发明能够针对不同类型的急性白血病(包括急性髓性白血病、急性T淋巴白血病以及急性早幼粒细胞白血病等)和慢性白血病。
文档编号A61K31/26GK101474170SQ20081023322
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者宁 高 申请人:中国人民解放军第三军医大学