专利名称：一种制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的方法， 属于生物医用材料领域。
背景技术：
生物相容性是衡量骨修复材料是否优异的重要指标之一。由于天然生 物材料具有良好的生物相容性，近年来研究者将其更多地应用到骨修复材 料或骨组织工程中，尤其是动物胶原蛋白。但动物胶原蛋白是从动物组织 中提取的，无法消除像疯牛病、猪瘟疫、禽流感等病毒隐患，人胶原(来 自人胎盘、骨等)提取过程中也照样无法消除肝炎、艾滋病等传染危险， 因此，动物源型或人源型胶原蛋白在应用中受到世界卫生组织的限制。再 者，动物源型的胶原蛋白和人组织提取胶原均为水不溶型，只能溶于酸或 碱，无论所用的试剂是酸还是碱均会产生细胞毒性，细胞黏附性差，成型 后酸碱不易脱除，这些缺点使其潜在的用途开发受到限制。
而类人胶原蛋白n是通过基因工程技术生产的一种高分子生物蛋白， 其生物学性能较动物源胶原蛋白优异，具有良好的细胞黏附性、促新细胞
形成和促上皮细胞形成(类人胶原蛋白48小时促上皮细胞形成速度为正常 对照组的1.4-1.6倍，而动物体胶原则为1.05-1.1倍)功能，而且其加工性 能好，无病毒隐患，水溶性好(避免了酸碱溶剂残留带来的细胞毒性)，排 异反应低(由于该类人胶原蛋白是由人胶原蛋白基因构建的，因此，在进 入人体后，其免疫排异反应与来自动物组织的胶原蛋白相比大大减少)。所 以，为了提高进一步提高骨修复材料的生物相容性，用类人胶原蛋白II替为了提高骨修复材料的机械强度及实现可控降解，研究者们多采用戊二 醛作为交联剂。由于戊二醛对细胞具有较大毒性，而且用其交联的骨f^复 材料植入体内后，其降解产物也会对机体组织造成一定的伤害。因此，本 研究中采用天然生物交联剂京尼平交联类人胶原蛋白II骨复合材料。京尼 平是一种提取于栀子果实中的天然生物交联剂，属于环烯醚萜类的化合物， 具有羟基、羧基等多个活性基团，可以以单分子和多分子形式进行交联。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备可生物降解组织工程用人工骨材料的方 法，该方法工艺简单，所制备的人工骨材料骨诱导活性以及免疫相容性优 异，彻底杜绝了动物胶原蛋白支架材料所不可避免的病毒隐患，使用安全 性大幅度提高。
本发明实现过程如下
一种制备可生物降解的组织工程用仿生人工骨材料的方法，其特征在于 包括以下步骤
1) 将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1%~5%的溶液；
2) 制备羟基磷灰石混悬液；
3) 将羟基磷灰石混悬液加至类人胶原蛋白溶液中，温和搅拌6 h， 静置过夜，用0.1 MNaOH调至溶液pH至7.0,加入0.1-1%的京尼平4 匸交联ld，真空冷冻干燥24h,制得类人胶原蛋白(RHLCII)虔基磷 灰石(nHA)粉末；
4) 将壳聚糖用稀酸溶解成0.01% ~ 0.04%的溶液；
5) 将类人胶原蛋白/羟基磷灰石粉末加至壳聚糖溶液中，用0.1 M NaOH溶液调至溶液pH至7.0;
重复(重复2-5次)以下步骤加入1%~5%的类人胶原蛋白溶液 至pH为6.4，加入0.01%~0.04%壳聚糖溶液，用NaOH溶液调整溶液 pH至7.0;在冰洛下利用超声波震荡使溶液充分分散，然后加入0.1-1%的京尼
平溶液交联l-3d;
6) 将上述混合溶液倾入不锈钢模具中，在4 'C下冷藏4h，预冷冻3 h后真空冷冻干燥48h,再用pH7.3的PBS缓冲液反复浸洗，然后将其 二次冻干后保藏；
7) 将细胞密度为5xl04 cells/cm2的BMSCs接种于边长为5mm，厚 度为2mm的上述材料上；
8) 培养l-10d后，换诱导培养基培养BMSCs细胞，诱导其向成骨 方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材料。
上述步骤中，所用的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密 度发酵生产的一种人源型胶原蛋白。
上述步骤2)中，纳米羟基磷灰石制备方法如下Ca(N03)2溶液与 (NH4)3PCV溶液反应，反应体系的pH值用NH3，H20调节使其保持pH 9±0.1，方程式如下。
C"(脂3)2 '4//20 + (應4)3尸<94 -3//20 —Ca10CPO4)6C2
上述步骤中，所用的稀酸为稀磷酸、稀醋酸、稀甲酸或稀丙酸中 的任意一种。
本发明类人胶原蛋白与纳米羟基磷灰石质量比为(0.25 4): 1,所
用的壳聚糖分子量为400,000 ~ 600，000Da,壳聚糖溶液的量占终溶液
的lwt%~4wt%;
步骤3)、 5)中共用的京尼平水溶液占混合溶液的0.5%~1%。
上述步骤6)中，所用的柱形模具直径为10mm，高度10-30mm。
上述步骤6)中，预冷温度在-20'C -196。C范围内。 为了更好的控制骨修复支架材料的结构和性能，本发明采用Minitab统
计学软件对骨修复材料成型工艺进行优化，并建立响应面模型指导骨修复
6材料的构建，大大缩短了制备技术周期，减少了工作量，为后期产业化生 产奠定了一定基础。
具体实施例方式
下面通过具体实施实例对本发明作进一步说明，本发明所述百分比为 质量百分比。
实施例1:
在100。C下，Ca(N03)2溶液与(NH4)3P04溶液反应，反应体系的pH值
用0.1MNHyH20调节使其保持pH9士0.1,持续搅拌反应4h,制备得到针
状纳米羟基磷灰石混悬液。反应式如下
Cfl(M 3)2 ,4//20 + (服4)3尸04 -3//2(9 —Ca10CPO4)6(O /)2
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成4%的溶液，将前述制备的纳米羟基磷 灰石混悬液逐滴加至类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷 灰石质量比为6: 4,温和搅拌6h，静置过夜，用0.1MNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld，真空冷冻干燥24 h，制得重组类人胶原 11(RHLCII)/纳米羟基磷灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用稀醋酸溶解成0.01% 的溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用0.1MNaOH调整 溶液pH至7.0,再次加入胶原至pH为6.4，再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0，以上步骤重复三次，壳聚糖溶液的加入总量为 混合溶液质量的1%，在冰洛下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后 加入京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.61%。将上 述混合溶液倾入不锈钢模具，在4。C下冷藏4h, -8(TC预冷冻3h后真空冷 冻干燥48 h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后 保藏；钴6()消毒后，将细胞密度为5xl(^cells/cmS的BMSCs接种于边长为 5mm,厚度为2mm的上述材料上；培养7d后换诱导培养基培养材料上的 BMSCs细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复 复合材料。实施例2:
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成3%的溶液，将前述制备的纳米羟基磷 灰石混悬液逐滴加入类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷 灰石质量比为6: 4，温和搅拌6h，静置过夜，用0.1 MNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld，真空冷冻干燥24 h,制得重组类人胶原 n(RHLCII)/纳米羟基嫌灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用醋酸溶解成0.01%的 溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用0.1MNaOH调整溶 液pH至7.0,再次加入胶原至pH为6.4，再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0。以上步骤重复四次，壳聚糖的加入总量为混合 溶液质量的2%,在冰洛下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后加入 京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.61%。将上述混 合溶液倾入不锈钢模具，在4"C下冷藏4h， -80°<:预冷冻3 11后真空冷冻干 燥48h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后保藏,-钴6°消毒后，将细胞密度为5xlO"cells/cr^的BMSCs接种于边长为5mm, 厚度为2mm的上述材料上；培养4d后换诱导培养基培养材料上的BMSCs 细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材 料。
实施例3:
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成4%的溶液，将前述制备的纳米羟基磷 灰石混悬液逐滴加入类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷 灰石质量比为6: 4，温和搅拌6h，静置过夜，用O.lMNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld,真空冷冻干燥24 h，制得重组类人胶原 n(RHLCII)/纳米羟基磷灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用稀甲酸溶解成0.01% 的溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用0.1MNaOH调整 溶液pH至7.0,再次加入胶原至pH为6.4,再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0。以上步骤重复三次，壳聚糖的加入总量为混合
8溶液质量的3%，在冰浴下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后加入
京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.61%。将上述混 合溶液倾入不锈钢模具，在4"C下冷藏4h, -801:预冷冻3 11后真空冷冻干 燥48h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后保藏； 钴6()消毒后，将细胞密度为5xl04 cells/cm2的BMSCs接种于边长为5mm， 厚度为2mm的上述材料上；培养8d后换诱导培养基培养材料上的BMSCs 细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材 料。
实施例4:
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成4%的溶液，将前述制备的纳米羟基磷 灰石混悬液逐滴加入类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷 灰石质量比为4: 4,温和搅拌6h,静置过夜，用O.lMNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld,真空冷冻干燥24 h,制得重组类人胶原 n(RHLCII)/纳米羟基磷灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用稀酸溶解成0.01%的 溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用O.lMNaOH调整溶 液pH至7.0,再次加入胶原至pH为6.4，再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0。以上步骤重复三次，壳聚糖的加入总量为混合 溶液质量的4%，在冰浴下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后加入 京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.61%。将上述混 合溶液倾入不锈钢模具，在4'C下冷藏4h， -80°(:预冷冻3 11后真空冷冻干 燥48h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后保藏； 钴6()消毒后，将细胞密度为5xl(^cells/cn^的BMSCs接种于边长为5mm， 厚度为2mm的上述材料上；培养3d后换诱导培养基培养材料上的BMSCs 细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材 料。
实施例5:将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成4%的溶液，将前述制备的纳米羟基礫 灰石混悬液逐滴加入类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷
灰石质量比为2: 8，温和搅拌6h,静置过夜，用O.lMNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld，真空冷冻干燥24 h，制得重组类人胶原 n(RHLCII)/纳米羟基磷灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用稀酸溶解成0.01%的 溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用O.lMNaOH调整溶 液pH至7.0，再次加入胶原至pH为6.4,再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0。以上步骤重复三次，壳聚糖的加入总量为混合 溶液质量的2%,在冰浴下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后加入 京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.52%。将上述混 合溶液倾入不锈钢模具，在4'C下冷藏4h， -80匸预冷冻3 11后真空冷冻干 燥48h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后保藏； 钴氛消毒后，将细胞密度为5xlO、ells/cn^的BMSCs接种于边长为5mm， 厚度为2mm的上述材料上；培养5d后换诱导培养基培养材料上的BMSCs 细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材 料。
实施例6:
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成4%的溶液，将前述制备的纳米羟基磷 灰石混悬液逐滴加入类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷 灰石质量比为4: 6，温和搅拌6h,静置过夜，用O.lMNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld，真空冷冻干燥24 h，制得重组类人胶原 n(RHLCII)/纳米羟基磷灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用稀酸溶解成0.01%的 溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用0.1MNaOH调整溶 液pH至7.0，再次加入胶原至pH为6.4,再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0。以上步骤重复三次，壳聚糖的加入总量为混合 溶液质量的2%,在冰浴下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后加入京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.61%。将上述混
合溶液倾入不锈钢模具，在4。C下冷藏4h, -8(TC预冷冻3h后真空冷冻干 燥48h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后保藏； 钴幼消毒后，将细胞密度为5xlO、ells/cmS的BMSCs接种于边长为5mm, 厚度为2mm的上述材料上；培养6d后换诱导培养基培养材料上的BMSCs 细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材 料。
实施例7:
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成4%的溶液，将前述制备的纳米羟基磷 灰石混悬液逐滴加入类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷 灰石质量比为7: 2,温和搅拌6h，静置过夜，用O.lMNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld，真空冷冻干燥24 h,制得重组类人胶原 n(RHLCII)/纳米羟基磷灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用稀酸溶解成0.01%的 溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用O.lMNaOH调整溶 液pH至7.0,再次加入胶原至pH为6.4,再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0。以上步骤重复三次，壳聚糖的加入总量为混合 溶液质量的2%,在冰浴下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后加入 京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.61%。将上述混 合溶液倾入不锈钢模具，在4。C下冷藏4h， -801:预冷冻3 11后真空冷冻干 燥48h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后保藏； 钴幼消毒后，将细胞密度为5xl(^cells/cm2的BMSCs接种于边长为5mm, 厚度为2mm的上述材料上；培养7d后换诱导培养基培养材料上的BMSCs 细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材 料。
实施例8:
将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成4%的溶液，将前述制备的纳米羟基磷灰石混悬液逐滴加入类人胶原蛋白溶液中，使类人胶原蛋白与纳米羟基磷
灰石质量比为6: 4,温和搅拌6h,静置过夜，用O.lMNaOH调整溶液pH 至7.0。加入京尼平交联ld，真空冷冻干燥24 h，制得重组类人胶原 n(RHLCII)/纳米羟基磷灰石(nHA)粉末。将壳聚糖用稀酸溶解成0.02%的 溶液；将RHLCII/nHA粉末逐滴加入壳聚糖溶液中，用O.lMNaOH调整溶 液pH至7.0,再次加入胶原至pH为6.4,再次加入前述壳聚糖溶液，用 NaOH调整溶液pH至7.0。以上步骤重复三次，壳聚糖的加入总量为混合 溶液质量的2%,在冰浴下利用超声波震荡使混合溶液充分分散，然后加入 京尼平溶液交联l-3d。最终保持京尼平溶液占总溶液的0.61%。将上述混 合溶液倾入不锈钢模具，在4。C下冷藏4h， -8(TC预冷冻3h后真空冷冻干 燥48h。再用PBS (pH=7.3)缓冲液反复浸洗，然后将其二次冻干后保藏； 钴6°消毒后，将细胞密度为5xl(^cells/cm2的BMSCs接种于边长为5mm, 厚度为2mm的上述材料上；培养8d后换诱导培养基培养材料上的BMSCs 细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材 料。
骨修复复合材料性能测试实验
1、 支架材料的机械性能
各种骨修复复合支架材料的抗压强度性能由Instron 5565型电子万能实 验机检测(纯nHA为对照)。将样品制成圆片OlOmm xl3mm，釆用100N 载荷传感器，横梁的位移速度为lmm7min，得到样品断裂时的应力与应变 并计算出材料的杨氏模量。每种材料平行检测5个样品。以类人胶原蛋白 与纳米羟基磷灰石混合质量比为4: 6的支架材料为实验材料，测试结果表 明该支架具有良好的机械性能，样品抗压强度为80.46±5.4MPa,应变(％) 为50±1.2,而nHA的抗压强度和杨氏模量均因太脆而无法测量。
2、 支架材料的体外降解实验
将所有样品(OlOmm xl3 mm)放入pH值为7的模拟体液SBF溶液中，于37t:的恒温摇床内，低速摇动，每隔7-10d取出，放于烘箱内4(TC干燥、 称重。溶胀过程中样品的质量损失率为
D = (ml -m2)/ml xlOO%
式中ml为降解前的质量;m2为降解后的质量；
结果表明壳聚糖量的增加到2%时，材料的抗压强度较髙、3个月后质 量损失率较低，弥补了单用亲水性的重组类人胶原和壳聚糖降解速度过快 的缺点，满足骨修复所达到的要求。
3、 生物相容性研究
当类人胶原蛋白、纳米羟基磷灰石和壳聚糖复合时，能更好地促进骨 髓间充质干细胞的黏附与增殖，为骨髓间充质干细胞提供了更适于其生长 的空间结构与环境。
4、 成骨诱导活性研究
所有样品经BMSCs细胞经诱导培养后(完全培养基为对照)，活细胞 密度呈倍生长，14天培养后无死细胞出现，贴附率接近100%, ALP值为 570.4(pNPP mM/min)/((igDNA),活性显著高于培养皿中的活性57.8(pNPP mM/min)/(吗DNA),几乎是培养皿中的10倍。与通过美国FDA标准ALP 值的CPC材料活性相当，且有钙结节产生。
权利要求
1.一种制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的方法，其特征在于包括以下步骤1)将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1％～5％的溶液；2)制备羟基磷灰石混悬液；3)将羟基磷灰石混悬液加至类人胶原蛋白溶液中，用NaOH溶液调至溶液pH至7.0，加入0.1-1％的京尼平4℃交联，真空冷冻干燥制得类人胶原蛋白/羟基磷灰石粉末；4)将壳聚糖用稀酸溶解成0.01％～0.04％的溶液；5)将类人胶原蛋白/羟基磷灰石粉末加至壳聚糖溶液中，用NaOH溶液调至溶液pH至7.0，重复加入1％～5％的类人胶原蛋白溶液和0.01％～0.04％壳聚糖溶液，然后加入0.1-1％的京尼平溶液交联1-3d；6)将上述混合溶液真空冷冻干燥；7)将细胞密度为5×104cells/cm2的BMSCs接种于步骤6)材料上；8)培养1-10d后，换诱导培养基培养BMSCs细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材料。
2. 根据权利要求1所述制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的 方法，其特征在于所用的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发 酵生产的一种人源型胶原蛋白。
3. 根据权利要求1所述制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的 方法，其特征在于羟基磷灰石混悬液使用以下方法制备Ca(N03)2溶液与 (NH4)3P04溶液反应，反应体系的pH值用NH3'H20调节使其保持pH 9±0.1。
4. 根据权利要求1所述制备可生物降解的组织工程用仿生人工骨材料的方法，其特征在于所用的壳聚糖分子量为400,000 ~600,000Da。
5. 根据权利要求1所述制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的 方法，其特征在于壳聚糖溶液的总量占终溶液的1%~4%。
6. 根据权利要求1所述制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的 方法，其特征在于所述稀酸为稀磷酸、稀醋酸、稀甲酸或稀丙酸中任意一 种。
7. 根据权利要求1所述制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的 方法，其特征在于类人胶原蛋白与纳米羟基磷灰石质量比为(0.25~4): 1。
8. 根据权利要求1所述制备可生物降解的组织工程用仿生人工骨材料 的方法，其特征在于步骤3)和5)中所用的京尼平水溶液占混合溶液的 0.5% ~ 1%。
9. 根据权利要求1所述制备可生物降解的组织工程用仿生人工骨材料 的方法，其特征在于步骤6)中，预冷温度在-20。C ~-196°C。
全文摘要
本发明公开了一种制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的方法，包括以下步骤将羟基磷灰石混悬液加至类人胶原蛋白溶液中，加入京尼平交联，真空冷冻干燥制得类人胶原蛋白/羟基磷灰石粉末；将类人胶原蛋白/羟基磷灰石粉末加至壳聚糖溶液中，用NaOH溶液调至溶液pH至7.0，重复加入类人胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液，然后加入京尼平溶液交联；将混合溶液冷冻干燥；将细胞密度为5×10<sup>4</sup>cells/cm<sup>2</sup>的BMSCs接种于上述材料上；培养1-10d后，换诱导培养基培养BMSCs细胞，诱导其向成骨方向分化，最终形成具有诱导骨活性的骨修复复合材料。本发明制备的人工骨材料骨诱导活性以及免疫相容性优异，彻底杜绝了动物胶原蛋白支架材料所不可避免的病毒隐患，使用安全性大幅度提高。
文档编号A61L27/12GK101584884SQ20091002300
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者惠俊峰, 朱晓丽, 朱晨辉, 钰 米, 范代娣, 薛文娇, 沛 马, 马晓轩, 骆艳娥, 琛 高 申请人:西北大学