专利名称：人CSAG1基因的shRNA及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人CSAGl基因，特别是涉及一种人CSAGl基因的 shRNA (shorthairpin RNA，短发夹状 RNA)及应用。
背景技术：
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，因其恶性度高、病情进展快，病人早期一般没有 什么不适，一旦出现症状就诊，往往已属中晚期，故治疗难度大、疗效差。CT(Cancer-teStiS，肿瘤-睾丸)抗原，又称肿瘤共享抗原，一般在正常组织中不 表达，但在人生殖细胞系正常表达，在多种不同类型的肿瘤中也均有表达，包括黑色素瘤， 膀胱癌，肺癌，肝癌等，这些具有免疫原性的蛋白正在被积极发展为肿瘤治疗疫苗的靶点。 目前为止已有多达80多个CT抗原家族被鉴定。CT抗原在肿瘤形成中的作用也正在受到进 一步评估，精子发生过程中的部分基因表达程序在肿瘤发生时重新开放，可能有助于恶性 肿瘤的表型特征_永生化，侵袭性，免疫逃逸，基因组低甲基化和转移能力。CT抗原根据编码它们基因的染色体定位可分为X染色体连锁CT抗原(X-CT)和常 染色体(non-x CT)即非X染色体连锁抗原。在正常睾丸中X染色体连锁的CT抗原通常在 精原细胞中表达，而精原细胞是在睾丸中保持不断增殖的一类生殖干细胞。由于生殖干细 胞、发生于胚胎滋养层的细胞和肿瘤细胞有着许多共有的特征，在已知癌基因和抑癌基因 无突变的情况下，原本已沉默的生殖细胞系特异性表达基因在肿瘤干细胞中被激活后可以 调节肿瘤的恶性表型。值得强调的是，据估计X染色体上约有10%的基因属于X染色体连 锁CT基因。因此，选取X染色体连锁的CT基因为对象研究其在肝癌发生发展中的作用机 制。人CSAGl 基因(Genbank No. NM_153478. 1,NM_153479. 1)是 CT 抗原家族的成员之 一。关于CSAGl基因与肝癌发生的关系有待进一步研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种人CSAGl基因的shRNA。本发明要解决的技术问题之二是提供一种人CSAGl基因的shRNA在制备抑制肝癌 细胞生长的药物中的应用。为解决上述技术问题，本发明的一种人CSAGl基因的shRNA，包括由编码SEQ IDN0. 3所示序列和编码SEQ ID NO. 4所示序列构成的CSAGl_shl35，及编码SEQ ID NO. 5 所示序列和编码SEQ ID NO. 6所示序列构成的CSAGl-shl36。另外，本发明提供一种人CSAGl基因的shRNA在制备抑制肝癌细胞生长的药物中 的应用。本发明的人CSAGl基因的ShRNA能显著抑制人CSAGl基因表达，使肝癌细胞的存 活率显著低于对照组的细胞，因此，本发明的shRNA可应用于在制备抑制肝癌细胞生长的 药物中，为治疗肝癌新药的开发提供新的途径。
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明图1是定量PCR鉴定各pSUPER载体的RNA干扰靶基因的效果图；图2是各pSUPER载体与pcDNA3. 1共转染PLC/PRF/5、Focus后，重新接种培养，经 新霉素筛选后，去除培养液，IXPBS漂洗两遍后结晶紫染色后照片。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。实施例1一 .shRNA 设计原则shRNA设计原则与SiRNA设计原则相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相对于 外源导入的siRNA在细胞内的有效浓度要低。shRNA末端设计以及双链的热稳定性是以DNA 设计为基础，而siRNA是以mRNA为基础。1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA” 二连序列，并记下其 3’端的19个碱基序列，作为潜在的干扰靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不 包括AA或者NA重复)来设计；2)避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列；3)靶序列的GC含量应为30 % 60 %左右；4)尽量避免针对5’和3’端的非编码区(untranslated regions, UTRs)设计靶 序列，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复 合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响干扰的效果。5)将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源 性。6)将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/ EST同源的序列。7)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列，以找到最 有效的干扰序列。8)阴性对照。本实施例中的设计的shRNA序列，具体如表1。表权利要求
一种人CSAG1基因的shRNA，其特征在于包括由编码SEQ ID NO.3所示序列和编码SEQ ID NO.4所示序列构成的CSAG1 sh135，及编码SEQ ID NO.5所示序列和编码SEQ ID NO.6所示序列构成的CSAG1 sh136。
2.如权利要求1所述的人CSAGl基因的shRNA在制备抑制肝癌细胞生长的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的人CSAGl基因的shRNA是 CSAGl-shl35 和 CSAGl_shl36 这两种 shRNA。
全文摘要
本发明公开了一种人CSAG1基因的shRNA及应用，该人CSAG1基因的shRNA，包括由编码SEQ ID NO.3所示序列和编码SEQ ID NO.4所示序列构成的CSAG1-sh135，及编码SEQ ID NO.5所示序列和编码SEQ ID NO.6所示序列构成的CSAG1-sh136。该人CSAG1基因的shRNA可应用于制备抑制肝癌细胞生长的药物中，为治疗肝癌新药的开发提供新的途径。
文档编号A61P35/00GK101993875SQ200910057790
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者邓庆, 韩泽广, 黄健 申请人:上海人类基因组研究中心