专利名称：一种修饰的小干扰核酸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种修饰的小干扰核酸及其制备方法。
背景技术：
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。RNA干扰技术又被形 象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基 因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最 早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中 的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了 RNA 干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为 21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，被称为小分子干 扰核酸(siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC)。在 RNA 干扰过程中，双链 siRNA 中的正义链被 排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶 III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。但是，由于小分子干扰核酸(siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因 此人们对合成的siRNA进行化学修饰，以增加siRNA的血清稳定性，从而有效地抑制目的基 因的表达。目前，由于人们对siRNA在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解，只能依靠 各自的经验随机地选择siRNA分子中的多个核苷酸进行化学修饰。这种修饰策略虽然能很 好地提高siRNA分子的血清稳定性，但由于缺乏理论的指导，通常在siRNA分子中引入了过 量的修饰，增加了修饰后的siRNA的细胞毒性，并在很多情况下降低了 siRNA的生物学活 性，因而制约了修饰后的siRNA在体内的应用。另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修饰的做法，也限制了一些具有较 好稳定效果，但细胞毒性相对较大的修饰方法在体内研究中的应用。因此，设计具有针对性的修饰方案，通过最少的修饰来实现最优的稳定性目的是 目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的siRNA的修饰方案中存在盲目地引入大量的修饰 从而导致得到的修饰的小干扰核酸细胞毒性大问题，提供一种血清稳定的、具有良好生物 活性的且细胞毒性较低的修饰的小干扰核酸，以及这种小分子干扰核酸的制备方法。本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第 一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第 二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA
3序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其中，所述UA/UA位点中的至少一个核苷 酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。本发明通过对UA/UA位点进行特异性的修饰，从而在仅引入少量修饰的情况下， 即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸 分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
具体实施例方式本发明提供的修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片 段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第二片 段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列 与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其中，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是 经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。本发明的发明人对小干扰核酸分子在体内的降解过程进行了细致的研究，发现在 UA/UA位点中仅引入少量修饰的情况下，即可提高修饰的小干扰核酸分子的稳定性，大大降 低了由于随机地引入大量的修饰而导致的细胞毒性较高，以及修饰对小干扰核酸的生物学 活性的影响。根据本发明，所述的“第一片段”是指具有与基因编码链的序列全部或部分同源的 序列的核苷酸片段，所述“第二片段”是指具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片 段。所述“互补”是指两个核苷酸在杂交条件下能够配对，例如，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T) 或尿嘧啶(U)之间能够配对，以及胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)之间的配对。根据本发明，所述小干扰核酸分子的标靶可以为各种基因，例如，可以将在细胞 内的功能有待分析的基因作为标靶，也可以将需要抑制其表达的基因作为标靶，例如，可 以以与疾病或紊乱相关的基因作为标靶，如癌基因、病毒基因、细胞膜表面受体基因、细 胞核受体基因或细胞信号传导通路上的基因等。本领域的技术人员根据其标靶基因，能 够设计得到小干扰核酸分子(siRNA)，例如，将目的基因的靶标序列或目的基因在NCBI Genbank中的序列号输入各种小干扰核酸设计程序，如Insert Design Tool for the shRNA Vectors(Ambion)>shRNA Explorer (Gene Link)> siDirect(Yuki Naito et al. University of Tokyo)、 SiRNA at Whitehead(Whitehead Institute for Biomedical Research), BLOCK-iT RNAi Designer(invitrogen)、RNAi Design(IDT)，RNAi Explorer(Gene Link)、 siRNA Target Finder(Ambion)、或 siSearch(Stockholm Bioinformatics Center)等， 该设计程序将会根据设计者的要求和siRNA的设计原则，针对所提供的基因或序列设计 siRNA。并且，有些程序能够对设计好的siRNA做全基因组或mRNA转录组的同源性分析，从 而设计出对靶基因或靶序列特异的siRNA。上述提及的siRNA设计程序及其涉及的原则为 本领域技术人员所公知，其全部内容在此一并引入作为参考。根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以包含多个UA/UA位点，并且该多个UA/UA 位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。此外，所述修饰的小干扰核酸中，除了所述UA/UA位点中的核苷酸以外，其它核苷 酸是未经过修饰的。在这种情况下，不但能够提高所述修饰的小干扰核酸的稳定性、维持其 生物活性，还可以使在修饰的小干扰核酸分子中引入的修饰数量最小化，从而进一步地降低修饰引起的小分子干扰核酸的细胞毒性。优选情况下，所述修饰的小干扰核酸的UA/UA位点中，只有一个尿嘧啶核苷酸是 经过修饰的。本发明的发明人意外地发现，只要对所述UA/UA位点中的一个尿嘧啶核苷酸 进行修饰，就可以提高修饰的小干扰核酸的稳定性，并维持其生物活性，这种情况下，可以 使在修饰的小干扰核酸中引入的修饰数量最小化，从而更进一步地降低修饰引起的小分子 干扰核酸的细胞毒性。根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以为单链分子也可以为双链分子。当所述修饰的小干扰核酸为单链分子时，所述第一片段和第二片段之间的互补区 域形成双链区域。当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，该修饰的小干扰核酸包括正义链和反义 链，所述正义链可以为连续的核苷酸链，也可以为不连续的核苷酸链；所述反义链为连续的 核苷酸链。根据本发明的一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义链， 且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正义链，所述第二片段位于 反义链。根据本发明的另一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸包括正义链和反义 链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链；所述反义链为 连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述第二片段位于反义链。本发明中，术语“正义链”是指当所述修饰的小干扰核酸为双链分子时，具有与基 因编码链的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述“反义链”是指当所述修饰的小 干扰核酸为双链分子时，具有与基因编码链的序列互补的序列的核苷酸片段。并且，当所述 修饰的小干扰核酸为双链分子且所述正义链和反义链为连续的核苷酸链时，术语“正义链” 和“第一片段”可以互换使用，术语“反义链”和“第二片段”可以互换使用。本发明中，术语“正义链部分”是指当所述正义链为不连续的核苷酸时，用于组成 正义链的一部分核苷酸链；在所述正义链中，该正义链的所有正义链部分的总长度与所述 正义链的长度相等，并且，当所述正义链部分中包含UA/UA位点时，术语“正义链部分”与 “第一片段”可以互换使用。根据本发明，所述修饰的小干扰核酸可以由核糖核苷酸组成，也可以为包括核糖 核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。根据本发明，术语“细胞毒性”是指由于对核苷酸分子进行修饰而造成的对细胞的
毒性作用。本发明中，所述修饰的方式为本领域技术人员所公知，例如，本发明对所述小分子 干扰核酸进行的化学修饰为以下的一种或几种(1)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的的修饰；(3)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰 (Phosphorthioate)和硼烷化磷酸盐修饰(Boranophosphate)。如图所示分别用硫和硼烷 置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定小分子干扰核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。而硼烷化磷酸盐修饰的小干扰核酸的疏水性强，易于在血浆中形成水合
蛋白，对人体的毒副作用低于硫代磷酸酯。 硫代磷酸修饰
硼烷化磷酸盐修饰所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中羟基(2' -0H)的修饰。在核糖的羟基位置引 入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清核糖核酸酶不易识别小干扰核酸，增加了小干扰核 酸的稳定性。使小干扰核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中羟基的修 饰包括 2'-氟修饰(2' -fluro modification) ；2'-氧甲基修饰(2' -0ME) ；2'-甲氧 乙基修饰(2' -M0E) ；2,4' -二硝基苯酚修饰(2' -DNP modification)；锁核酸(LNA)； 2'-氨基修饰(Amina modification) ；2'-脱氧修饰(2' -Deoxy modification)等等。
锁核酸 2’－氨基修饰 2'-脱氧修饰所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，如在尿嘧啶的5位点引入溴或碘的 5'-溴尿嘧啶(5 ‘ -bromo-uracil)和5'-碘尿嘧啶(5 ‘ -iodo-uracil)修饰是常使 用的碱基修饰方法，其他还有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰，2，6-二氨基嘌呤 (2，6-diaminopurine)修饰等。 5'-溴尿嘧啶 N3-甲基脲嘧啶2，6-二氨基嘌呤优选情况下，所述修饰为对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -0H的 修饰。进一步优选为，所述修饰为所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -0H被甲 氧基或氟取代。上述修饰均可以增加所述小干扰核酸的血清稳定性，增强其对血清核酸酶 水解的抵抗能力。本发明还提供了一种修饰的小干扰核酸的制备方法，其中，该方法包括根据未修 饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的小干扰核酸包 括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段 包含至少一个连续的UA序列，所述第二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补 的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其 中，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳 定性高于未修饰的小干扰核酸。根据本发明的一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以包 括根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的小 干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰的 小干扰核酸包含多个UA/UA位点，并且该多个UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰 的。根据本发明的另一个方面，本发明提供的所述修饰的小干扰核酸的制备方法可以 包括根据未修饰的小干扰核酸的核苷酸序列，并使用经过修饰核苷酸替代所述未修饰的 小干扰核酸的核苷酸序列中相应位置的核苷酸，来合成修饰的小干扰核酸，使得到的修饰 的小干扰核酸中，除了所述UA/UA位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。并 且，优选情况下，得到的修饰的小干扰核酸的UA/UA位点中，只有一个尿嘧啶核苷酸是经过 修饰的。本发明中，本发明提供的修饰的小干扰核酸的结构为本领域技术人员所公知，可 以为各种小干扰核酸的存在结构。例如，根据本发明的一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸可以为发夹结构 的单链分子，所述第一片段和第二片段之间的互补区域形成双链区域。根据本发明的另一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸可以包括正义链和反 义链，所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正义链，所述第二片段位 于反义链。根据本发明的另一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸可以包括正义链和反 义链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核苷酸链；所述反义链 为连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述第二片段位于反义链。根据本发明的另一个方面，本发明提供的修饰的小干扰核酸可以为为包含核糖核 苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。本发明中，合成小干扰核酸的方法可以为各种常规的小干扰核酸的合成方法， 或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海吉玛制药技术有限公司 (GenePharma)、广州锐博生物科技有限公司、或英俊生物技术有限公司(invitrogen)进行 合成。—般来说，用于合成小干扰核酸的方法包括以下四个过程(1)寡聚核糖核苷酸 的合成；⑵脱保护；⑶纯化分离；⑷脱盐。例如，具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如 下(1)寡聚核糖核苷酸的合成在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’ -0-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一 个碱基，然后在第n次(19 > n > 2)循环中，在第n_l次循环所连接的碱基上连接一个碱 基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。(2)脱保护将连接有小干扰核酸的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙 醇/乙胺(体积比为1 3)，然后密封，置于55-70°C温箱中，孵育2-30小时，取出连接有 小干扰核酸的固相支持物并用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液，并在室温下干 燥30分钟。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再 加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到小干扰核酸的粗产物。(3)纯化分离将得到的小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液 中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的小干扰核酸产物。(4)脱盐用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的小干扰核酸产物2-4次(每次2毫 升)，除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫 升的缓冲液中(10mM Tris, pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，将此溶液加热至95°C，然后缓缓将 此溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有小干扰核酸的溶液。上文中给出多种实施方式的目的仅为示例性地对本发明进行说明，而不是为了限 制本发明的范围。下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基 均为市售商品。实施例1选取下表中的基因为靶基因，并委托上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma) 合成表1-127中的siRNA。实施例2通过以下方法分别对表1-127中所示的siRNA进行血清稳定性检测、基因沉默效 率检测和细胞毒性检测1.血清稳定性检测将4 ii L浓度为20 ii M的未修饰的和不同化学修饰小干扰核酸加入到含有4 y L胎 牛血清和32iiL 1XPBS溶液中，血清的终浓度为10%;在37°C条件下将反应体系孵育一定 的时间后取样，一般为0，3和6小时；每次取10 y L样本并进行液氮速冻，以立即中止血清 核酸酶对siRNA的作用，然后将样本保存于-80°C条件下备用。配置20%的聚丙烯酰氨凝胶，将3iiL的上样缓冲液(30mM EDTA，36%甘油， 0. 06%溴酚蓝)与siRNA的降解样本进行混合，然后上样，在80mA的恒流条件下电泳。电 泳结束后，用lXSybr Gold染料(Invitrogen，Cat. 11494)进行10分钟的染色后照相，结 果如表1-127所示。2.基因沉默效率检测将在DMEM培养基(10% FBS，2mM L_谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和 100 u g/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1X105细胞/0. 5ml培养基/孔)。待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50%左右时，将培养基换为 Opti-MEM培养基(Gibco公司)。然后将带有siRNA分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报 告质粒和pRL-TK (编码海肾萤光素酶)的对照质粒(Promega公司，Madison WI，USA)与化 学合成的siRNA通过Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美国)进行细胞转染，每孔含 0. 17g重组质粒和0. 017g pRL-TK对照质粒，siRNA的终浓度为13nM。每种siRNA平行转 染三个复孔，以只转染同样量的两种报告基因质粒，不转染siRNA的三个复孔作为对照。4 小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基(10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升 的青霉素和100 u g/ml的链霉素)。24小时后收获细胞，以10 ill细胞裂解液细胞，利用双 荧光素酶报告基因分析系统(Dual-Luciferase Assay System, Promega公司)和酶标仪 (Novostar，BMG Labtechnologies GmbH,Germany)测定两种荧光酶的活性，以未转染siRNA 的孔中的报告基因的表达量作为标准对照，通过以下公式计算得到siRNA对靶位点的沉默 效率，结果如表2所示。每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复2次，结果如 表1-127所示。沉默效率=(实验组Firefly荧光素酶的表达量/实验组Renilla荧光素酶表达 量)/(对照组Firefly荧光素酶的表达量/对照组Renilla荧光素酶表达量)3、修饰siRNA的细胞毒性检测将在DMEM培养基(10% FBS，2mM L_谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和 100 u g/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1父105细胞/ 孔)；待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50%左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基 (Gibco公司)；然后将化学合成的siRNA通过Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美 国)进行细胞转染，siRNA的终浓度为13nM，每种siRNA平行转染三个复孔，无siRNA的三 个转染复孔作为对照；4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基(10% FBS，2mML_谷氨 酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100 u g/ml的链霉素)；24小时后吸去培养液，用PBS 洗涤一次，每孔加1ml PBS和10 ill MTT(噻唑蓝)染液，在37°C 5% C02的二氧化碳培养 箱中培养4 6小时；每孔加0. lml酸化异丙醇，在振荡器上振荡混勻，让还原产物充分溶 解；酶联免疫检测仪测定570nm处各孔A值，并按照以下公式计算细胞生长抑制率，结果如 表1-127所示。细胞生长抑制率(％ )=(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A 值 X100%。表 1 表 2 表 4 表 5 表 6 表9 表 10 表11 表 12 表14表17 表18
表19 表 22 表 25
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表 26
表 27 表 28 表 29
25 表30 表31 表 32 表 37 表 39 表 40
表41
表 47 表 48
表 49 表 52 表53
表54 表 57 表 58
表 59
37 表 60
表 61
表 62 表 63
表 64 表 65
表 66
表67 表 68 表 69表 77 表 80
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表 82 表 84 表 90
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表 92 表 93
表 94 表 95
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表97 表 98
表 99 表 105 表 106
表 107 表 108 表 109
表 110
表 111
表 112
表 113 表 114
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表 121 表 122
表 123
<120> 一种修饰的小干扰核酸及其制备方法
<130>I10554PKU
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1500
<212>DNA
<213> 人类(Homo sapiens BIC) <400>1
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73
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权利要求
一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其特征在于，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。
2.根据权利要求1所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸包含多个UA/ UA位点，并且该多个UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的。
3.根据权利要求1所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰核酸中，除了所述 UA/UA位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。
4.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述UA/UA位点 中，只有一个尿嘧啶核苷酸是经过修饰的。
5.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰 核酸为发夹结构的单链分子，所述第一片段和第二片段之间的互补区域形成双链区域。
6.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰 核酸包括正义链和反义链，所述正义链和反义链为连续的核苷酸链，所述第一片段位于正 义链，所述第二片段位于反义链。
7.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰 核酸包括正义链和反义链，所述正义链是包括两个或两个以上的正义链部分的不连续的核 苷酸链；所述反义链为连续的核苷酸链；所述第一片段位于一个或多个正义链部分，所述 第二片段位于反义链。
8.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小干扰核酸，其中，该修饰的小干扰 核酸为包含核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。
9.根据权利要求1-3中的任意一项所述的修饰的小分子干扰核酸，其中，所述修饰为 如下的修饰中的至少一种(1)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中核糖的修饰；(3)对所述小分子干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。
10.根据权利要求9所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述修饰为对所述小分子干扰核 酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修饰。
11.根据权利要求10所述的修饰的小干扰核酸，其中，所述修饰为所述小分子干扰核 酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH被甲氧基或氟取代。
全文摘要
本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包含至少一个连续的UA序列，所述第二片段包含至少一个与所述第一片段的UA序列互补的连续的UA序列，所述第一片段的UA序列与所述第二片段的UA序列形成UA/UA位点，其中，所述UA/UA位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸。本发明在仅引入少量修饰的情况下，即可达到增加修饰后的小干扰核酸的血清稳定性的目的，从而降低了修饰后的小干扰核酸分子的潜在的细胞毒性，以及修饰对小干扰核酸的生物学活性的影响。
文档编号A61K48/00GK101851618SQ20091008114
公开日2010年10月6日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者杜权, 梁子才 申请人:北京大学