专利名称：：表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治高脂性脂肪肝药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治高脂性脂肪肝药物中的应用。
背景技术：
：脂肪肝是由多种原因引起的肝脏脂肪代谢紊乱，脂类物质动态平衡失调，肝细胞摄取脂肪增加而脂肪氧化减少，导致肝细胞内脂肪蓄积过多的一种病理状态。近年来，随着人们生活方式和饮食结构的改变以及临床B超技术的进步和广泛应用，脂肪肝的检出率不断提髙，发病率和发病人数明显增加。我国脂肪肝的发病率占平均人口的10/。，在肥胖、嗜酒和糖尿病患者中可髙达50%-60%。并且随着年龄的增长而上升，发病年龄也有年轻化趋势。虽然脂肪肝被认为是良性病变，但它是许多慢性肝脏疾病的早期阶段，不经治疗的脂肪肝会逐渐发展为炎症细胞浸润、坏死、纤维化，并可能引起肝细胞癌变。因此，如何在早期阻止脂肪肝的进一步发展是目前研究的焦点。脂肪肝的病因比较复杂，常见如肥胖、糖尿病、营养不良等，特别是与髙脂血症有密切关系。通常根据病因的不同，将脂肪肝分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，而髙脂血症所致的脂肪肝，是属于非酒精性脂肪肝中的一种类型。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)是绿茶提取物茶多酚中含量最多的一种生物活性成分，诸多研究表明EGCG具有多种生物学功能，包括抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗紫外辐射等。
发明内容本发明目的是提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治髙脂性脂肪肝药物中的应用。本发明的技术方案是通过脂肪乳剂灌胃的方法建立高脂性脂肪肝大鼠模型，首次选用EGCG作为治疗药物，研究高脂性脂肪肝大鼠肝组织的病理学改变，观察EGCG对髙脂性脂肪肝大鼠模型的治疗作用，从而为EGCG治疗髙脂性脂肪肝提供实验依据。本发明所说的EGCG,其提取方法可参见现有技术，也可商业购得。本发明的优点是EGCG可以明显降低髙脂性脂肪肝大鼠的肝脏系数和血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)以及肝组织中TC、TG和肝组织中MDA的含量升髙血清髙密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)和肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)的含量。病理组织学检查结果显示，给予EGCG治疗的大鼠肝细胞脂肪变性程度和超微结构改变明显减轻。下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述其中图1为EGCG治疗6周后对高脂性脂肪肝大鼠病理形态的影响(HEX200);A:正常对照组；B:模型组C-E:分别为EGCG10、20和40mg/kg治疗组；F:阳性药(非诺贝特)对照组。图2为EGCG治疗6周后对髙脂性脂肪肝大鼠病理形态的影响(X8000);A:正常对照组模型组；C-E:分别为EGCG10、20和40mg/kg治疗组；F:阳性药(非诺贝特)对照组。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述，下列实施例仅用于证明本发明的实用性，便于对本发明的技术方案的理解，而并不限制本发明的保护范围实施例一、表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠髙脂性脂肪肝的治疗作用研究1材料与方法1.1实验动物SD大鼠，雄性，体重160~180g，清洁级，苏州大学实验动物中心供应，实验动物生产许可证号XCYK(苏)2002-0008,实验动物使用许可证号SYXK(苏)2002-0037。实验期间饲养室温度20±2*C。1.2药品和主要试剂EGCG，纯度95%，由杭州未田生物技术有限公司提供，批号20071123S。非诺贝特胶襄(阳性对照药)，由法国利博福尼制药有限公司提供，批号90052，规格为200mg/粒，进口药品注册证号H20050004,临用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制1%的药物浓度。胆固醇和3号胆盐，由上海楷洋生物技术有限公司提供，批号20070712。丙基硫氧嘧啶，由苏州东瑞制药有限公司提供，批号071011004。各指标检测试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。1.3实验方法[16]将SD大鼠随机分为2组，即正常对照组和造模组，造模组大鼠每天上午8:00-9:30灌服脂肪乳剂(内含猪油15%,胆固醇6%,3号胆盐2。/。，丙基硫氧嘧啶0.2%,丙二醇20%,吐温-8016。/<)，1ml/100g体重，l次/日，正常对照组灌服等体积的蒸馏水。连续灌服脂肪乳剂4周后随机取大鼠3只，病理检查见肝组织中充满弥散性脂质空泡时，提示高脂性脂肪肝已经形成(见Figl和Fig2)。此后继续灌服脂肪乳剂2周，并将已形成的脂肪肝大鼠随机分成EGCG10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg三个剂量组，非诺贝特20mg/kg组和脂肪肝模型组，每组大鼠10只，并开始给药，各给药组于每天下午2:00-3:30按不同剂量以0.2ml/100g体重灌胃，正常对照组和脂肪肝模型组给予等体积蒸馏水。连续给药6周后，于处理前12h禁食，不禁水，然后以4%水合氯醛1ml/100g体重腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，检测各项指标，取肝脏称重后分别用冰生理盐水和三氯甲垸甲醇(1:1)混合液制成10%匀桨，供肝组织SOD、MDA和肝脂质测定，另取同一部位两块肝脏分别以10%福尔马林溶液和4%戊二醛溶液固定，分别用光镜和电镜检查肝组织的形态学改变。1.4血清指标和肝系数测定按试剂盒提供的方法测定，即血清TC采用胆固醇氧化酶-PAP法测定，TG采用磷酸甘油氧化酶-PAP法测定，HDL-C采用磷钨酸镁(PTA-Mg++)沉淀法测定，LDL-C按下列公式计算，LDL-C-TC-(TG/2.2+HDL-C),ALT采用赖氏法测定，AST和FFA采用比色法测定。肝系数-肝重(g)/鼠重(100g)。1.5肝脂质测定每鼠称取肝组织500mg,加三氯甲烷甲醇(1:1)混合液至5ml后匀浆，匀浆液置4r24h后离心，取上清20jxL置另一试管中，室温放置12h以上，待三氯甲烷和甲醇挥发后，分别采用胆固醇氧化酶-PAP和磷酸甘油氧化酶-PAP法测定肝中的TC和TG含量。1.6肝组织中SOD、MDA和蛋白含量测定称取肝组织200mg,加冰生理盐水2ml后匀浆，离心取上清，分别按试剂盒方法测定SOD、MDA和蛋白含量。1.7统计学处理实验数据以x士s表示，显著性检验采用one-wayANOVA检验，对肝脏的病理学检査结果采用等级资料的秩和检验。2结果2.1对高脂性脂肪肝大鼠体重、肝重和肝系数的影响与正常对照组相比较，高脂性脂肪肝模型组大鼠肝重和肝系数明显升髙(P<0.01)。连续给药6周后，EGCG能显著地降低高脂性脂肪肝大鼠肝重和肝系数(P<0.05或P^.01)，并呈剂量依赖性趋势，但非诺贝特明显升高商脂性脂肪肝大鼠的肝重和肝系数(P<0.01〉。给药各组的大鼠体重未见明显影响(见表l)。表1对髙脂性脂肪肝大鼠体重、肝重和肝脏系数的影响(11=只数；mean士S，D.)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>##户<0,01，与正常对照组比较；承PO.05,"PO.01，与模型组比较2.2对高脂性脂肪肝大鼠血脂影响与正常对照组相比较，脂肪肝模型组大鼠血清TC、TG和LDL-C显著升髙(P<0.05或P<0.01)。连续给药6周后，EGCG能显著地降低高脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA的水平(P〈0.05或P<0.01),同时对血清HDL-C有一定的升髙作用(P〈0.05)。非诺贝特也能明显降低高脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA含量(P<0.05或P<0.01),但对HDL-C未见明显升高作用(见表2)。表2对髙脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA的影响(11=只数；mean士S.D.)组别nTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)FFA(umol/L)正常对照组102.19±0.380.95±0.150.86±0,140.90±0.45465±101模型组102.88±0.37##1.27±0.29##0.81±0.161.50±0.46##557±123EGCG10mg/kg102.47±0.51*1.04±0.19*0.93±0.151.07±0.42*425±152*EGCG20mg/kg102.40±0.54*0.96±0.]7**0.95土0.14*1.01±0.57*403±156*EGCG40mg/kg10102.23土0.46**0.88±0.24**0.97±0.14*0.86±0.47"391士121**非诺贝特20mg/kg2.04±0.43**0.80±0.14**0.88±0.090.80土0.48"438±117*PO.Ol，与正常对照组比较；*P<0.05,**尸<0.01，与模型组比较2.3对髙脂性脂肪肝大鼠肝功能指标的影响与正常对照组相比较，脂肪肝模型组大鼠血清ALT和AST水平明显升高(P<0.05)。连续给药6周后，EGCG可以降低大鼠血清ALT和AST水平(P<0.05或P<0.01)，但非诺贝特对ALT和AST未见有明显影响(见表3)。表3对高脂性脂肪肝大鼠肝功能指标的影响(11=只数；ineaniS.D.)组别nALT(KarU/L)AST(KarU/L)]f.常对照组1024.4±6.882.1±11.1模型组1033.0±8.7#93.8±〗2.2EGCG10mg/kg1026.0±9.49I.4±11.2EGCG20mg/kgEGCG40mg/kg非诺贝特20mg/kg10101023.6±6.6*21.6±4.8**27.7±7.381.1±12.8*78.3±10.2**86.6±11.3#^<0.05,与正常对照组比较；*尸<0.05,**尸<0.01，与模型组比较2.4对髙脂性脂肪肝大鼠肝组织中TC、TG、SOD和MDA的影响与正常对照组相比较，高脂性脂肪肝模型组大鼠肝组织中TC、TG和MDA显著增加(P<0.05或P<0.01),SOD明显降低(P<0.05)。连续给药6周后，EGCG能显著地降低髙脂性脂肪肝大鼠肝组织中TC、TG和MDA含量7(P<0.05或P<0.01)，升高SOD水平(P<0.05或P<0.01)。非诺贝特显著地降低肝组织中TC、TG和MDA含量(P<0.05或P<0.01),但是对SOD未见明显影响(见表4)。表4对髙脂性脂肪肝大鼠肝组织中TC、TG、SOD和MDA的影响(n^只数；mean士S.D.)#P<0.05,##P<0.01,与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01,与模型组比较脂质变性程度正常对照组模型组EGCG非诺贝特20mg/kg10mg/kg20mg/kg40mg/kg—100023+027667++08211+++000000<0.01<0.01<0.01<0.01<0.012.5对高脂性脂肪肝大鼠肝脏的病理组织学观察大鼠肝脏经石蜡切片并行HE染色，光镜下观察其病理组织学变化。正常对照组肝细胞排列呈索状结构，结构正常。模型组可见弥漫性的脂质空泡，并有融合现象，给予EGCG10-40mg/kg后，肝细胞脂质变性的程度明显减轻，肝细胞结构趋于正常(见表5、图1)。电子显微镜下观察可见正常对照组肝细胞结构正常，而高脂性脂肪肝模型组大鼠肝细胞超微结构明显改变，肝细胞线粒体肿胀、染色质边聚和空泡变性，并且充满大小不等的脂滴等。连续给药6周后，EGCG能显著地改善肝细胞的线粒体肿胀、染色质边聚、空泡变性和脂滴。非诺贝特对肝细胞超微结构的影响基本上与EGCG作用相似(见图2)。表5对高脂性脂肪肝大鼠肝脏的病理组织学观察组别nTC(mg/'gwettissue)TG〔mg/gwettissue)SOD(U/mgprot)MDA('nmol/mgprot)正常对照组107.53±1.7137.0±7.311S.1±14.03.70=0.62模顿09.82±.53#*5.8土4.9##101.2±14.9#4.27=0.52#EGCG10mg/kg108.33±.29*46.3±6.2*111.2±13.93.67二0.7PEGCG20mg/kgEGCG40mg/kg非诺贝特20mg/kg1010108.02±1.03**7.71±〗.52**7.74±1.54**45.4±4.5**43.2±5.0**4(5.3±fi.4*115.8±]5.2*]20.4±10.9**101.3±12.03.51=0.61**3.45士0.53"3.41±0.64**小结1、给药6周后，EGCG可显著降低高脂性脂肪肝大鼠肝重和肝脏系数。2、光镜和电镜结果显示，给予EGCG治疗6周后，高脂性脂肪肝大鼠肝细胞脂肪变性程度和超微结构改变明显减轻。3、给予EGCG治疗6周后，髙脂性脂肪肝大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA明显降低，并且肝组织中的TC和TG也显著下降。这些结果表明，EGCG通过降低血脂以及肝脏脂质的含量可能对髙脂性脂肪肝大鼠具有一定的治疗作用。4、给予EGCG治疗6周后，髙脂性脂肪肝大鼠血清ALT和AST水平明显降低。此结果表明，EGCG不仅对髙脂性脂肪肝大鼠肝脏没有毒性作用，反而具有一定的保肝作用。5、给予EGCG治疗6周后，高脂性脂肪肝大鼠肝脏中SOD含量明显升高以及MDA含量明显降低，表明EGCG可能通过其抗氧化的作用对髙脂性脂肪肝大鼠肝脏具有一定的保护作用实施例二一种用于治疗脂肪肝的制剂，由纯度为》90。/。的表没食子儿茶素没食子酸酯构成，通过添加通用的药用辅助成份，可以制成片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、颗粒剂或针剂。权利要求1.一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治高脂性脂肪肝药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种表没食子儿茶素没食子酸酯在制备防治高脂性脂肪肝药物中的应用，通过灌服脂肪乳剂复制大鼠高脂性脂肪肝模型，首次选用表没食子儿茶素没食子酸酯作为治疗药物，观察高脂性脂肪肝大鼠肝组织的病理学改变，研究表没食子儿茶素没食子酸酯对高脂性脂肪肝大鼠模型的治疗作用，从而为表没食子儿茶素没食子酸酯治疗高脂性脂肪肝提供依据。文档编号A61K31/352GK101461802SQ200910114868公开日2009年6月24日申请日期2009年1月16日优先权日2009年1月16日发明者周文轩,斌葛,谢梅林,郭次仪,顾振纶申请人:苏州中药研究所