专利名称：一种土荆芥水提取物的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物提取物的用途，确切地说是中草药土荆芥水提取物在 制备抗乙肝病毒药物中的应用。
二背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染是常见的感染性疾病之一，据估计目前全球范 围内大约有4.2亿朋￥慢性携带者。我国是HBV感染的高发区，其中HBV 携带者约1.6亿，乙型肝炎病毒严重威胁人类的健康，慢性乙型肝炎发展为原 发性肝癌的危险性比正常人高100倍，乙型肝炎在临床上呈现各种不同的疾病 的类型，包括无症状携带者，急慢性肝炎，肝硬化，最终可能发展为肝癌。其 根本原因在于HBV寄宿在人的肝脏细胞中并不断释放病毒颗粒感染其它正常 细胞，同时也释放入血液中，从而通过血液等体液途经传播给别人。目前临床 上治疗乙肝的药物很多，主要有干扰素(IFN)、核苷类似物、反义核酸及核酶 等，各类药物分别作用于HBV感染及复制的不同阶段，也各有优缺点，疗效 均不满意，且副作用大。对HBV的防治己成为我国乃至世界传染病控制的首 要问题。
在我国，中药具有来源广泛，毒性低和副反应小等特点，传统中草药治疗 乙型肝炎病毒感染的临床应用，已取得令人满意的效果，积累了丰富的经验。 土荆芥(Chenopodium ambrosioides L.)为藜科藜属植物土荆芥的地上部分，一 年生或多年生草本。英文名:Herba chenopodii，别名:臭草、鹅脚草、钩虫草。 原产于热带美洲，现广泛分布于世界热带及温带地区。我国广西、广东、福建、 台湾、江苏、浙江、江西、湖南、四川等省有野生，常生于村旁、路边、河岸 等处，北方各省常有栽培。辛，温，有毒。归肺经。功能祛风，除湿，杀虫， 通经，止痛。治疗皮肤风湿痹痛，钩虫，蛔虫，痛经，闭经，皮肤湿疹，蛇虫 咬伤等症。
土荆芥全草含挥发油(土荆芥油)0.4-1%，以果实中最多(1-4%)，叶次之，茎 最少。油中主成分为驱蛔素(ascaridole，约60-70%)，对-聚伞花素(p-cymene，约25%)，及其他萜类化合物，如土荆芥酮(aritasone )，柠檬烯(limonene)， L 一丰公香齐酮(L-pinocarvone)， d-a—旅;);希(d-a-pinene)、黄,章、油素(safrole)。
叶除含挥发油外，还分出9种黄酮类化合物:山奈酚(kaempfrol)、异鼠李素 (isorhamnatin)， 槲皮素 (quercetin)、 山奈酚-7-鼠李糖苷 (kaempfrol-7-rhamnoside)、 土荆芥苷(ambroside)、山奈酚-3-鼠李糖-4-木糖苷 (kaempferol 3-rhamnoside-4-xyloside )、山奈酚-3-鼠李糖-7-木糖苷(kaempfero1 3-rhamnoside-7-xyloside), 4-0去甲基相思子黄酮-7-O-a-L-鼠李糖-3-0-(3-D-呋喃 7t^1^^ (4-0-demethylabrectorin-7-0-a-L-rhamnopyranoside~3-0-|3-D"Xylopyranoside)，山 奈酚-3, 7-二鼠李糖苷(kaempferol-3， 7-dirhamnoside)。
此外尚含饱和烃(C21-31 ，主为C29烃),三十烷醇，菠菜甾醇(a-spinasterol)， 由剌囊酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等组成的三萜皂苷藜属皂苷 B(ChenopodosideB)，草酸、枸橼酸、琥珀酸等。
土荆芥在民间应用广泛，具有抗癌、祛风除湿、驱虫、通经止痛等功效。 国内外学者对土荆芥进行了多年的研究，主要是针对其挥发油成分的分析和挥 发油药理作用的研究。土荆芥的挥发油有很强的抗菌、杀虫作用。而对水提取 物的研究报道较少。土荆芥的水提取物成分主要是黄酮类化合物，黄酮类化合 物具有很强的药理活性，能抗菌、抗毒素、抗氧化，能够净化血液，减少自由 基的损伤，预防过氧化脂质形成，排除体内毒素。对该类成分研究较少，而黄 酮类化合物具有多种药理活性，因此对该类化合物的研究将有良好的发展前景。
发明内容
本发明旨在对土荆芥水提取物进行研究，所要解决的技术问题是分离并鉴 定水提取物中的主要活性成分及其在药学上的应用。
申请人对土荆芥的水提取物的化学成分进行了提取分离，用HPLC-MS联 用得到了样品的分子信息。将样品的质谱图与标准品的质谱图对照，并依据薄 层色谱及通过与文献资料对照，验证了土荆水提取物中主要两种黄酮类化学成 分槲皮素和山奈素。槲皮素 山奈素
同时建立了槲皮素和山奈素的高效液相色谱含量测定方法，为土荆芥水提 取物的质量评价及开发提供科学依据。
研究表明，土荆芥水提物中，当槲皮素和山奈素的含量分别>2.4%和》1.8% 时，其新的用途是在制备抗乙肝病毒(HBV)药物中的应用。
具体实施例方式
(一)土荊芥水提物的研究
1、 土荆芥水提取物的制备
药材来源土荆芥药材购自安徽亳州药材市场。
样品的制备取土荆芥药材5Kg，加10倍量水煎煮三次，每次1小时，合 并煎液，滤过，滤液减压浓縮至相对密度为1.35 1.40 (55 60°C)的稠膏，
备用o
2. 提取物的薄层层析鉴别
对照品溶液的制备分别取槲皮素和山奈素对照品适量，加甲醇制成每lml 含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备取本品稠膏4g，蒸干，残渣加20%盐酸20ml加热水 解0.5小时，水解液迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙 酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液。照薄层色谱法(中国 药典2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5pl， 分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲垸-甲醇-甲酸(8:2:1)为展开剂，展 开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105。C加热烘干。置365nm 荧光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的 荧光斑点。
53.提取物的指标成分含量测定
槲皮素和山奈素的含量测定:通过薄层色谱分析结果表明土荆芥提取物中含 槲皮素和山奈素。这两种黄酮类化合物均有较强的生理活性，因此选取这两个 指标成分，建立槲皮素和山奈素的高效液相色谱含量测定方法。
仪器与试药日本岛津SPD-10A高效液相色谱仪，LC-10ATvp泵，AB135-S 十万分之一电子天平(德国赛多利斯)，JL-180超声波清洗器(上海杰理科技 有限公司)Phenomenex Luna-ODS色谱柱(4.6X250mm; 5um);浙江大学 N-2000色谱工作站。
试药:槲皮素、山奈素对照品，购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇 为色谱纯(天津四友生物医学技术有限公司)；盐酸天津博迪)、乙酸乙酯(蚌 埠华星)均为分析纯；水为重蒸去离子水；其余试剂均为分析纯。 方法与结果
色谱条件与系统适用性试验
用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸水溶液(38:62)为流 动相；检测波长为360nm，流速为l.OmL'min";柱温为室温。在此条件下，样 品中待测组分槲皮素和山奈素得到良好的分离，分离度为〉1.5，理论板数〉 3000，符合规定。
据液相色谱分析，土荆芥水提取物中槲皮素含量为2.4%，山奈素含量为 1.8%。
(二) 土荆芥水提取物体外抑制HBsAg实验研究 1材料和试剂
1.1 土荆芥水提物2.73g生药/lml的混悬液(指悬浮液中，含2.73g生药的水提取 物)。0.1mol/L的NaOH/HCl调至pH7.0，煮沸消毒30分钟，检菌阴性4。C冰箱保存。
1.2乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)HBsAg来自安徽医科大学第一附属医院检 验科乙肝患者的血清，经ELISA试验定为HBsAg强阳性，分装小瓶后-4(TC冷 存。实验前按适当倍数稀释并测定HBsAg的P/N值。
1.3试剂ELISA试剂盒为上海科华生物工程有限公司生产。批号200S09171.4细胞株Hep-G细胞株购自上海细胞所。
1.5细胞培养试剂小牛血清、DMEM培养基和胰蛋白酶购自合肥中江生物技术公司。
2方法
2.1 土荆芥水提物对Hep-G细胞的最大无毒浓度的筛选将Hep-G2细胞接种于 96孔板,加入含10%小牛血清的.DMEM培养液细胞浓度为1.0 X 1 (^个/ml,200u1/ 孔置5%<302孵箱中培养箱中培养24~4811待生成单层细胞后弃去上清，加入含3% 小牛血清的DMEM培养液将2730mg/ml土荆芥水提物系列2倍稀释成8个终浓度 为1365mg/ml、682.5 mg/ml、341.3mg/ml、 170.6 mg/ml、85.3 mg/ml、42.7 mg/ml 、 21.3 mg/ml和10.7 mg/ml换含有不同药物浓度的培养基并设空白药孔对照继续 培养2d，结晶紫染色法观察细胞最大无毒浓度。以镜下观察和结晶紫染色法观 察试验孔细胞与细胞对照孔细胞在形态和数量一致，该孔药物浓度为最大无毒 浓度。试验表明，最大无毒浓度为85.3mg/ml。 2.2土荆芥水提物的初筛(定性)
2.2.1土荆芥水提物与HBsAg的直接作用取96孔微量细胞板,每孔用移液管加
入最大无毒浓度土荆芥水提物50ul和P/N比值为6.35的HBsAg各50ul，经微型
震荡器均匀混合后，置于37"全温度培养箱静止接触240分钟。
2.2.2加样将上述土荆芥水提物与病毒血清混合液50ul加入到包被有抗HBs的
孔中，另设HBsAg阳/阴性的血清/生理盐水对照，药物(不含HBsAg)、洗涤液空
白对照。
2.2.3加酶标抗体在上述各孔中(空白对照孔除外)加入酶标抗体，微型震荡器 均匀混合，37'C作用30分钟后甩干并用洗涤液洗板。
2.2.4加底物显色每孔加显色剂A、 B各50ul震荡均匀后，置37匸15分钟后，加 2mol/L硫酸50ul/孔终止反应。
2.2.5观察结果在以上各对照孔反应正常时，于ST37型酶联免疫检测仪(上海科 华生物工程有限公司生产)比色，450nm波长读出A值，实验重复4次，根据平 均A值计算P/N值以判断药物是否有效。 2.3 土荆芥水提物的复筛(定量)
2.3.1不同药物剂量微量细胞板孔内加入浓度为85.31、 42.66、 21.33、 10.66 和5.33 mg/ml各50ul的初筛有效药和P/N为6.79HBsAg各50ul，经微型震荡器均 匀混合后，37"C温箱培养静止接触240分钟，以后各步骤同前述初筛法，记录结
7果。实验重复4次，结果取平均值。
2.3.2不同HBsAg滴度微量细胞板孔内加入85.31、 42.66、 21.33、 10.66和5.33 mg/ml各50ul的初筛有效药和P/N6.50 、 6.35的HBsAg各50ul， 37"温箱培养静 止接触240分钟，以后各步骤同前述初筛法，记录结果。实验重复4次，结果取 平均值。
2.4药效判断3项复筛中使用HBsAg浓度的平均P/N值为 (6.79+6.50+6.35=6.55)，以 P/N 《2.10 定为高效药；P/N2.10 2.69[3.28-(3.28-2.10 )X50。/。]为中效药；P/N2.69 3.28(6.55 X 50%)为低效药；P/N 》3.28为无效药。综合药效指数(SEI)取5项复筛结果的平均值。 3结果与讨论
3.1药物对Hep-G细胞的最大无毒浓度为85,3mg/ml。
3.2药物对乙型肝炎表面抗原的作用的初筛P/N2.46 2.64， 2.54±0.09，在
2.10 2.69为中效药。
3.3药物的复筛(定量)，结果见表
_表土荆芥水提物对乙型肝炎表面抗原的作用_
不同批次 土荆芥水提物对细胞最大无毒剂量(85.31mg/ml)
HBsAg85.3142.6621.3310.665.33PBS(对照)SEI
HBsAgl2.512.893.153.283.646.423.09
HBsAg22.462.663.093.243.686.513.03
HBsAg32.642.742.983.163.576.353.02
3.4药物对HBsAg总抑制率和最大无毒剂量药物对HBsAg总抑制率分别为53。/0 和61%
HBsAg阳性P/N=6.79+6.50+6.35=6.55
土荆芥水提物HBsAg总抑制率二 〔6.55- (3.09+3.03+3.02) +3〕〕 /6.55X100% =53%
土荆芥水提物最大无毒剂量对HBsAg总抑制率=(6.55- (2.51+2.46+2.64+3)〕 /6. 55X 100% = 61%
4结论土荆芥水提物在体外对HBsAg血清有较强的抑制作用，最大无毒 剂量达到中效药物范围(P/N2.10 2.69)。
权利要求
1、一种土荆芥水提取物的新用途，其特征在于土荆芥水提取物在制备抗乙肝病毒药物中的应用，提取物中槲皮素含量≥2.4％，山奈素含量≥1.8％。
全文摘要
一种土荆芥水提取物的新用途，其特征是土荆芥水提取物中当槲皮素含量≥2.4％、山奈素含量≥1.8％时该水提取物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。本发明同时建立了槲皮素和山奈素的高效液相色谱含量测定方法，为土荆芥水提取物的质量评价及开发提供科学依据。
文档编号A61K36/185GK101647832SQ20091014492
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月11日 优先权日2009年9月11日
发明者刘经星, 王举涛, 伟 魏 申请人:合肥恒星药物研究所