专利名称：一种从木芙蓉叶中提取黄酮类化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种从木芙蓉叶中提取黄酮类化合物的方法。
(二)
背景技术：
木芙蓉叶为锦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的叶，味微辛而滑，无毒， 具有凉血、解毒、消肿、止痛等功效。木芙蓉不论内服或外用，毒性均较低，使用安全，在食 品和医药工业上有着广泛的应用。木芙蓉叶含有黄酮苷、酚类、氨基酸、鞣质、还原糖等，其 中主要的药效成分是黄酮类化合物，包括芸香苷(rutin)、山奈酚-3-0- P -芸香糖苷、山奈 酚-3-0-P -剌槐双糖苷和山奈酚-3-0-13 -D-葡萄糖等。其具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗衰 老、免疫调节和抗肿瘤等作用。 目前对木芙蓉叶中黄酮类化合物的提取主要通过乙醇加热回流法、碱提酸沉法和 微波辅助提取法。乙醇加热回流成本高，产品有机溶剂残留量超标；碱提酸沉法耗时长，强 酸强碱对设备腐蚀性强，产品质量较差，不适合产业化生产。 机械化学提取技术是指将生物组织与固相试剂混合，经超细粉碎后形成聚合状
态，在机械力诱发下，有效成分与固相试剂发生化学反应，形成某种易溶于水的化合物，通
过淋洗，获取有效成分。采用机械化学提取技术能够提高提取率和产品中有效成分的含量，
简化工艺，且由于提取过程无需使用有机溶剂，环境友好，具有广阔的应用前景。 利用机械化学技术提取木芙蓉叶中黄酮类化合物，目前还未见报道，是一种提取
黄酮类化合物的新方法，有望取代传统的提取方法，对推动中草药提取技术的现代化进程
具有重要的意义。
(三)
发明内容
本发明的目的在于解决现有木芙蓉叶中黄酮类化合物提取工艺中存在的问题，提 供一种环境友好、收率高、工艺简单的机械化学提取新方法。 本发明的研究思路为根据黄酮类化合物的化学结构和性质，在高能机械力的作 用下，能与固相试剂发生作用，生成易溶于水的复合物，经溶解、酸化后，获得黄酮类有效成 分。 具体的，本发明采用的技术方案如下 —种从木芙蓉叶中提取黄酮类化合物的方法，所述的方法为将木芙蓉叶与固相 试剂按质量比l : 0.05 2混合，研磨至所得粉末粒度分析结果的D9。为10 200ym(通 常可用粒度分析仪检测)，然后加水充分搅拌，离心，取上清液加酸将PH值调至1. 0 6. 0， 然后浓縮至生药含量为0. 1 1.0g木芙蓉叶/ml，过大孔树脂，水洗后用75wt^乙醇水溶 液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮、干燥得到所述木芙蓉叶黄酮提取物；所述的木 芙蓉叶为木芙蓉叶的碎片；所述的固相试剂为下列一种或两种的任意混合氢氧化钠、氢 氧化铝、氢氧化钙、氢氧化铜、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、硅酸钠、磷酸 氢二钠、氯化钠、氯化镁、亚硫酸钠、氯化铝或氯化钙；所述大孔树脂为下列之一 HPD-IOO，HPD-826, ADS-17， D_101， DM-301或AB_8。 本发明所述的固相试剂优选为下列一种或两种以上的任意混合碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硅酸钠或碳酸钙。
所述木芙蓉叶与固相试剂的质量比优选为i : o. i i。 本发明中，所述的木芙蓉叶为木芙蓉叶的碎片，可用粉碎机粉碎，过35目筛，制成粒径不大于0. 5mm的木芙蓉叶的粗粉，再和固相试剂共同研磨。 本发明所述研磨后粉末粒径Dg。为10 200 ii m，优选粉末粒径Dg。为20 100 y m。
本发明所述研磨后加水搅拌，加水量为木芙蓉叶质量的5 100倍，优选的加水量为木芙蓉叶质量的10 60倍。 所述研磨后加水搅拌，推荐搅拌时间为5 45min，优选的搅拌时间为15 30min。本发明所述大孔树脂优选为ADS-17， D-lOl， DM-301或AB-8。 本发明中过大孔树脂时，所需用水量为2 10倍柱体积，75wt^乙醇水溶液用量为2 10倍柱体积，优选的用水量为2 5倍柱体积，75wt^乙醇水溶液用量为2 5倍柱体积。 本发明中用来调节上清液pH值的酸为下列之一 盐酸、硫酸、醋酸或磷酸。所述盐酸的浓度为5 7mol/L，所述硫酸的浓度为9 12mol/L，所述醋酸和磷酸
为分析纯。 所述调节pH值的范围为1. 0 6. 0，优选为3. 0 5. 0。 具体推荐所述的方法按照以下步骤进行取木芙蓉叶为原料，经预粉碎过35目筛，制成粒径不大于O. 5mm的木芙蓉叶的粗粉，木芙蓉叶的粗粉与固相试剂按质量比1 : 0. 1 l混合，研磨至所得粉末粒度分析结果的D9。为20 100ym，然后加入质量为木芙蓉叶质量的10 60倍的水，搅拌15 30min，离心，取上清液加酸将pH值调节至3. 0 5. 0，然后浓縮至生药含量为0. 1 1. 0g木芙蓉叶/ml ，过大孔树脂，先用2 5倍柱体积水洗，再用2 5倍柱体积75wt%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮、真空干燥得到所述木芙蓉叶黄酮提取物；所述的固相试剂为下列一种或两种以上的任意混合碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硅酸钠或碳酸钙；所述的酸为下列之一 盐酸、硫酸、醋酸或磷酸；所述的大孔树脂为下列之一 ADS-17， D-lOl， DM-301或AB-8。 本发明采用机械化学技术提取木芙蓉叶中黄酮类化合物，与现有技术相比，其有益效果体现在 (1)木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率和含量显著提高；(2)提取过程中无需有机溶剂，大幅度降低成本，减轻环境污染；(3)工艺简单，无需萃取，生产周期短；(4)常温提取；(5)环境友好，废液主要是中性盐溶液和无机酸，经简单处理后即可排放，对环境影响很小。 综上，本发明方法具有提取完全、主要活性成分(黄酮类化合物)的得率和含量高、提取物抗氧化活性好、工艺简单、环境友好等优点。该木芙蓉叶黄酮提取物能广泛应用于抗感冒、消炎止痛等中药复方制剂的开发，也可以作为分离金丝桃苷、芸香苷等重要黄酮单体的优良原料，具有良好的市场应用前景。具体实施例方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此 以下实施例中所述产品中木芙蓉叶中黄酮的检测条件及计算方法为 产物的定量分析以芦丁为对照510nm下紫外分光光度法测量。 以下实施例中所述的木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物得率(％ )=提取物中
黄酮类化合物的质量/木芙蓉叶粉末的质量X 100 ; 以下实施例中所述的木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的含量(％ )=提取物中黄酮类化合物的质量/提取物的质量X 100。
实施例1 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂l : 0.05，其中固相试剂为氢氧化钠。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与氢氧化钠0. 5g混合，机械研磨至粉末粒径D9。为177 P m(粒度分析仪检测，下同)，加入50ml水，搅拌5min，离心，取上清液，加入醋酸将pH值调节至4，然后浓縮至10ml，过D-101大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 2倍柱体积水洗后，再用2倍柱体积75wt %乙醇水溶液洗脱，收集所有乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为2. 26%，含量为21.06%。
实施例2 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂i : i，其中固相试剂为氢氧化钠和氯化钠的
混合试剂。 在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g，氢氧化钠5g与氯化钠5g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。为25 ii m，加入500ml水，搅拌10min，离心，取上清液，加入醋酸将pH值调节至4，然后浓縮至80ml，过HPD-826大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 4倍柱体积水洗后，再用4倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为2. 64%，含量为20. 15%。
实施例3 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 1.5，其中固相试剂为氢氧化铜。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与氢氧化铜15g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。为15 ii m，加入1000ml水，搅拌45min，离心，取上清液，加入醋酸将pH值调节至6，然后浓縮至100ml，过D-101大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 2倍柱体积水洗后，再用2倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为2. 31%，含量为17. 38%。
实施例4 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂i : i，其中固相试剂为氢氧化钙。 在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与氢氧化钙10g混合后，机械研磨至粉末粒径D90为53线加入500ml水，搅拌45min，离心，取上清液，加入6mol/L盐酸将pH值调节至3，然后浓縮至60ml，过ADS-17大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 8倍柱体积水洗后，再用8倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为2. 58%，含量为14. 29%。
实施例5 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂i : o. i，其中固相试剂为碳酸氢钠。 在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与碳酸氢钠lg混合后，机械研磨至粉末粒径D9。为37 ii m，加入100ml水，搅拌30min，离心，取上清液，加入7mol/L盐酸将pH值调节至1，然后浓縮至30ml，过AB-8大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 4倍柱体积水洗后，再用4倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为3.05%，含量为36. 79 % 。
实施例6 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 0.8，其中固相试剂为碳酸氢钾。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与碳酸氢钾8g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。为53 ii m，加入300ml水，搅拌20min，离心，取上清液，加入6mol/L盐酸将pH值调节至3，然后浓縮至30ml，过AB-8大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 5倍柱体积水洗后，再用5倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为2. 84%，含量为35. 12%。
实施例7 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 0.8，其中固相试剂为碳酸氢钠。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与碳酸氢钠8g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。为25 ii m，加入800ml水，搅拌20min，离心，取上清液，加入醋酸将pH值调节至6，然后浓縮至25ml，过D-101大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 2倍柱体积水洗后，再用2倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为2. 92%，含量为42. 92%。
实施例8 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 1.5，其中固相试剂为碳酸钠。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与碳酸钠15g混合后，机械研磨至粉末粒径Dg。为74 ii m，加入100ml水，搅拌20min，离心，取上清液，加入9mol/L硫酸将pH值调节至1 ，然后浓縮至40ml，过匿-301大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 6倍柱体积水洗后，再用6倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为2. 89 % ，含量为36. 15 % 。
实施例9 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 1.5，其中固相试剂为磷酸氢二钠。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与磷酸氢二钠15g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。为15 ii m，加入1000ml水，搅拌30min，离心，取上清液，加入6mol/L盐酸将pH值调节至4，然后浓縮至40ml，过ADS-17大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml，4倍柱体积水洗后，再用4倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱 液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化 合物的得率为2. 75%，含量为31.46%。
实施例10 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 0.5，其中固相试剂为亚硫酸钠。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与亚硫酸钠5g混合后，机械研磨至粉末粒径 D9。为44 ii m，加入300ml水，搅拌15min，离心，取上清液，加入磷酸将pH值调节至1，然后 浓縮至25ml，过ADS-17大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为 120ml， 5倍柱体积水洗后，再用5倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗 脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得 率为2. 68%，含量为26. 79%。
实施例11 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 1.5，其中固相试剂为硅酸钠。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与碳酸钠15g混合后，机械研磨至粉末粒径 D9。为74 ii m，加入500ml水，搅拌20min，离心，取上清液，加入磷酸将pH值调节至4，然后 浓縮至50ml，过匿-301大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为 120ml， 4倍柱体积水洗后，再用4倍柱体积75wt %乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗 脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得 率为2. 86%，含量为21. 06%。
实施例12 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂i : o. i，其中固相试剂为氯化钠。 在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与氯化钠lg混合后，机械研磨至粉末粒径D9。 为149 ii m，加入500ml水，搅拌5min，离心，取上清液，加入磷酸将pH值调节至4，然后浓 縮至80ml，过HPD-100大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为 120ml， 6倍柱体积水洗后，再用6倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗 脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得 率为2. 04%，含量为16. 15%。
实施例13 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂1 : 0.8，其中固相试剂为氯化铝。
在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与氯化铝8g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。 为125 ii m，加入800ml水，搅拌45min，离心，取上清液，加入9mol/L硫酸将pH值调节至6， 然后浓縮至40ml，过HPD-100大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体 积为120ml， 2倍柱体积水洗后，再用2倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙 醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物 的得率为2. 57%，含量为28. 87%。
实施例14 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂i : 2，其中固相试剂为磷酸氢二钠和碳酸钠
的混合试剂。 在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g，磷酸氢二钠10g与碳酸钠10g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。为37 ii m，加入800ml水，搅拌10min，离心，取上清液，加入6mol/L盐酸将 pH值调节至4，然后浓縮至50ml，过AB-8大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树 脂填料柱体积为120ml， 4倍柱体积水洗后，再用4倍柱体积75wt %乙醇溶液洗脱，收集乙醇 洗脱液，乙醇洗脱液浓縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮 类化合物的得率为2. 91 % ，含量为30. 38% 。
实施例15 投料质量比为木芙蓉叶固相试剂i : i，其中固相试剂为碳酸钙。 在室温下，将预粉碎的木芙蓉叶10g与碳酸钙10g混合后，机械研磨至粉末粒径D9。 为25 ii m，加入500ml水，搅拌15min，离心，取上清液，加入醋酸将pH值调节至6，然后浓縮 至25ml，过AB-8大孔树脂(购于安徽三星树脂科技有限公司)，树脂填料柱体积为120ml， 2倍柱体积水洗后，再用2倍柱体积75wt%乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓 縮，真空干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物。木芙蓉叶黄酮提取物中黄酮类化合物的得率为 2. 94%，含量为24. 56%。
权利要求
一种从木芙蓉叶中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于所述的方法为将木芙蓉叶与固相试剂按质量比1∶0.05～2混合，研磨至所得粉末粒度分析结果的D90为10～200μm，然后加水充分搅拌，离心，取上清液加酸将pH值调节到1.0～6.0，然后浓缩至生药含量为0.1～1.0g木芙蓉叶/ml，过大孔树脂，水洗后用75wt％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩、干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物；所述的木芙蓉叶为木芙蓉叶的碎片；所述的固相试剂为下列一种或两种以上的任意混合氢氧化钠、氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化铜、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、硅酸钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化镁、亚硫酸钠、氯化铝或氯化钙。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述大孔树脂为下列之一 HPD-IOO， HPD-826， ADS-17， D-lOl， DM-301或AB-8。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的木芙蓉叶为过35目筛的木芙蓉叶的粗粉。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酸为下列之一 盐酸、硫酸、醋酸或磷酸。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述过大孔树脂时，所需用水量为2 10倍 柱体积，75wt^乙醇水溶液用量为2 10倍柱体积。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于研磨后加水量为木芙蓉叶质量的5 100倍。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述研磨后加水，搅拌时间为5 45min。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述固相试剂为下列一种或两种以上的任意混合碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硅酸钠或碳酸钙。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述取上清液加酸调pH值至3. 0 5. 0。
10. 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行取木芙蓉叶 为原料，经预粉碎，过35目筛制成木芙蓉叶的粗粉，木芙蓉叶的粗粉与固相试剂按质量比 1 : 0. 05 2混合，研磨至粉末粒径的D9。为10 200 ii m，然后加入质量为木芙蓉叶质量 5 100倍的水，搅拌5 45min，离心，取上清液加酸将pH值调节至1. 0 6. 0，然后浓縮 至生药含量为0. 1 1. Og木芙蓉叶/ml ，过大孔树脂，先用2 10倍柱体积水洗，再用2 10倍柱体积75wt%乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓縮、干燥得到木芙蓉 叶黄酮提取物；所述的固相试剂为下列一种或两种以上的任意混合氢氧化钠、氢氧化铝、 氢氧化钙、氢氧化铜、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、硅酸钠、磷酸氢二钠、氯 化钠、氯化镁、亚硫酸钠、氯化铝或氯化钙；所述的酸为下列之一 盐酸、硫酸、醋酸或磷酸； 所述大孔树脂为下列之一 HPD-IOO， HPD-826， ADS-17， D-lOl， DM-301或AB-8。
全文摘要
本发明公开了一种从木芙蓉叶中提黄酮类化合物的方法，所述的方法为将木芙蓉叶与固相试剂按质量比1∶0.05～2混合，研磨至所得粉末粒度分析结果的D90为10～200μm，然后加水充分搅拌，离心，取上清液加酸调pH值至1.0～6.0，然后浓缩至生药含量为0.1-1.0g木芙蓉叶/ml，过大孔树脂，水洗后用75wt％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩、干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物；所述的木芙蓉叶为木芙蓉叶的碎片。本发明采用机械化学技术提取黄酮类化合物，产品收率和纯度高，技术工艺简单、生产周期短、环境友好，是一条具有广泛工业化前景的提取分离路线。
文档编号A61P31/04GK101716199SQ200910155909
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者施力瑕, 朱兴一, 王平, 苏为科, 谢捷 申请人:浙江工业大学