专利名称：雷公藤药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药材指纹图谱的建立方法，尤其是雷公藤药材高效液相色谱(HPLC) 指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的雷公藤药材HPLC标准指纹图谱。属于药物分析 技术领域。
背景技术：
中药指纹图谱特指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体特征的 图谱或图像。目前指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段 之一。美国食品药品管理局在1996年制定的《FDA关于植物制品的指南》中，要求对植物原料、 植物药中间品和植物药产品提供相应的指纹图谱。英国草药典、印度草药典以及加拿大药用 及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。中国国家药品监督管理部门于2000 年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求》，明确要求对新申报的中药注射剂和己 上市的中药注射剂实行指纹图谱标准。
中药指纹图谱经过了数十年的研究，使用了包括紫外、红外、气相、高效液相、薄层、 核磁共振、扫描电子显微镜、计算机图像分析、电泳技术、同功酶分析法、分子生物学技术、 聚类分析技术等许多现代分析测试手段，为中药的物质鉴定和成分分析积累了大量的数据。 但从中药全面质量控制的角度看，还远未达到有效地反映和控制中药的整体质量的目的。高 效液相色谱(HPLC)指纹图谱在国际上容易获得认可，包括美国、英国、法国、加拿大、德 国、日本和印度在内的许多国家更愿意接受HPLC指纹图谱。因此，为中药材建立相应的HPLC 指纹图谱，是现阶段控制中药内在质量的有效手段。
雷公藤系卫矛科雷公藤属落叶蔓生灌木，别名有震龙根、蒸龙草、莽草、黄藤草、断肠 草、山砒霜等，以根、叶、花及果入药，主产于浙江、安徽、江西、湖南、广东、广西、福 建、台湾、云南等地，其活性成分十分复杂，包括雷公藤碱(wilfordine)，雷公藤次碱
(wilforine)，雷公藤春碱皮酰胺(celacinnine)，南蛇藤p-呋喃甲酸胺(celafurine),
南蛇藤苄酰胺(celagbenzine),雷公藤内酯(wilforlide)，雷酚萜醇(triptonoterpenol)， 16-轻基雷公藤内酯醇(16-hydroxytripto-lide),雷公藤甲素(triptolide)，表雷公藤 内酯三醇(印itriptriolide)，雷贝壳杉烷内酯(tripterifordine)，对映-雷贝壳杉烷内酉旨(antriptolactone)，雷公藤酸(tripterygic acid)，直楔草酸(orthosphenic acid)，(3-谷甾醇(^-sitosterol)，胡萝卜武(daucosterol)，雷公藤三蔽内酉旨A (triptoterpenoidlactone A)，雷公藤内酯A、 B，雷公藤红素(tripterine)，大子五层龙酸(salaspermic acid)， 雷公藤三萜酸(triptotriterpenic acid) A、 B、 C，直楔草酸，雷公藤酮(tripterygone)，雷 公藤氯内酯醉(tripchlorolide)，雷公藤内酯三醇(trip函de)及亚麻酸(linolenic acid)， 8， 9-十八碳二烯酸(8， 9-octadecadienoic acid)，油酸(oleic acid),棕榈油酸(9-hexadecenoic acid)，棕榈酸(palmitic acid)，硬脂酸(stearic acid)等。其药理作用主要有免疫调节、抗肿瘤、改善微循环、抗炎、杀菌以及解热镇痛等；临床上可用于治疗麻风反应、类风湿性 关节炎、肺结核及其他慢性疾病等。目前，已有雷公藤片，雷公藤多苷片，雷公藤糖浆、冲 剂及合剂等多种制剂生产，可用于多种疾病的治疗。雷公藤为中国植物图谱数据库收录的有毒植物，其毒性为全株有毒。清代赵学敏在《本 草纲目拾遗》巳详细记载了其毒性"采之毒鱼，凡蚌螺亦死，其性最烈，以其草烟獯蚕子则 不生"。雷公藤对人的毒性很大，南方各省农村常有中毒发生。有人误服其叶2—3片可中毒，服嫩芽7个或根皮30g以上可以引起死亡，甚至食其花蜜也可发生中毒。它主要作用于动物 心肌，导致心率减慢和血压下降，使心脏先兴奋后抑制至停止跳动而死亡。临床所见的一般 中毒症状有头晕、心悸、无力、恶心、呕吐、腹痛、腹泻肝肾区疼痛、血粪等。因此，对 雷公藤的药用需要十分小心。目前，对雷公藤药材的质量评价主要集中在某个有效成分或指标性成分进行定性、定量 分析，缺乏全面反映雷公藤药材质量的标准控制手段。发明内容本发明的目的是提供一种雷公藤药材HPLC指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的 雷公藤药材标准指纹图谱。为实现此目的，本发明通过对雷公藤药材高效液相色谱指纹图谱 的研究，提出了一种雷公藤药材质量控制方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使雷公藤 药材的质量控制更加完善和科学。本发明的雷公藤药材HPLC指纹图谱的建立方法，包括如下步骤(1) 供试品溶液的制备精密称取干燥的药材粉末10g，置于具塞容器中，加入60 80%的 甲醇80 120mL，超声震荡60min，移入索氏提取器中，回流提取5h，将提取液浓縮至 少于10mL，用0.45ym微孔膜过滤，滤液定容至10mL作为供试品溶液。(2) 高效液相色谱分析色谱分离柱填料为5nm Kromasil-C18，250mmX4.6mm;流动相为水(0.4%磷酸+0.5%醋酸)-乙腈；采用梯度洗脱方式Omin—lOmin—3Ctoin—5Ctain— 65min—85min—95min，乙腈80%—65%—45%—40%—35%—15%—10%;流速O. 8 1.2mL/min;检测波长254nm;柱温25 35。C。在此条件下分析供试品溶液，得到雷公 藤药材的指纹图谱。(3)标准指纹图谱的确定按照本发明提供的方法，对不同产地、不同品质或不同储存时 间的雷公藤药材建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了24个共有特征峰，其一 种色谱条件下的保留时间分别为2. 2min、7. 6min、8. 6min、14. 2min、20. 0min、^2. 4min、 26. 8min、 31. 4min、 35. Oniin、 38. 4min、 41. 6min、 43. Omin、 45. 4min、 48. 8min、 55. 6min、 57. 6min、 61. 4min、 67. 2min、 69. 6ndn、 76. 6min、 79. 8min、 87. 4min、 89. Omin、 90. 2min， 这些共有特征峰构成了雷公藤药材的指纹特征，可作为雷公藤药材的标准指纹图谱。 本发明具有如下显著的优点和用途(1) 将雷公藤药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异；(2) 供试品制作简便，色谱条件容易实现；(3) 方法的稳定性和重现性都比较好；(4) 适于对雷公藤药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。
图1是本发明提供的雷公藤药材的标准指纹图谱。从左到右分别标出了其24个共有特征峰。
具体实施方式
本发明的优选实施例如下(1) 仪器和药品使用岛津LC10A高效液相色谱仪；雷公藤药材共17批，均购于中草药商 店；其它试剂为色谱纯或分析纯。(2) 供试品溶液的制备精密称取干燥的药材粉末10g，置于具塞容器中，加入60 80% 的甲醇80 120mL,超声震荡60min，移入索氏提取器中，回流提取5h，将提取液浓 縮至少于10mL，用0. 45 m微孔膜过滤，滤液定容至10mL作为供试品溶液。(3) 高效液相色谱分析色谱分离柱填料为5nm Kromasi1-C18，250mmX4.6mm;流动相为 水(0.4%磷酸+0.5%醋酸)-乙腈；采用梯度洗脱方式0min—10rain—30min—50min—65min—85min—95min，乙腈80%—65%—45%—40%—35%—15%—10%;流速1. 0mL/min; 检测波长254nm;柱温30°C。在此条件下分析供试品溶液，得到雷公藤药材的指纹图 谱。(4)按照本发明提供的方法，对不同产地、不同品质或不同储存时间的17批雷公藤药材建 立了HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了24个共有特征峰，其一种色谱条件下的保 留时间分别为2. 2min、 7. 6min、 8. 6min、 14. 2rain、 20. Omin、 22. 4min、 26. 8min、 31. 4min、 35. Omin、 38. 4min、 41. 6min、 43. Omin、 45. 4min、 48. 8min、 55. 6min、 57. 6min、 61.4min、 67. 2min、 69. 6min、 76. 6min、 79. 8min、 87. 4min、 89. Omin、 90. 2min，这 些共有特征峰构成了雷公藤药材的指纹特征，可作为雷公藤药材的标准指纹图谱。
权利要求
1、一种雷公藤药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征包括供试品溶液的制备、指纹图谱的制作和标准指纹图谱的确定。
2、 根据权利要求1所述的雷公藤药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征是所述的供 试品溶液的制备方法为精密称取干燥的药材粉末10g，置于具塞容器中，加入60 80% 的甲醇80 120mL，超声震荡60min，移入索氏提取器中，回流提取5h，将提取液浓縮至 少于10mL，用0.45um微孔膜过滤，滤液定容至10mL作为供试品溶液。-
3、 根据权利要求1和2所述的雷公藤药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征是所述 的指纹图谱的制作过程为用5umKromasi1-C18作为色谱分离柱(250咖X4.6腿)填料， 流动相为水(O. 4%磷酸+0. 5%醋酸)-乙腈，梯度洗脱方式为Omin—lOmin—30min—50min— 65min—85min—95min分别对应乙腈80%—65%—45%—40%—35%—15%—10%,流速0.8 1.2mL/min;检测波长254nm;柱温25 35。C;在此高效液相色谱条件下分析供试品溶液， 得到雷公藤药材的指纹图谱。
4、 根据权利要求l、 2和3所述的雷公藤药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征是 所述的标准指纹图谱的确定结果为对17批雷公藤药材建立了 HPLC指纹图谱，确定了 24个共有特征峰，其一种色谱条件下的保留时间分别为2. 2min、7. 6min、8. 6min、14. 2rain、 20.0min、 22. 4min、 26. 8min、 31.4min、 35. Omin、 38. 4min、 41. 6min、 43. Omin、 45. 4min、 48. 8min、 55. 6min、 57. 6min、 61. 4min、 67. 2min、 69. 6min、 76. 6min、 79. 8min、 87, 4min、 89.0min、 90. 2min，这些共有特征峰构成了雷公藤药材的指纹特征，可作为雷公藤药材的 标准指纹图谱。
全文摘要
本发明提供了一种雷公藤药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，包括供试品溶液的制备、色谱条件的选择、HPLC指纹图谱的制作和标准指纹图谱的确定等过程。通过对17批次雷公藤药材HPLC指纹图谱的对比，确定了24个共有特征峰，这些共有特征峰构成了雷公藤药材的指纹特征，可作为雷公藤药材的标准指纹图谱。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰多、准确可靠等特点，所建立的标准指纹图谱能有效地表征雷公藤药材的质量。
文档编号A61K36/37GK101642481SQ200910169869
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者周考文, 李凤桐, 王树聪 申请人:北京联合大学生物化学工程学院