专利名称：松萝酸在制备抑制血管新生药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了松萝酸的新用途，具体涉及松萝酸在制备抑制血管新生药物中的应用。
本发明解决的技术问题是松萝酸在制备抑制血管新生的治疗和/或预防药物中的应用。松 萝酸(usinicacid)是从地衣类松萝科植物中提取的一种天然成份，为黄色结晶性粉，分子式是 C18H1607，分子量是344.32，熔点是201-203 。C，分子结构式如下
本发明松萝酸在制备抑制血管新生药物中的应用中，所述药物可以为治疗和/或预防肿瘤 血管新生的药物；治疗和/或预防类风湿性关节炎和炎性关节炎病变组织的血管新生的药物； 治疗和/或预防新生血管性眼病的药物；治疗和/或预防新生血管性角膜疾病，糖尿病性视网膜 病变，视网膜静脉闭塞，早产儿视网膜病变，视网膜动脉闭塞，血管新生性虹膜疾病，新生 血管性青光眼，新生血管性视神经疾病，新生血管性玻璃体眼病，湿性老年黄斑病变，新生 血管性结膜眼病以及生成血管型白内障的药物；治疗和/或预防血管瘤、实体瘤病变组织血管 新生的药物；治疗和/或预防银屑病病变组织血管新生的药物；血管瘤包括多发性血管瘤、血 管母细胞瘤和其他一些良性血管增生疾病，实体瘤包括原发性和继发性的实体瘤；治疗和/或 预防Kaposi's肉瘤，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症及Paget，s疾病的药物。特别是，松萝 酸在制备抑制肿瘤血管新生、眼科疾病、类风湿性关节炎、血管瘤、银屑病、十二指肠溃疡 等血管新生性疾病中的应用。
根据本发明可以将治疗有效量的松萝酸和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物， 也可以添加其他与松萝酸没有拮抗作用的其他抗血管新生药物。可以在本发明的抑制血管新 生的药物中可以加入一种或多种药学上可以接受的载体。其制剂可以是药学上的任意一种剂 型，包括但不限于末剂、散剂、片剂、丸剂、滴剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、胶囊剂、糖
背景技术：
衣剂、口服液、注射剂、脂质体、舌下含片等。
本发明提供的松萝酸新用途，松萝酸在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、体外划 痕迁移实验、Boyden小室迁移实验、微管形成实验以及鸡胚尿囊膜血管新生等均有明显的抑 制作用，实验表明松萝酸用于制备抑制血管新生的药物。本发明中所用的松萝酸购于sigma 公司。
本发明解决的技术问题是松萝酸在制备抑制血管新生的治疗和/或预防药物中的应用。松 萝酸(usinicacid)是从地衣类松萝科植物中提取的一种天然成份，为黄色结晶性粉，分子式是 C1SH1607，分子量是344.32，熔点是201-203 。C，分子结构式如下
本发明松萝酸在制备抑制血管新生药物中的应用中，所述药物可以为治疗和/或预防肿瘤 血管新生的药物；治疗和/或预防类风湿性关节炎和炎性关节炎病变组织的血管新生的药物； 治疗和/或预防新生血管性眼病的药物；治疗和/或预防新生血管性角膜疾病，糖尿病性视网膜 病变，视网膜静脉闭塞，早产儿视网膜病变，视网膜动脉闭塞，血管新生性虹膜疾病，新生 血管性青光眼，新生血管性视神经疾病，新生血管性玻璃体眼病，湿性老年黄斑病变，新生 血管性结膜眼病以及生成血管型白内障的药物；治疗和/或预防血管瘤、实体瘤病变组织血管 新生的药物；治疗和/或预防银屑病病变组织血管新生的药物；血管瘤包括多发性血管瘤、血 管母细胞瘤和其他一些良性血管增生疾病，实体瘤包括原发性和继发性的实体瘤；治疗和/或 预防Kaposi's肉瘤，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症及Paget，s疾病的药物。特别是，松萝 酸在制备抑制肿瘤血管新生、眼科疾病、类风湿性关节炎、血管瘤、银屑病、十二指肠溃疡 等血管新生性疾病中的应用。
根据本发明可以将治疗有效量的松萝酸和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物， 也可以添加其他与松萝酸没有拮抗作用的其他抗血管新生药物。可以在本发明的抑制血管新 生的药物中可以加入一种或多种药学上可以接受的载体。其制剂可以是药学上的任意一种剂 型，包括但不限于末剂、散剂、片剂、丸剂、滴剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、胶囊剂、糖
发明内容衣剂、口服液、注射剂、脂质体、舌下含片等。
本发明提供的松萝酸新用途，松萝酸在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、体外划 痕迁移实验、Boyden小室迁移实验、微管形成实验以及鸡胚尿囊膜血管新生等均有明显的抑 制作用，实验表明松萝酸用于制备抑制血管新生的药物。本发明中所用的松萝酸购于sigma 公司。
图1:松萝酸抑制血管内皮细胞的增殖；
图1中均以p<0.05表示有显著差异。t表示pO.05; "+表示p0.001。 图2:松萝酸抑制血管内皮细胞的体外划痕迁移；
其中A.对照；B.20微摩尔/升松萝酸。 图3:松萝酸抑制血管内皮细胞修饰的Boyden小室迁移；
其中A.对照；B.20微摩尔/升松萝酸。 图4:松萝酸抑制血管内皮细胞的成管；
其中A.对照；B.20微摩尔/升松萝酸。 图5:松萝酸抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成；
其中A.对照；B.松萝酸剂量为5微克/鸡胚。 图6:松萝酸抑制小鼠角膜血管新生
其中A.对照；B.松萝酸治疗组 图7:松萝酸抑制肿瘤生长；
其中A.对照；B.松萝酸治疗组。
具体实施例方式
实验例l:松萝酸抑制人脐静脉内皮细胞增殖
目的和原理内皮细胞增殖实验采用MTS检测。MTS检测是一种运用比色法来检测 细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的测定方法。在活细胞中，线粒体中的NADPH脱氢 酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶于细胞培养液的有色物质。活细胞数越多，就可以更多 地转变四唑盐成为这种有色物质，所以其颜色深浅与细胞株的活细胞数目在一定范围内高度 相关，通过测定该物质在490nm处的光吸收值可以间接反应活细胞的数量。通过该方法可评 价药物对细胞增殖能力的影响。方法在96孔板中接入HUVEC细胞悬液，5000个/孔，设置对照组和加样组，对照组 不加松萝酸，加样组分别加入含有不同浓度松萝酸的培养基培养，作用60 72小时后，加入 20微升Ceimter 96 Aqueous细胞增殖检测试剂，孵育1-3小时，用酶标仪在490纳米处检 测每孔的光吸收值。
结果与评价与对照组相比，加入松萝酸的实验组，内皮细胞的增殖能力受到抑制，说 明松萝酸可以抑制内皮细胞的增殖，结果见图l。
实施例2:松萝酸抑制人脐静脉内皮细胞体外划痕迁移实验
目的和原理细胞迁移实验又叫体外划痕实验。本实验通在培养基中长满的单层细胞上
制造划痕，在显微镜下观察，记录划痕边缘细胞朝划痕部位迁移的情况，并统计有或无药物 作用下，划痕处新迁入的内皮细胞的数量，来评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。
方法将细胞接入6孔板中，待细胞长至90%以上的密度时，用微量移液器的1毫升吸 头在每孔的中间划十字线。用磷酸缓冲液(PBS)洗净划下的细胞，加入含不同药物浓度及8 纳克慮升VEGFw的培养基，于5%(302培养箱中37。C培养12 16小时，直至VEGFw5组划 线两侧的细胞迁移至划线区域中央。
结果与评价在显微镜下观察并拍照，结果见图2(其中A为对照组;B为含松萝酸20pM 组)。与对照组相比，加入松萝酸后，人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的迁移受到抑制，说明 松萝酸可以抑制人脐静脉内皮细胞的迁移。
实施例3:松萝酸抑制人脐静脉内皮细胞修饰的Boyden小室迁移实验 目的和原理内皮细胞修饰的Boyben小室最初是Boyden发明的，用于研究白细胞的 趋化性，这种研究基于小室被微孔分离成上下两个部分，本实验室采用的是Millopore公司购 买的小室。修饰的Boyden小室是一类可插入细胞培养板的培养皿，底层有孔径为8微米的多 聚碳酸盐滤膜，在生长因子的诱导下细胞可以透过膜的一侧粘附于含有高浓度生长因子的另 一侧。此实验可以检测药物对内皮细胞有阻力迁移能力的影响。
方法用0.1%的明胶将24孔板和放入其中的小室包被，于5%0)2培养箱中37'C孵育 30分钟，弃去明胶，用PBS洗三遍。小室外24孔板中加入含有10%血清和VEGF165内皮细 胞培养基。小室中接入细胞，之后再加入50uL不同浓度的药物，细胞在37'C 5%<:02培养 箱中孵育四小时。
结果与评价四小时后，将小室内外的细胞培养液吸去，用棉棒拭去上层细胞，将小室用PBS洗三遍吸干，然后用苏木精染色20分钟，再用 PBS将背景多余染料洗去，室温晾干。OLYMPUS显微镜下拍照计数统计数据。结果见图3 (其中A为对照组；B为含松萝酸组，20微摩尔/升)与对照组比，给予松萝酸后，人脐静脉 内皮细胞穿过Boyden小室的能力受到抑制，说明松萝酸可以抑制内皮细胞有阻力的迁移的能 力。
实施例4:松萝酸抑制人脐静脉内皮细胞成管实验
目的和原理Matrigel(基质胶)是从小鼠肉瘤EHS中抽提得到的可容性基底膜抽提物。 在室温下，此Matrigel可聚合成一种具有生物活性的基质材料，作用与哺乳动物细胞基底膜 类似，对于细胞的粘附和分化有效应作用。内皮细胞可以在Matrigel上融和成微管，可以利 用内皮细胞的这种成管特性来研究药物对内皮细胞成管的影响。
方法将Matrigel均匀铺到24孔板中，37°C， 5%(]02培养箱中放置30分钟待其凝固。 每孔加入相同体积的细胞和含有不同浓度松萝酸的培养基各500微升，混匀。于37'C 5%培 养箱巾培养16-18h在显微镜下观察微管形成情况，计算微管形成数量进行统计学分析。
结果与评价内皮细胞在Matrigel中生长16-18小时后，细胞在Matrigel中延伸生长，
由原来的单个细胞巻成管状相互连接，形成三维网状结构。结果见图4 (其中A:对照组；B:
20微摩尔)与对照组相比，给予松萝酸之后，内皮细胞成管过程受到影响，三维网络结构形成 受阻，说明松萝酸可以抑制内皮细胞微管形成。
实施例5:松萝酸抑制鸡胚尿囊膜血管新生
目的和原理鸡胚尿囊膜模型目前来说，是一种较为理想的国内外筛选血管新生类药 物公认的筛选模型。在鸡胚绒毛鸟囊膜的血管生成早期，机体免疫系统尚未完全建立，处于 对各种外来抗原免疫耐受阶段，对所加的测试药物不会产生排斥反应。将含药物的载体置于 其表面，可观察到药物对鸡胚尿囊膜新生血管的影响。
方法用1%。的新洁尔灭消毒种蛋外壳，之后将其置于恒温恒湿培养箱中孵育5天(气 室端向上)。在超净工作台中，用酒精擦拭其表面，在蛋壳钝端(气室端)用镊子小心地开一 个直径约1厘米的小口。通过开出的小孔观察胚胎所在的位置，向相反的方向剥除外壳，在 血管稀疏的地方用镊子撕开气室露出尿囊膜。之前准备好加入不同浓度松萝酸，直径为0.5毫 米的经过高压灭菌的滤纸片上，然后将滤纸片加在尿囊膜两条大血管间的无血管区或血管稀 疏的区域，用灭菌透明胶带封口，放入孵育箱中继续孵育。(A:对照组，不加松萝酸B: 5微克/鸡胚)
结果与评价放入滤纸片的鸡胚放入孵育箱中继续孵育两天后，揭去透明胶带，在体视 显微镜下拍照。结果见图5。与对照组比较，加松萝酸之后，新的微血管生成受到抑制，说明 松萝酸可以抑制鸡胚尿囊膜新血管的生成。
实施例6:松萝酸抑制小鼠角膜新生血管形成
目的与原理小鼠角膜是一个无血管区域，在小鼠角膜上做一个小袋，植入含有血管内 皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒，可以诱导存在于角巩缘处的血管向缓释颗粒的小袋生 长，给药组注射药物，对照组仅注射药物稀释剂，观察这些诱导的血管面积是否有改变。
方法将C57/BL6小鼠麻醉，固定，在角膜上开一小口，对照组与实验组均植入含有血 管内皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒，植入后复苏，次日开始施药，给药组小鼠腹腔注 射松萝酸，剂量为50毫克/公斤体重/天；对照组仅注射溶剂，连续给药一周后，显微镜下观
察拍照。
结果与评价结果见图6所示，与对照组相比，新生血管明显受到抑制，说明松萝酸可
以抑制山血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的新生血管形成。 实施例7:松萝酸抑制肿瘤生长
目的和原理:在小鼠身上荷瘤，通过多肿瘤的不同处理，以发现在不影响小鼠正常生长的 情况下，处理组和对照组肿瘤体积的变化。
方法将一定数量的肿瘤细胞注射到小鼠皮下，等实体肿瘤长到一定体积的时候,分别对 对照组和处理组注射不同浓度的松萝酸,同时每天监测其体重和肿瘤体积，22天后将肿瘤剥离。 结果与评价结果见图7所示，22天后，将经过松萝酸处理的加药组和对照组的小鼠肿 瘤剥离，加药组肿瘤体积明显小于对照组。
权利要求
1.式(1)的松萝酸在制备抑制血管新生的治疗和/或预防药物中的应用。式(1)
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制肿瘤血管新生。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制血管新生药物可抑制病变组织血管新生。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤血管新生包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤 血液癌症的血管新生，Kaposi's肉瘤病变组织血管新生，Paget' s疾病血管新生，血管瘤，血 管瘤病变组织血管新生，实体瘤病变组织血管新生，多发性血管瘤，血管母细胞瘤，良性血 管增生疾病。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病变组织血管新生包括关节炎病变组织血 管新生，血管新生性眼病，银屑病病变组织血管新生。
6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，含有有效量的式(I)松萝酸以及药学可接受成 分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种松萝酸在制备抑制血管新生药物中的应用。所述松萝酸可以抑制肿瘤血管新生，关节炎病变组织血管新生，新生血管性眼病，血管瘤病变组织血管新生，银屑病病变组织血管新生，实体瘤病变组织血管新生，血管瘤，Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症，Paget’s疾病血管新生。本发明还提供含有有效量的松萝酸以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
文档编号A61K31/343GK101664401SQ20091019455
公开日2010年3月10日 申请日期2009年8月25日 优先权日2009年8月25日
发明者代付军, 刘明耀, 卢彬彬, 宋雅娟, 京 张, 张晓丽, 易正芳, 董艳敏, 贺利军, 力 赖 申请人:华东师范大学