苊并杂环类化合物、其环糊精包合物、配结物及其在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用的制作方法

专利名称：苊并杂环类化合物、其环糊精包合物、配结物及其在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新的苊并杂环类化合物以及利用纳米技术制备的这类化合物的 环糊精包合物或者配结物；并涉及这些化合物在体内、体外的模拟BH3-0nly蛋白，竞争性 结合和拮抗Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-I蛋白，从而诱导细胞凋亡作用和作为抗癌化合物的应用。
背景技术：
分子靶向抗肿瘤药物正在成为继细胞毒剂类抗肿瘤药物之后，新药研发的热点和 市场化的新生代产品。Bcl-2蛋白，是拮抗和逆转恶性肿瘤永生性的最重要的分子靶点。所 以，特异性拮抗Bcl-2蛋白的药物，将通过专一诱导肿瘤细胞凋亡，终于实现高选择性、安 全、高效、低痛苦抗癌的目标。在Bcl-2抑制剂中，以BH3类似物(BH3mimetiCS)的抗肿瘤 效果最为显著，药效学活性最好，毒副作用最低。此外，也必须同时具备广谱拮抗Bcl-2家 族蛋白的抗凋亡成员(包括Bcl-2，Bcl-XL和Mcl-I蛋白)的能力。但到目前为止，以Bcl-2为靶点的抗肿瘤药物尚无上市产品，仅有的19个临床前 Bcl-2抑制剂中，有三个效果最优的分别处于临床I，II，III期。分别是由美国伊利诺州 阿伯特实验室研发的ABT-737，Gemin X公司研发的Obatoclax (GX15-070)，和美国Ascenta 公司的AT-101。它们都是BH3类似物，与Bcl-2蛋白的竞争结合常数达到nM级，远远高于 其它15个同类分子。但是它们都存在不足G0SSyp0l，Obatoclax的BH3类似程度不足，不 是绝对的BH3类似物，也就是具有不依赖BAX/BAK的细胞毒性，说明存在其他的作用靶点， 因此具有毒副作用。Obatoclax正因此面临淘汰。ABT-737虽然是绝对的BH3类似物，但是 不能与Mcl-I作用，不能广谱抑制Bcl-2家族蛋白，因而严重限制了其使用范围。本发明人既往研究的成果中公开了一系列8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的 苊并杂环类化合物，并且这类化合物具有通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长的活性(中国专 利，授权公告号CN1304370C)。然而，作为潜在的以凋亡为基础的抗肿瘤药物，其开发同样面 对此类药物开发的难点凋亡信号通路复杂及潜在的强烈的细胞毒性及其所必然导致的用 药的盲目性，而这是导致该类药物的开发失败的重要原因。因此，研究中需要突出强调药 物作用的靶向性。另一方面，药物的理化性状是影响药效发挥的重要原因，也可能影响药物开发过 程中对药效的准确评估。本发明的前期研究中就注意到此类问题。既往研究中的这些化合 物的水溶性较差，严重的限制其研究和应用。

发明内容
本发明旨在获得靶向性更强的可作为BH3类似物类Bcl-2家族蛋白(包括Bcl_2， Bcl-xL和Mcl-I蛋白)抑制剂的苊并杂环类化合物；并进而在此基础上，结合现代纳米技 术通过环糊精包合或者配结的手段，改善化合物的水溶性，提高生物利用度，以充分地开发此类化合物在作为靶向性抗肿瘤制剂方面的用途。本发明所述的苊并杂环类化合物具有如下的分子结构通式 其中(I)R1 = XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基，R2 = H，R3 = H，R4 = CN、C00H、 COOR6 或 CONHR7 ；(II)R1 = H, R2 = XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基，R3 = H, R4 = CN, COOH, COOR6 或 CONHR7 ；(III)R1 = H，R2 = H，R3 = H、XR5、四氢吡喃_4_氧基、四氢噻喃_4_氧基、噻吩甲 氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基，R4 = CN ；(IV) R1 = XR5, R2 = H, R3 = XR5, R4 = CN ；其中X = 0、S、羰基、酯基或酰胺；R5 = a、(CH2)nAr-(ο, m, ρ) Y，Y = CH3> NO2, Ph、F、Cl、Br、CF3> OCH3> SCH3 或 NH2 ；η =0 4 ；B、四氢吡喃基或四氢噻喃基；R6 = CH3 或 C2H5 ；R7 = CH3、C2H5 或 Ar。上述的取代基R1、! 2、R3和R4分别是8-氧-8Η-苊并[l，2_b]吡咯母核杂环上3、 4、6、9位的取代基。本发明的化合物合成主要分为两种途径。第一种合成途径是以具有很好的刚性共平面性并且强缺电子的8-氧-8H-苊并 [1，2-b]吡咯-9-腈为原料，与亲核试剂醇、硫醇或酚、硫酚类发生芳香氢亲核取代反应，得 到3-取代，4取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯_9_腈，腈基再经过水解，酯
化，酰胺化得到相应的酸，酯，酰胺，反应式如下 8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈在溶剂(四氢呋喃，乙腈，吡唳，二甲基甲酰胺 或二甲基亚砜)中，与适量的醇，硫醇，酚，硫酚类亲核试剂反应，温度为20 100°C，反应时 间0. 5 24小时。冷却后减压蒸出部分溶剂后，过滤或直接柱层析即可得产品3或6-单 取代氧基-8-氧代-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈。3或6-单取代氧基-8-氧代-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈在浓硫酸的条件下水解 可以得到其对应的酸类，在与相应的醇或者胺反应即可得到相应的酯类及酰胺类化合物。第二种合成途径是以苊醌为原料，以浓硫酸作溶剂，加入液溴回流2小时，得到溴 代苊醌。先用溴代苊醌与醇，硫醇，酚，硫酚反应得到相应的取代苊醌。取代苊醌与乙腈在 硅胶弱酸性催化的条件下反应得到3- (2-氧代_2氢-苊)-丙二腈之后，在K2CO3催化，乙 腈回流0. 5 6小时冷却后减压蒸除部分溶剂后，过滤或直接柱层析即可制得相应的3或 4_单取代氧基-8-氧代-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈。之后的水解，酯化，酰胺化条件同 第一条合成路径。第二条合成路径不同于第一条的条件在于先取代，后成环，这样可以得到3，4位 两种同分异构体而不是以前的3，6位。反应式如下
以及它们对Mcl-I和Bcl-2的抑制作用。结果表明，本发明的上述苊并杂环类化合物具有 极高的BH3类似程度，可以有效抑制Mcl-I和Bcl-2蛋白。基于此，该类化合物可用于制备 BH3类似物Bcl-2家族蛋白抑制剂，并进一步用于制备靶向性高的抗肿瘤药物。
研究中还发现，水溶性较差是本发明的上述苊并杂环类化合物的突出问题，严重 限制其研究及应用。参考现代药物制剂技术(环糊精化学——制备与应用.化学工业出 版社，2009 ； β -环糊精包合技术及应用·医学创新研究，2006，3 (3) :31_33 ；Chem. Pharm. Bull，2006，54(1) 26-32)，本发明的另一项内容在于利用环糊精包合或配结此类化合物，形 成包合物或配结物，从而改善其水溶性，提高生物利用度。本发明所述的上述苊并杂环类化合物的环糊精包合物是由下述方法制备①称取一定质量的环糊精，加入水中，加热搅拌使其成为饱和溶液，所述的环糊精 为β -环糊精、Y “环糊精、2-羟丙基-β -环糊精、甲基-β -环糊精或羟丙基_ Y _环糊精；②称取待包合的苊并杂环类化合物，该化合物与环糊精的摩尔比为1 3 10;③将待包合的苊并杂环类化合物以5 lOmg/mL的浓度溶于丙酮，将所得溶液以 线状逐滴加入到环糊精的水溶液中，40 65°C，加热搅拌1 6天，有沉淀析出；④将上述溶液过滤，用少量蒸溜水洗涤滤饼，再用少量的丙酮洗去游离状态的化合 物，50 70°C真空干燥，24 48小时后得到权利要求1的苊并杂环类化合物的环糊精包合物。本发明所述的上述苊并杂环类化合物的环糊精配结物是由下述方法制备①称取干燥的环糊精及待配结的苊并杂环类化合物，环糊精与该化合物的摩尔 比为1 1.5 3;所述的环糊精为β-环糊精、Y-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、甲 基-β -环糊精或羟丙基_ Y _环糊精；②将待配结的苊并杂环类化合物与N，N'-羰基二咪唑以1 1 2的摩尔比混合 后溶解到DMSO中，使待配结的苊并杂环类化合物在DMSO溶液中的浓度为0. 2 0. 5mmol/ mL，常温搅拌30 60分钟；③往上述DMSO溶液中加入步骤①所称取的环糊精及0. 1 0. 3mmol/mL的三乙醇 胺，常温反应18 24小时；④往步骤③的反应体系中加入0. 50 1. Omg/mL的丙酮，减压析出沉淀；⑤过滤，沉淀经纯化得权利要求1的苊并杂环类化合物的环糊精配结物。该纯化可以采用离子交换柱进行，条件为采用Diaion HP-20离子交换树脂做吸 附剂，解析采用甲醇与水的混合溶剂。逐渐增大混合溶剂中甲醇的比例，淋洗过程用薄层色 谱检测。当洗脱剂中甲醇所占比例达到40 55%时配结物部分被淋洗得到。将所得淋洗 液中的甲醇减压旋干之后，剩余溶液冷冻干燥得到配结物。本发明采用相溶解度法、荧光光谱法、圆二色谱法、红外光谱法、热重分析、扫描电镜 和H核磁、质谱以及X单晶衍射等表征手段对所得到的苊并杂环类化合物的环糊精包合物或 配结物进行表征，并对比检测了包合或配结前后苊并杂环类化合物的溶解度以及对Mcl-I和 Bcl-2的抑制作用的对比，结果表明环糊精包合或配结的处理方法大大提高了苊并杂环类化 合物在水中的溶解度，并且在一定程度上提高了抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能力。该制剂也可 用于制备BH3类似物类Bcl-2家族蛋白抑制剂，并进一步用于制备靶向性高的抗肿瘤药物。因此，本发明的另一目的是公开上文所述的苊并杂环类化合物、该苊并杂环类化 合物的环糊精包合物以及配结物在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。上述的Bcl-2家族蛋白抑制剂或相应的抗肿瘤药物可以是化合物的单质制剂、化 合物的环糊精包合物或配结物制剂，或者是有效量的所述苊并杂环类化合物或其环糊精包 合物、配结物与适量的药用辅剂混合形成的组合物。并可以根据药用需要，根据现有技术中的制剂方法将其制成需要的剂型。


本发明附图14幅附图1是荧光偏振方法检测化合物与FAM-Bid肽段竞争结合Bcl-2蛋白的动力学 曲线；附图2是化合物在细胞水平上干扰Bcl-2/Bax之间相互作用结果示图(不同浓 度)；附图3是化合物在细胞水平上干扰Bcl-2/Bax之间相互作用结果示图(不同作用 时间)；附图4是Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物的BH3类似度阳性结果示图；附图5是Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物的BH3类似度阴性结果示图；附图6是化合物依赖BAX/BAK的细胞毒性实验结果(Gossypol为非特异性对照)；附图7是化合物对Mcl-I抑制作用Western印记检测电泳图；附图8是化合物对Bcl-2抑制作用Western印记检测电泳图；附图9是化合物3-硫吗啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈抑制Mcl-I蛋白 作用半定量曲线；附图10是化合物3-硫吗啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈抑制Bcl_2蛋白
作用半定量曲线；附图11是比较苊并杂环类化合物及其环糊精包合物和配结物对Mcl-I和Bcl-2 的抑制作用的Western印记检测电泳图；附图12是3-硫吗啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈及其包合物对Mcl-I蛋 白抑制作用的半定量曲线；附图13是3-硫吗啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈及其包合物对Bcl_2蛋 白抑制作用的半定量曲线；附图14是实对比化合物和包和物在肿瘤模型动物体内对Mcl-I和Bcl-2的抑制 作用的Western印记检测电泳图，其中1、空白对照组；2、对照组①；3、对照组②，4、实验组 ①；5、实验组②；6、实验组③；7、实验组④。
具体实施例方式下面以具体实施例的方式对本发明的内容做进一步的说明。第一部分苊并杂环类化合物制备及其表征实施例；实施例1 :8_氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈的合成及表征在500mL单口烧瓶中，依次加入0. Imol苊醌，0. Ilmol丙二腈，150mL乙腈，加热至 回流，反应4小时，反应混合物由淡黄色浑浊变为橙红透明，冷至室温后，过滤，收集橙红色 滤饼，得到1-二氰基亚甲基-2-氧-苊。在500mL单口烧瓶中，依次加入1_ 二氰基亚甲 基-2-氧-苊0. 05mol,碳酸钾lg，200mL乙腈，加热至回流，反应4小时，大量土黄色固体产 析出。过滤，收集滤饼。将滤饼用大量温水洗涤后干燥，称重，产率95%。Μ. ρ· 275-277 0C ；1H NMR(400M, DMS0) δ 8. 705 (d，J = 8. OHz，1H)，8· 662 (d，J =8. 8Ηζ，1Η)，8· 631 (d，J = 8. 0Hz，1H)，8. 411 (d，J = 8. 0Ηζ，1Η)，8· 06 (t, J = 8. ΟΗζ,ΙΗ)，
7.984 (t，J = 8. OHz, 1Η)。实施例2 :3-(4_甲基苯氧基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧-8H苊并[1，2_b]吡咯_9_腈，0. 47g对甲基苯酚，回 流搅拌3小时，蒸出部分溶剂，层析柱分离得产品3-(4_甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[1， 2-b]吡咯-9-腈，收率40%。结构测定:M.p. 232-233 °C ； 1HNMR(400M, CDC13) δ 8. 916 (dd, J = 8·8Ηζ，1Η)，
8.623 (d, J = 8. 8Hz, 1Η)，8· 447 (d, J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 859 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 324 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 101 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 016 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，3. 256 (s, 3Η)。实施例3 :3_苯氧基-8-氧-8Η-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈(A)和4_苯氧 基-8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈⑶的合成及表征称取0. 93g 3-苯氧基苊醌，0. 3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱中，快 速淋洗，过柱完毕之后旋干得红色固体。称重10. lg，产率92%。取0.6g 3-苯氧基-(2-氧 代-2氢-苊)_丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加热回流3小时，反应完毕之后旋干反 应液。层析柱分离(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到橙红色固体，核磁检验同分异构体比例 1 0.3。利用制备液相分离的到两种同分异构体。第一组分A :M. ρ· 265-267 °C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 927 (d，J = 8. OHz，1H)， 8. 630 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 450 (d, J = 7. 2Hz, 1H)，7. 876 (t, J = 8. OHz, 1Η)，7. 754 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7. 392 (t, J = 7. 6Hz, 1H)，7. 233 (d, J = 7. 6Hz,2H)，7. 028 (d, J = 8. 4Hz, 1H)。第二组分B :M. p. 282-283°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 047 (dd, J = 8. OHz，1H)， 8. 850(dd, J = 7. 6Hz, 1H)，8· 213 (d，J = 8. 2Hz, 1Η)，7. 999 (t, J = 8. OHz, 1Η)，7. 561 (t，J = 8. 0Hz，2H)，7· 410 (t，J = 7. OHz, 1H)，7. 251 (d，J = 8. 8Hz，2H)，6. 899 (d，J = 8. 4Hz, 1H)。实施例4 :3_(对甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈㈧和4_(对 甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈(B)的合成及表征称取l.Og 3-对甲苯氧基苊醌，0.3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱中， 快速淋洗，过柱完毕之后旋干得红色固体。称重11. 2g，产率93%。取0.7g3-苯氧基-(2-氧代-2氢-苊)_丙二腈，加入0.08g K2CO3, 20mL乙腈加热回流4 小时，反应完毕之后旋干反应液。层析柱分离(CH2Cl2 石油醚=1 1)得到橙红色固体， 核磁检验同分异构体比例1 0.4。利用制备液相分离的到两种同分异构体。第一组分A :M. ρ· 232-233°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 916 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 623 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 447 (d, J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 859 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 324 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 101 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 016 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 351 (s, 3Η)。第二组分B :Μ. p. 258-260°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 987 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 858 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8. 208 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 986 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8. 333 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 112 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 889 (d，J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 349(s，3H)。实施例5 :3-(间甲基苯硫基)-8-氧-8Η-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈㈧和4_ (间 甲基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈(B)的合成及表征称取1. Og 3-间甲苯巯基苊醌，0. 3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱中， 快速淋洗，过柱完毕之后旋干得红色固体。称重12. 2g，产率91 %。取0. 7g2-苯巯基-(2-氧代-2氢-苊)_丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加热回流4小时，反应完毕之后旋干 反应液。层析柱分离(CH2Cl2 石油醚=1 1)得到红色固体，核磁检验同分异构体比例 1 0.25。利用制备液相分离的到两种同分异构体。第一组分A :M. ρ· 255-257°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 826 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 513 (d，J = 8. 8Hz, 1H)，8· 327 (d, J = 6. 4Hz, 1H)，7· 659 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 014 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 901 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 896 (d，J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 353(s，3H)。第二组分B :Μ. p. 269-2710C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 877 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 748 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 108 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 856 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 123 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 892 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 679 (d，J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 355(s，3H)。实施例6 :6-(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及 表征50mL乙腈中加入lg8_氧-8H苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，0. 5g噻吩甲醇，回流搅拌 6小时，蒸发部分溶剂，层析柱分离得产品6-(2_噻吩甲氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡 咯-9-腈，收率45%。M. p. 241-243°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 685 (dd, J = 8. 7Hz, 1H)，8· 433 (d，J = 8. 7Hz, 1H) ,8. 014 (d, J = 6. 4Hz，lH)，7. 75 (t, J = 8. 0Hz，lH)，7. 251 (t，J = 8. 4Hz，lH)，
7.181 (d，J = 8. 4Hz, 1H)，6. 985 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，6. 232 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，3. 454(s，2H)。实施例7 :3- (3-氟代苯甲酰基)-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈㈧和 4-(3-氟代苯甲酰基)-8-氧-8!1-苊并[l，2-b]吡咯_9_腈(B)的合成及表征称取l.Og 3-间氟苯羰基苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱 中，快速淋洗，过柱完毕之后旋干得深红色固体。称重10. 5g，产率85%。取0.8g 2-氟羰 基_ (2_氧代_2氢-苊)-丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加热回流3小时，反应完毕 之后旋干反应液。层析柱分离(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到深红色固体，核磁检验同分 异构体比例1 0.2。利用制备液相分离得到两种同分异构体。第一组分A :M. ρ· 285-287°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 726 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)，
8.423 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 015 (d，J = 6. 4Hz, 1H)，7. 598 (t, J = 8. OHz, 1H)，8· 003 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 853 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 756 (d, J = 8. 4Hz，1H)。第二组分B :M. ρ· 269-2710C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 568 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 478 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8. 006 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 568 (t, J = 8. OHz, 1H)，8. 045 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 908 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 596 (d, J = 8. 4Hz，1H)。实施例8 :3-(N-苯基甲酰基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈(A)和4_(N_苯 基甲酰基)-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈⑶的合成及表征称取l.Og 3-苯基酰胺苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅胶柱中，快 速淋洗，过柱完毕之后旋干得深红色固体。称重11. 2g，产率86%。取0.8g苯酰胺-(2-氧 代-2氢-苊)-丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加热回流3小时，反应完毕之后旋干反 应液。层析柱分离(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到深红色固体，核磁检验同分异构体比例 1 0.4。利用制备液相分离得两种同分异构体。第一组分 A :M. ρ· 281-283°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 112 (d，J = 8. OHz, 1Η)，8. 945 (d, J = 8. 8Hz，lH)，8. 682(d，J = 7. 2Ηζ,1Η),8. 452 (t, J = 8. OHz, 1H), 8. 312 (s, 1H), 7. 986 (t, J =
108.0Hz, 2H)，7. 627 (t, J = 7. 6Hz, 1H)，7. 433 (d, J = 7. 6Hz,2H)，7. 241 (d, J = 8. 4Hz, 1H)。第二组分B :M. p. 293-294°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 213 (dd, J = 8. OHz, 1Η)，
9.012 (dd, J = 7. 6Hz, 1H)，8· 685 (d，J = 8. 2Hz, 1Η)，8· 428 (t，J = 8. OHz, 1Η)，8· 320 (s, 1Η)，7· 896 (t, J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 675 (t, J = 7. OHz, 1Η)，7. 531 (d, J = 8. 8Ηζ，2Η)，7· 015 (d， J = 8. 4Hz, 1Η)。实施例9 3-(四氢-2Η-吡喃基~4~氧基)_8_氧_8Η_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈(A) 和4-(四氢-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈(B的合成及表征称取l.Og 3-(4-四氢吡喃氧基)苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅 胶柱中，快速淋洗，过柱完毕之后旋干得深红色固体。称重11. 2g，产率86%。取0. Sg 4-四 氢吡喃“(2-氧代_2氢-苊)-丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加热回流9小时，反应 完毕之后旋干反应液。层析柱分离(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到深红色固体，核磁检验 同分异构体比例1 0.4。利用制备液相分离的到两种同分异构体。第一组分A :M. ρ· 230-231 "C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 601 (d, J = 8. OHz, 1H)， 8. 134 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，7. 945 (dd, J = 8. OHz, 1H)，7. 452 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，3. 822 (t, J =4. 8Ηζ，4Η)，3· 815 (t，J = 5. 0Ηζ，4Η)，3· 766 (t，J = 5. 2Hz, 1H)。第二组分 B :M. p. 242-244 °C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 568 (d，J = 8. OHz，1H)， 8. 115 (d，J = 8. 8Hz, 1H)，7. 856 (dd, J = 8. OHz, 1H)，7. 326 (d，J = 8. 4Hz, 1H)，3. 796 (t，J =4. 8Hz，4H)，3. 807 (t，J = 5. 0Hz，4H)，3. 791 (t，J = 5. 2Hz, 1H)。实施例10 3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_甲酸的合成及表征在50mL单口烧瓶中，加入60mL浓硫酸或者25mL发烟硫酸，在0 5°C下，分批加入 0. 05mol的3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，1小时内加完，加完后在室温继续 反应16小时，反应混合物为粘稠的深棕红色。然后小心缓慢的将其滴入碎冰中，同时剧烈搅 拌，滴完后静置，滤饼用大量水洗涤，直至滤饼呈中性，滤饼干燥后得深黄色产品。产率96%。Μ. ρ· 248 "C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 11. 42 (s, 1H)，8· 965 (dd, J = 8. OHz, 1Η)， 8. 750(dd, J = 7. 8Hz, 1H)，8· 313 (d，J = 8. 2Hz, 1H)，7. 999 (t, J = 8. 2Hz, 1H)，7. 561 (t，J = 8. 2Hz，2H)，7. 410 (t，J = 7. OHz, 1H)，7. 251 (d，J = 8. 8Hz，2H)，6. 963 (d，J = 8. 4Hz, 1H)。实施例11 :3_苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸甲酯的合成及表征在IOOmL单口烧瓶中，依次加入0. Olmol 3-苯氧基-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡 咯-9-腈，50mL乙腈做溶剂，0. 02mmol的碳酸钾做缚酸剂，过量10倍的碘甲烷，氮气保护下，加 热至40°C反应15小时。减压蒸去乙腈，加入二氯甲烷使反应物充分溶解，过滤之后旋干滤液，得 黄棕色粗产品。硅胶柱层析分离，展开剂二氯甲烷-甲醇(40 1)，得深黄色产品。产率92%。Μ·ρ·213 "C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 102 (d, J = 7. 2Hz, 1H) ,8. 965 (dd, J = 8. OHz, 1Η)，8· 850 (dd, J = 7. 8Hz, 1Η)，8· 233 (d，J = 8. 2Hz, 1Η)，7. 856 (t，J = 8. 2Hz, 1Η)， 7. 453 (t, J = 8. 2Ηζ，2Η)，7· 350(t, J = 7. 2Hz, 1Η)，7. 325 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，3· 213(s，3H)。实施例12 3-苯氧基-8-氧-8Η-苊并[1，2_b]吡咯_9_N_叔丁基酰胺的合成及 表征在IOOmL单口烧瓶中，依次加入0. Olmol 3_甲氧基_8_氧_8H_苊并[l，2_b]吡 咯-9-酸，50mL DMF 做溶剂，0. 02mmol 的三乙胺，0. Olmmol 的(EtO) 2P( = 0)CN，过量 10 倍 的叔丁胺，常温反应1小时。反应完毕得到黄色固体，产率85%。MpJSTtVH NMR(400M,CDCl3) δ 8. 746 (dd, J = 8. OHz, 1H) ,8. 650 (dd, J = 7. 8Hz, 1H)，8. 213 (d，J = 8. 2Hz, 1H)，
7.846 (t, J = 8. OHz, 1H)，7. 352 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7. 210 (t, J = 7. 4Hz, 1H)，7. 051 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，6· 963 (d, J = 8. 4Ηζ，1Η)，3· 721(s，3H)，3. 113 (m，2Η)，1. 568 (dd，J = 5. 6Hz, 2H),1.421(m, J = 5. 7Hz，2H)，0. 968 (t, J = 6. 2Hz，3H)。实施例13 :3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈，3. 2g对溴苯硫酚，常温 反应2小时，蒸出部分溶剂，层析柱分离得化合物3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1， 2-b]吡咯-9-腈，收率40%。M. p. 262-263°C;lH NMR(400M, CDC13) δ 8. 852 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 813(d, J =
8.8Hz, 1Η)，8. 015 (d，J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 945 (t，J = 8. OHz, 1Η)，7. 560 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，
7.096 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 006 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)。实施例14 :3，6- 二 (4-溴代苯硫基)_8_氧_8Η_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈的合成 及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，6. 5g对溴苯硫酚，常温 反应36小时，蒸出部分溶剂，层析柱分离得化合物3，6- 二(4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊 并[1,2-b]吡咯-9-腈，收率20%。M. p. 262-263°C;lH NMR(400M, CDC13) δ 8. 815 (dd, J = 8. 8Hz，1H)，8. 671 (d，J =
8.8Hz, 1H)，7· 881 (t，J = 6. 4Hz, 1H)，7. 551 (q, J = 8. 0Hz，4H)，7. 215 (q，J = 8. 4Hz，4H)，
6.472 (s，1H)。实施例15 :6-(4-氨基苯硫基)-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，2. 5g对氨基苯硫酚，常 温反应2小时，蒸出部分溶剂，层析柱分离得化合物6-(4-氨基苯硫基)-8-氧-8H-苊并 [1,2-b]吡咯-9-腈，收率 30%。M. p. 255-257°C ；IH NMR(400M, CDC13) δ 8. 832 (dd, J = 8. 8Hz，lH)，8. 801(d，J = 8. 8Hz，1H)，7. 985 (d，J = 6. 4Hz，1H)，7. 925 (t，J = 8. OHz, 1H),
7.570 (d, J = 8. 4Hz,2H)，6. 997 (d, J = 8. 4Hz,2H)，7. 006 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，6. 271 (s，2H)。实施例16 :3，6-二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成 及表征50mL乙腈中加入Ig 8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯-9-腈，5. Og对氨基苯 硫酚，常温反应30小时，蒸出部分溶剂，层析柱分离得化合物3，6_ 二(4-氨基苯硫 基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈，收率25%。M. p. 288_290°C;1H NMR(400M,CDC13) δ 8. 835 (dd, J = 8. 8Hz, 1Η)，8. 682 (d, J = 8. 8Hz, 1Η)，7. 973 (t, J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 581 (q, J = 8. 0Ηζ，4Η)，7· 234 (q, J = 8. 4Ηζ，4Η)，6· 651 (s，1Η)，6· 269(s，4H)。第二部分苊并杂环类化合物环糊精包合物、配结物的制备及其表征实施例；本部分内容包括苊并杂环类化合物环糊精包合物、配结物的制备及对产物的表 征，所采用的表征手段包括紫外光谱、荧光光谱、圆二色光谱、红外光谱、热失重分析及SEM。 如无特殊说明，本部分涉及的仪器及其检测方法参考来源如下相溶解度图按照文献J. Agric. Food Chem.，2007，55 (9)，3535-3539 的方法绘制 相溶解度图。紫外光谱HP8453 (美国)；检测方法参考文献Journal of PhotochemistryandPhotobiology A =Chemistry 173(2005)319—327。荧光光谱:PTI-700(美国)；检测方法参考文献J Fluoresc (2008) 18 :1103_1114。圆二色光谱J-810(日本)；检测方法参考文献J. Phys. Chem. B，2006，110 (13)， 7044-7048。红外光谱FT/IR_430(日本)；检测方法参考文献Mol. Pharmaceutics，2008， 5(2)，358-363。热失重分析TGA/SDT851e(瑞士)；检测方法参考文献Mol. Pharmaceutics，2008， 5(2)，358-363。SEM :JSM-5600LV(日本)；检测方法参考文献 J. Med. Chem. 2003，46，4634-4637。H 核磁=Bruker Avance II 400M(瑞士 )；检测条件为(溶剂 CDC13，400M)。质谱GC-TofMS (英国)；检测方法参考文献 J. Org. Chem. 2000，65，9013-9021。X单晶衍射XD_3A(日本)；检测方法参考文献J. Org. Chem. 2008，73， 8305-83168305。实施例17 3-硫吗啉-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈β -环糊精包合物的 制备及表征首先称取将经过二次重结晶并充分干燥的β-环糊精1.85g(1.63mM0l)，加入 IOOmL水，加热并搅拌使其溶解。称取待测化合物0. 179g(0. 54mMol)，用35mL丙酮溶解之 后，以线状逐滴加入到β-环糊精的水溶液中，60°C加热搅拌3天后，有沉淀析出，过滤，用 少量蒸馏水洗涤滤饼之后，再用少量的丙酮洗去游离状态的化合物，真空下50°C干燥24小 时，得到淡紫色固体。紫外吸收检测结果表明，随着β -环糊精浓度的逐渐增大化合物的紫外吸收值逐 渐增大，其溶解度逐渐增大，表示包合物的形成。由相溶解度图结果可知化合物的溶解度由原来的0.21 μ M增加到0.36 μ Μ，提高 了 1. 5 倍。荧光光谱检测结果显示固定待测化合物的浓度不变，荧光值随着环糊精浓 度的逐渐增大而增大。荧光发射波长不变，但是强度增大，原因化合物进入环糊精空腔之 后，空腔环境的变化，保护了处于激发态的化合物分子，使之不与大体积分子和淬灭剂接 触，这种荧光光谱的变化表明了化合物与环糊精生成了包合物。圆二色光谱检测结果显示在环糊精存在的情况下，待测化合物的诱导圆二 色在260nm到375nm有一个强的正Cotton效应的峰，以及在400nm到500nm处有一个弱的 Cotton效应的正峰，这说明化合物进入环糊精的手性空腔之后，产生了诱导圆二色效应，表 明了包合物的形成。红外光谱检测结果显示β -环糊精在3410. 18和1029. 22cm"1有强的吸收带，同 时在579 911CHT1处有一系列的指纹区特征峰。化合物在2218. 55cm"1和1625. 08cm"1有 两个尖锐的特征吸收峰。红外谱图中2219. 13cm"1和1625. 48cm"1特征吸收峰强度变小，及 轻微的位移，同时在1706CHT1出现的一个新的尖峰，表明了包合物的形成。热失重分析检测结果显示β -环糊精在298°C出现拐点，开始降解。而包合物在 269°C即出现拐点，开始降解，不同于β-环糊精，表明了包合物的形成。SEM结果显示3_硫 吗啉基-8-氧-8Η-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈化合物为针状外形，β -环糊精为较大的方砖
13状，化合物与β “环糊精物理混合SEM图是针状与方砖状的混合外形，而化合物_ β _环糊 精包合物的表面形貌明显不同于以上三者，其外形为规整的菱形。从外形结构的明显不同 可以看出包合物的形成。其他包合物的制备及表征采用与实施例17相同的方法，利用不同类型环糊精包合同系列的其他化合物；同 样采用紫外、荧光光谱、圆二色光谱、红外光谱、热失重分析及SEM对产物进行了表征，证明 了包合物的形成，并通过相溶解度实验检测对比包合前后化合物与其包合物溶解度的变 化。具体结果如表1所示。从表1的检测结果可以看出，不同类型的环糊精包合的苊并杂环类化合物在水中 的溶解度较化合物本身均大大提高。表 1 实施例 18 γ I 孕鎏讁此 3-蓺-B暴-8—it-8H-铺华〔1, 2-bu 异忝 If 蓉S垂蚋知媧m“忝 3-蓺屆暴-8-it-8H-铺华〔1,2-bu 异忝-9— S (0. 263g,0. 75mmol)菩 N, N、(0. 二豸)磙繁埋31^浮0150书，滂加碑_雞4|30氺銮^加，&> γ-孕蓬精(0. 6485g，0. 5mmol)及4mL的三乙醇胺。常温反应18小时。反应完毕之后，加入约200mL 的丙酮于反应液，减压使析出沉淀。所得沉淀用离子交换柱提纯，所得产品再用甲醇与水的 混合溶剂洗涤，溶液冻干得到0. 42g的3-硫吗啉-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸 /Y-环糊精配结物。产率25%。H 核磁及质谱检测结果显示=IH NMR(400M, D20_d6) δ (ppm) 8. 87 (d，J = 8. 5Hz， 1Η)，8. 58-8. 55(m，2H)，7. 91(t，J = 8· 5Hz，1Η)，7· 39 (d，J = 8· 5Hz，1Η)，5· 03 (m，8Η)， 3. 83 (m, 8Η)，3. 80 (m, 8Η)，3. 74 (m, 8H)，3. 72-3. 70 (m, 3_N (CH2*) 2 (CH2) 2S, 4H)，3. 59 (m, 8H)， 3. 52 (m, 8H)，2. 98-2. 96 (m, 3_N (CH2) 2 (CH2) 2*S, 4H) ； (ESI) m/z (M+H) - (1629m/z)。X单晶衍射表征结果显示Y _环糊精在12°和15 23°之间有一系列的尖峰出 现，化合物3-硫吗啉-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸只在11°和7°处有尖峰。而 配结物在11°处的尖峰消失，在6°有一个新的尖锋，在14 18°以及20 25°出现一系 列的尖峰。相对于化合物与环糊精而言，配结物中有新的尖峰出现，表明了配结物的形成。化合物3-硫吗啉-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸与Y-环糊精配结之 后，在水中的溶解度明显增大。相溶解度曲线拟合曲线方程为Y = 0.68+0. 14XX。3-硫 吗啉-8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-甲酸在水中的溶解度由原来的0.68μΜ增加到 11. 2 μ Μ，提高了 16. 5 倍。其他配结物的制备及表征采用与实施例18相同的方法，利用不同类型环糊精配结同系列的其他化合物；同 样采用H核磁、质谱和X单晶衍射对产物进行了表征，证明了配结物的形成，并通过相溶解 度实验检测对比配结前后化合物与其配结物溶解度的变化。具体结果如表2所示。从表2的检测结果可以看出，不同类型的环糊精配结的苊并杂环类化合物在水 中的溶解度较化合物本身均大大提高。表2 第三部分苊并杂环类化合物、其环糊精包合物、配结物的理化活性检测实施例19 通过荧光偏振分析法检测化合物的ΒΗ3类似程度合成一个带有21个氨基酸的Bid ΒΗ3肽段(氨基酸79_99 QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在N端标记上6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(FAM)作为荧光标 签(FAM-Bid)。竞争结合实验中所用的反应体系为GST-Bcl-2蛋白(40nM)或Mcl-I蛋白， 和FAM-Bid多肽(5nM)溶于反应缓冲液中(IOOmM K3PO4,pH 7.5 ；100yg/mL牛γ白蛋白；0.02%叠氮化钠)。在96孔板中，每孔加入IOOyL反应体系，然后加入IyL不同浓度的 溶于DMSO的待检测化合物3-硫吗啉-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯-9-腈母液至实验设 计所需终浓度。同时设立两个对照组，一个对照组为反应体系中只含有Bcl-2或Mcl-I和 FAM-Bid(相当于0%抑制率)，另一对照组中的反应体系只含有FAM-Bid肽段。96孔板经 过4个小时的避光孵育后，进行酶标仪上检测。荧光极化值(mP)在由530nm波长激发产生 的485nm发射波长下测量。Ki值根计算公式推导得出。试验结果如附图1所示。该化合物 与Bcl-2蛋白的竞争结合常数为310nM。按照上述相同的试验方法检测其他9个化合物的BH3类似程度，它们与Bcl_2和 Mcl-I蛋白的结合常数(表3中简称结合常数)在也是nM级，具体结果如表3所示。表3
3，6- 二(4-氨基苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈7. 03_(四氧-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈600. 04-苯氧基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈890. 06_(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈560. 03-苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-甲酸甲酯790. 0 实施例20 活细胞内荧光偏振能量转移(FRET)检测化合物的ΒΗ3类似性利用磷酸钙共沉淀的方法将2 μ gBcl-2-CFP和Bax-YFP质粒分别或同时转染至 Hela细胞中，转染24小时后，将细胞接种于6孔培养板(2 X IO5个/孔)，加入溶于DMSO的 待检测化合物3-硫吗啉8-氧-8Η-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈至终浓度(2，5，10和15 μ M), 药物作用24小时后(如附图2)，PBS清洗细胞3次，用GENIOS荧光酶标仪(TECAN，Swiss) 检测荧光值。在时间依赖的实验中，转染后的细胞接种于6孔板后，加入40 μ M化合物，药 物作用3、6和24小时(附图3)，读板检测荧光。在只转染Bcl-2-CFP质粒的细胞组中记录 475nm发射波长值，激发波长为433nm。在只转染Bax-YFP质粒的细胞组中记录527nm发射 波长值，激发波长为505nm。对共转染Bcl-2-CFP和Bax-YFP质粒的细胞实验组记录527nm 和475nm发射波长值，激发波长为433nm。527nm发射荧光与475nm发射荧光相比值即为 FRET，将单独转染对照组的FRET值设为1. 0，表示两蛋白未发生荧光偏振能量转移。在共转 染的细胞中，由于Bcl-2蛋白和Bax蛋白的相互作用使得FRET值增加至2. 0，而随着加药浓 度和时间的增加，对两蛋白相互作用的干扰增强，FRET随之减弱。细胞活力由MTT法进行 测定。试验结果如附图2和附图3所示，该化合物在2 μ Μ,作用3小时即可干扰Bcl-2/Bax 之间的相互作用，呈浓度时间依赖趋势。按照上述相同的试验方法检测其他7个化合物，试验证明这些化合物在不同作用 浓度和作用时间的条件下，均具有细胞内模拟BH3-only蛋白的作用，能明显干扰Bcl-2/ Bax之间的相互作用。具体结果如表4所示。
其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下干扰Bcl-2/Bax之间的相互作用发生 的时间。表4 实施例21 通过Bax蛋白与线粒体共定位检测化合物的BH3类似度利用磷酸钙共沉淀方法将5 μ g Bax-YFP质粒转染至MCF-7细胞中，转染24小 时后，将细胞接种于6孔培养板(0. 2X IO6个/孔)，加入10 μ M待检测化合物3-硫吗啉 8-氧-8Η-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈，作用6小时后，PBS清洗并同50nM MitoTracker Red CMXRos (线粒体特异探针；红色)避光孵育1011^11，？83清洗三次后，1^肚￡111(^2000激光共聚 焦显微镜(Bio-Rad，USA)扫描荧光图像。同时进行双通道扫描，一个通道扫描Bax-YFP的 绿色荧光，另一通道扫描指示线粒体的CMXRos探针红色荧光，两通道图像相互叠加显示共 定位情况。当Bax蛋白定位于线粒体上，绿色荧光与红色荧光叠加成橘色，如附图4所示； 对照附图5显示不能驱动BAX向线粒体移位，共定位失败的试验结果。按照上述相同的试验方法检测其他8个化合物，结果显示他们在不同作用浓度和 作用时间的条件下，均具有驱动BAX向线粒体移位的作用，说明具有细胞内模拟BH3-only 蛋白的作用。具体结果如表5所示，其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下模拟 BH3-only蛋白驱动BAX向线粒体移位的作用发生的时间。表 5
细胞，Western检测RNA干扰后BAX和BAK蛋白表达情况，相同处理无质粒转染的细胞组 设为对照组。转染后的细胞接种于96孔板中(IXlO5个/孔)，平行进行未转染质粒细胞 组的对照实验，按实验设计浓度梯度加入待检测化合物3-硫吗啉8-氧-8H-苊并[1，2-b] 吡咯-9-腈，作用48小时后，MTT检测细胞活力，结果如附图6所示，Gossypol作为非特异 性BH3类似物与本发明的化合物对比平行处理，可见3-硫吗啉8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡 咯-9-腈具有绝对依赖BAX/BAK的细胞毒性。按照上述相同的试验方法检测其他8个化合物(如下所述化合物① ⑧)，结果显 示所检测化合物也均具有绝对依赖BAX/BAK的作用特点。这些化合物包括①8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯 _9_ 腈；②3- (4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈；③6-(4-氨基苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；④3，6-二(4-溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑤3，6-二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑥4-(3-氟代苯甲酰基)-8-氧_8!1-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；⑦6_(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑧3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸。实施例23 =Western印记检测化合物对Mcl-I和Bcl_2的抑制作用收集细胞样品后，以1Χ 106/50 μ L 细胞裂解液(62. 5mM Tris-HCl pH 6.8 ；2% SDS 甘；50mM DTT ;0. 01 %溴酚蓝)低温裂解，离心，取蛋白上清，100°C煮沸样品5分 钟，12% SDS-PAGE电泳并转膜，相应抗体检测目的蛋白，辣根过氧化酶标记二抗并结合ECL 显色法检测目的蛋白在细胞中的表达量。附图7和附图8分别显示待检测化合物3-硫吗 啉8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈对Mcl-I和Bcl-2的抑制作用。从图中可以看出，随 着待测化合物作用于肿瘤细胞时间的延长，Bcl-2和Mcl-I的蛋白条带逐渐变浅，说明化合 物具有抑制这两个蛋白的作用。利用KODAK Gel Logic 1500成像系统软件对Western图 片中蛋白条带浓度进行半定量分析，归一化处理后，蛋白条带的浓度如附图9和10所示。经同样方法对检测下述8个化合物，它们均具有抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的作用， 这些化合物包括①8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯 _9_ 腈；②3- (4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈；③6-(4-氨基苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；④3，6- 二(4-溴代苯硫基)-8-氧_8H_苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑤3，6-二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑥3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-N-叔丁基酰胺；⑦6-(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑧4_(四氢-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；这些化合物下调Mcl-I蛋白和Bcl-2蛋白的半定量分析结果分别如表6和表7所 示表6 化合物①_⑧下调Mcl-I蛋白的半定量分析就结果 表7化合物①_⑧下调Bcl-2蛋白的半定量分析结果 实施例24 =Western印记检测比较苊并杂环类化合物及其环糊精包合物和配结物 对Mcl-I和Bcl-2的抑制作用将细胞接种于6孔培养板(2 X IO5个/孔)，化合物组加入溶于DMSO的化合物3-硫 吗啉8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈至终浓度10 μ M，包和物组加入溶于水溶液的相当 于10 μ M化合物的Y -环糊精包和物，药物作用24小时后，PBS清洗细胞3次，收集细胞样 品后，以 1Χ 106/50 μ L细胞裂解液(62. 5mM Tris-HCl pH 6. 8 ；2% SDS ；10%甘；50mM DTT ； 0.01%溴酚蓝)低温裂解，离心，取蛋白上清，100°C煮沸样品5分钟，12% SDS-PAGE电泳并 转膜，相应抗体检测目的蛋白，辣根过氧化酶标记二抗并结合ECL显色法检测目的蛋白在 细胞中的表达量。检测结果如附图11所示。可以看出3_硫吗啉8-氧-8H-苊并[l，2-b] 吡咯-9-腈的Y -环糊精包和物对Mcl-I和Bcl-2蛋白的抑制作用明显高于该化合物本身。 即Y-环糊精包和物明显提高了抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能力。利用KODAK Gel Logic 1500成像系统软件对Western图片中蛋白条带浓度进行 半定量分析，归一化处理后，蛋白条带的浓度如附图12，13所示。本实施例还采用上述同样方法检测了 β _环糊精、2-羟丙基-β _环糊精、甲 基-β -环糊精和羟丙基_ Y _环糊精包和的3-硫吗啉8-氧-8Η-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈， 以及下述化合物，均比化合物本身具有更高的细胞内抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能力。这 些化合物包括①8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯 _9_ 腈；②3- (4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈；③6-(4-氨基苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；④3，6- 二(4-溴代苯硫基)-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈；⑤3，6- 二(4-氨基苯硫基)-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈；⑥4_(四氢-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；这些化合物及其包合物下调Mcl-I蛋白和Bcl-2蛋白的半定量分析结果分别如表 8和表9所示表8 化合物①_⑥和它们的包和物下调Mcl-I蛋白的半定量分析结果 表9 化合物①_⑥和它们的包和物下调Bcl-2蛋白的半定量分析结果 本实施例还采用上述同样方法检测了 Y-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、 甲基-β-环糊精或羟丙基-Υ-环糊精配结的其他同类化合物，如3_(对甲基苯氧 基)-8_氧-8Η-苊并[l，2-b]吡咯-9-甲酰胺、3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1， 2-b]吡咯-9-甲酸、3-硫吗啉基-8-氧-8H-苊并[1,2-b]批咯_9_甲酰胺。试验表明这 些化合物的环糊精配结物均比化合物本身具有更高的细胞内抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能 力。实施例25 =Western印记检测对比化合物和包和物在肿瘤模型动物体内对Mcl-I 和Bcl-2的抑制作用选择饲养的中国昆明小鼠，随机分组，每组10只。培养的肝癌细胞H22，按 200 μ L/只接种于小鼠腋下皮下。于荷瘤5天后，皮下瘤块形成。开始腹腔注射待测化合 物3-硫吗啉8-氧-8Η-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈，Y-环糊精包合的待测化合物，和口服 Y-环糊精包和包合的待测化合物。测试条件包括空白对照组皮下荷瘤后小鼠不经任何处理；对照组①皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射DMSO溶液，共计10天；对照组②皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射环糊精溶液，共计10天；实验组①皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射0. 03mg/kg体重化合物的DMSO溶液， 共计10天；实验组②皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射0. 3mg/kg体重化合物的DMSO溶液，共 计10天；实验组③皮下荷瘤后给小鼠隔日腹腔注射相当于0. 3mg/kg体重化合物的包和 物水溶液，共计10天；实验组④皮下荷瘤后给小鼠隔日灌胃相当于0. 3mg/kg体重化合物的包和物水 溶液，共计10天。实验期间每周两次测定肿瘤长径(a)及与之相垂直的短径(b)，按公式l/2ab2计 算肿瘤体积。观察动物存活时间。实验第40天，按肿瘤体积计算抑瘤率。结果显示实验组②(化合物DMSO溶液注射组)抑瘤率22.3%;实验组③(包和包合物注射组)抑瘤率61. 5% ；实验组④(包和包合物口服组)抑瘤率43. 7 %。对照组动物平均生存时间为28士2. 1天，化合物组的平均寿命33士3. 1天，包和包 合物注射组平均生存时间为48士5. 1天，包合物口服组平均生存时间为42士 1. 1天。统计 学处理结果显示P <0. 05。小鼠死亡或处死后，剥取小鼠皮下肿瘤，按1 3体积用生理盐水将组织勻浆制备
22细胞悬液，采用与实施例24相同的western检测方法，检测肿瘤细胞Bcl_2、Mcl-I蛋白的 表达情况。结果如附图14所示，其中，电泳道6的蛋白条带比电泳道5的条带浅，表明包合 物的体内抑制Bcl-2、Mcl-I的能力高于化合物本身。β -环糊精、2-羟丙基-β -环糊精、甲基_ β _环糊精和羟丙基_ Y _环糊精包和 的3-硫吗啉8-氧-8Η-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈、以及下述化合物，均有同样的体内抗肿 瘤的作用。包括①在相同于实验组②的条件下，8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的抑瘤率 约60% ；在相同于实验组③的条件下，羟丙基Y-环糊精包合的化合物29-1的抑瘤率约 80% ；②在相同于实验组②的条件下，3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡 咯-9-腈的抑瘤率约40%左右；在相同于实验组③的条件下，2-羟丙基-β -环糊精包合的 化合物29-2的抑瘤率约60% ；③在相同于实验组②的条件下，6-(4_氨基苯硫基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b]吡 咯-9-腈的抑瘤率约30% ；在相同于实验组③的条件下，Y-环糊精包合的化合物29-3抑 瘤率约40% ；④在相同于实验组②的条件下，3，6_二(4-溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b] 吡咯-9-腈抑瘤率达到78% ；在相同于实验组③的条件下，甲基-β -环糊精包合的化合物 29-4的抑瘤率约85% ；⑤在相同于实验组②的条件下，3，6_二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b] 吡咯-9-腈的抑瘤率为50% ；在相同于实验组③的条件下，Y -环糊精包合的化合物29-5 的抑瘤率约为60% ；⑥在相同于实验组②的条件下，4-(四氢-2H-吡喃基-4-氧基)_8_氧_8H_苊并 [l，2-b]吡咯-9-腈的抑瘤率在40%左右；在相同于实验组③的条件下，β-环糊精包合的 化合物29-6的抑瘤率约55%。其它化合物的抑瘤率在30 50%之间。它们的环糊精包合物组的抑瘤率普遍高 于化合物本身(P < 0. 05)。γ -环糊精、2-羟丙基-β -环糊精、甲基_ β _环糊精、和羟丙基_ Y _环糊精配结 的下述化合物，相对于这些化合物本身也具有更强的体内抑制Bcl-2、Mcl-I的能力，和更 高的抑瘤率。其中3_(对甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酰胺的抑瘤率为30%， 甲基- β -环糊精配结后抑瘤率达到38%左右；3-(4-溴代苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸抑瘤率为45%，羟丙 基-Y-环糊精配结后的产物抑瘤率为55% ；3-硫吗啉基-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_甲酰胺的抑瘤率为45%，2_羟丙 基-β -环糊精配结后达到60 %。
权利要求
一类苊并杂环类化合物，其分子结构通式为其中(I)R1＝XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基，R2＝H，R3＝H，R4＝CN、COOH、COOR6或CONHR7；(II)R1＝H，R2＝XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基，R3＝H，R4＝CN、COOH、COOR6或CONHR7；(III)R1＝H，R2＝H，R3＝H、XR5、四氢吡喃 4 氧基、四氢噻喃 4 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫吗啉基，R4＝CN；(IV)R1＝XR5，R2＝H，R3＝XR5，R4＝CN；其中X＝O、S、羰基、酯基或酰胺；R5＝a、(CH2)nAr (o，m，p)Y，Y＝CH3、NO2、Ph、F、Cl、Br、CF3、OCH3、SCH3或NH2；n＝0～4；b、四氢吡喃基或四氢噻喃基；R6＝CH3或C2H5；R7＝CH3、C2H5或Ar。F2009102099612C00011.tif
2.权利要求1的苊并杂环类化合物的环糊精包合物，其特征在于由下述方法制备①称取一定质量的环糊精，加入水中，加热搅拌使其成为饱和溶液，所述的环糊精为 β -环糊精、Y “环糊精、2-羟丙基-β -环糊精、甲基-β -环糊精或羟丙基_ Y _环糊精；②称取待包合的苊并杂环类化合物，该化合物与环糊精的摩尔比为1 3 10;③将待包合的苊并杂环类化合物以5 lOmg/mL的浓度溶于丙酮，将所得溶液以线状 逐滴加入到环糊精的水溶液中，40 65°C，加热搅拌1 6天，有沉淀析出；④将上述溶液过滤，用少量蒸馏水洗涤滤饼，再用少量的丙酮洗去游离状态的化合物， 50 70°C真空干燥，24 48小时后得到权利要求1的苊并杂环类化合物的环糊精包合物。
3.权利要求1的苊并杂环类化合物的环糊精配结物，其特征在于由下述方法制备①称取干燥的环糊精及待配结的苊并杂环类化合物，环糊精与该化合物的摩尔比为 1 1.5 3 ；所述的环糊精为β-环糊精、γ-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环 糊精或羟丙基-Y-环糊精；②将待配结的苊并杂环类化合物与N，N'-羰基二咪唑以1 1 2的摩尔比混合后 溶解到DMSO中，使待配结的苊并杂环类化合物在DMSO溶液中的浓度为0. 2 0. 5mmol/mL, 常温搅拌30 60分钟；③往上述DMSO溶液中加入步骤①所称取的环糊精及0.1 0. 3mmol/mL的三乙醇胺， 常温反应18 24小时；④往步骤③的反应体系中加入0.50 1. Omg/mL的丙酮，减压析出沉淀；⑤过滤，沉淀经纯化得权利要求1的苊并杂环类化合物的环糊精配结物。
4.权利要求1的苊并杂环类化合物在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。
5.权利要求2的苊并杂环类化合物的环糊精包合物在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白 抑制剂中的应用。
6.权利要求3的苊并杂环类化合物的环糊精配结物在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白 抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一类苊并杂环类化合物，其环糊精包合物、配结物及其在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。该苊并杂环类化合物是在8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的3，4，6位引入多种氧代物和硫代物，羰基化合物，酯基化合物以及酰基化合物，或进一步将9-腈取代为酸，酯，酰胺基所得到的化合物。它模拟BH3-only蛋白，在体外和细胞内竞争性结合和拮抗Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡作用，其环糊精包合物和配结物能提高其作用，它们均可被用于制备抗癌化合物。
文档编号A61K31/541GK101928243SQ20091020996
公开日2010年12月29日 申请日期2009年10月25日 优先权日2008年11月11日
发明者吴桂叶, 宋婷, 张志超, 谢飞博 申请人:大连理工大学