专利名称：一种人工培植蛹虫草子实体提取物及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物原料中提取医用配置品的方法，具体涉及从一种人工培植 蛹虫草子实体提取物的提取制备工艺。
背景技术：
慢性肾小球肾炎(CGN)是多种原发性肾小球疾病所导致的一组病情迁延、病变缓 慢进展，最终发生渐进性慢性肾功能衰竭的一组免疫性炎症性临床综合征。患者多于2 3年或20 30年后出现肾功能衰竭的现象。CGN发病率较高，已成为影响人们健康的主要 疾病之一。目前，临床尚缺乏有效的CGN治疗方法和药物，中药在治疗CGN上的应用开创了 肾病治疗的新领域。特别是名贵中药冬虫夏草在治疗慢性肾炎上具有显著的疗效，但药用 冬虫夏草来源主要靠野生资源，由于其生长周期长，生长环境不断受到破坏，加上人为的采 集过量过早，资源锐减，难于满足市场需求。近年来北冬虫夏草(又称蛹虫草)作为冬虫夏 草的代替品，其规模生产技术已取得突破。从人工培养的北冬虫夏草产品中进行有效成分 的提取纯化逐步成为研究的热点。北冬虫夏草(Cordyc印s militaris)又称蛹虫草，简称北虫草，为子囊菌亚门 (Ascomycotina)禾斗(Clavicipitaceae)(Cordyceps)虫甫&胃禾中；^胃，夏草(Cordyc印s sinensis)的同属的近缘品种，也是虫草属的模式种ω。有望作为冬虫夏 草的替代品之一，北冬虫夏草具有与冬虫夏草相似的主要活性成分和医疗保健功效，大量 研究表明，其主要活性成分腺苷，虫草素等的含量高出冬虫夏草数倍[1°_13]。近年来北冬虫 夏草的规模生产技术已取得突破，已形成的北冬虫夏草产品主要有发酵菌丝体和米饭子实 体，从人工培养的北冬虫夏草产品中进行有效成分的提取纯化逐步成为研究的热点。目前 需要大量廉价人工培植蛹虫草子实体提取物以满足应用需求，但目前关于人工培植蛹虫草 子实体提取物的提制备工艺的针对性方法鲜有报道。
发明内容
本发明的任务是提供一种从人工培植蛹虫草子实体中提取的治疗慢性肾炎的药 物，使其具有治疗慢性肾炎的药物作用。同时，本发明还提供了人工培植蛹虫草子实体提取 物的制备工艺。实现本发明的技术方案是本发明提供的用于治疗慢性肾炎的药物，是按以下步骤制备的人工培植蛹虫草子 实体提取物步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得 原料粗粉；步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min,提取液过滤，浓缩至1/3量 即为总浸膏；步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70%，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶剂，得水提醇沉物；步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃 取液，用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取 液，减压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状人工培植蛹虫草子实体提取物，即本发明提 供的用于治疗慢性肾炎的药物。本发明提供的人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺，包括以下步骤步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得 原料粗粉；步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min,提取液过滤，浓缩至1/3量 即为总浸膏。同时制备70醇热回流提取物；步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70%，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收 溶剂，得水提醇沉物；步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃 取液。用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取 液，减压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状本发明人工培植蛹虫草子实体提取物。本发明实验资料一、本发明所用人工培植蛹虫草子实体品种的鉴定1、人工培植蛹虫草子实体用菌种的鉴定本发明人工培植蛹虫草子实体所用菌种由广东省东莞市生物技术研究所助理研 究员喻孟君先生自辽宁省鞍山市千山风景区采挖，经组织分离、孢子分离等得到生产用菌 种，经中国科学院微生物研究所O006)微检字第020号检测鉴定为蛹虫草[Cordyc印s militaris (L)Link]菌种，标本存于广东省东莞市生物技术研究所组织培养室，标本编号 20050818。人工培植蛹虫草子实体品种的鉴定人工培植蛹虫草子实体由广东省东莞市生物技术研究所培植，本项目研究用人工 培植蛹虫草子实体药材(批号200609 )，标本存放于华中科技大学同济药学院中药资 源室，经华中科技大学同济药学院中药系张长弓副教授鉴定为蛹虫草子实体[Cordyc印s militaris L. Link]。3、人工培植蛹虫草子实体的性状本项目研究用人工培植蛹虫草子实体成圆柱条状，粗0. 3 05cm，长2 6cm，为 鲜艳的橙黄色，上部稍膨大，质韧，气微腥，味微苦。4、人工培植蛹虫草子实体品质检测本项目研究用人工培植蛹虫草子实体水分按GB/5009. 3标准检测其含量 彡0.9%;重金属按GB/5009. 11、12、17标准检查，其汞(以Hg计)彡0.3mg/kg，铅(Wpb 计)彡 1. 5mg/kg，砷(以 As 计)彡 1. 5mg/Kg ；微生物按 GB4789. 2、3、4、5、10、11、15 标准检 查，其菌落总数，< lOOOcfu/g，大肠菌群< 40MPN/100g，肠道致病菌及致病性球菌未检出， 霉菌< 25cfu/g，酵母< 25cfu/g。均符合国家有关规定要求。二、本发明人工培植蛹虫草子实体提取物制备工艺的优化1、仪器与试剂
HITACHI L_2130 高效液相色谱仪(HPLC) ；HITACHI L-2400 紫外检测器；T2000P色 谱工作站；UV-750MC紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；SG5200HZ超声 波清洗仪(上海冠特超声仪器有限公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；分 析天平用MettlerAE160十万分之一天平；真空干燥箱(DZF-6021型)。腺苷对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110879-200202)，供含量测定 用；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水和去离子水；HPD100大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化 工有限公司)；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等均为分析纯。2、方法2. 1提取分离条件的确定2. 1. 1最佳条件参数的确定采用超声提取法，以HPLC法测定总提取物中腺苷的百分含量为评价指标，进行4 因素3水平(L9 (34))正交设计(见表1 幻优选提取最佳溶剂、最佳温度、最佳时间和最 佳料液比，以确定人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎总提取物制备的最佳条件参数。2. 1. 2人工培植蛹虫草子实体治疗慢性肾炎有效部位分离条件的确定应用传统的溶剂分配分离技术，以人工培植蛹虫草子实体总提取物中腺苷转移含 量为评价指标，单因素考察萃取溶剂正丁醇在等体积用量时萃取次数对萃取效果的影响， 每次均以等倍量正丁醇对蛹虫草子实体总提物进行萃取。从第五次开始，每次萃取液于旋 转蒸发仪上蒸干，加甲醇IOmL溶解，吸取10 μ L注入高效液相仪，以腺苷峰的含量作为指 标，结果表明第9次萃取液中已不含腺苷峰。而萃取6次就可使萃取率达到95%以上，确定 了自人工培植蛹虫草子实体总提取物分离治疗慢性肾炎有效部位的最佳条件。表1因素水平表因素水平温度(°c)溶剂时间(min)料液比(倍)1 25水15102 5040%乙醇30203 7580%乙醇4530表2直观分析表5因素溶剂用量(倍)提取时间(min)温度(°c)腺苷(％)111110.532212220.203313330.159421230.651522310.282623120.084731320.462832130.243933210.097均值10.2980.5480.2860.304均值20.3390.2430.3170.250均值30.2670.1130.3010.351极差0.0720.4350.0310.101 表3方差分析表因素偏差平方和自由度F比显著性温度(。c)0.00828.000溶剂0.2992299.000P<0.05时间(min)0.00121.000料液比(倍)0.015215.000P<0.10 实验结果分析经方差分析，溶剂及用量对腺苷提取含量有显著影响，提取温度和 提取时间无显著影响；由极差分析可得，对腺苷提取有影响的因素顺序为B > D > A > C ； 由直观分析得腺苷最佳提取条件为30倍量水，50°C提取30min。由于提取温度对提取率无 显著影响，从节约成本操作简便性方面考虑将提取温度定为室温。
2. 2色谱条件与系统适应性试验2.2. 1流动相的选择以提取物中主要成分各色谱峰的分离度，对称度和主要色谱峰的理论塔板数为评 价指标，通过选择不同品牌的Cw反向柱，不同的流动相系统及调节各流动相系统中溶剂的 比例，最终确定了使用anglient Cw反向柱，以15%甲醇为流动相。柱温对色谱峰的出峰 时间和分离度有较大影响，故控制柱温在25°C。2. 2. 2测定波长的选择用UV-750MC紫外可见分光光度计在波长200歷-400歷紫外区段进行光谱全扫描， 结果人工培植蛹虫草子实体总提取液在260nm处有最大吸收，故选择^Onm作为检测波长。2. 2. 3色谱条件色谱柱AngilentTC-C18OSOmmXiemm, 5μπι)，流动相甲醇-水(15 85)流 速lml/min，检测波长260nm，进样量=IOyL,柱温25°C。在选定条件下各主要特征峰与 相邻组分色谱峰的分离度均大于1. 5，按腺苷峰计算，理论塔板数在10000以上，对称度小 于 1. 15。2. 2. 4总提取物供试品溶液的制备称取干燥的人工培植蛹虫草子实体粉末药材适量，精密称定，置具塞的锥形烧瓶 中，精密加入适量溶剂，称重。超声提取后，静置，擦干锥形瓶外侧水分，称重，用相应溶剂 补足减失重量，加一定量甲醇沉淀多糖，静置，待沉淀完全，过滤，吸取20mL，甲醇定容至 50mL,用0. 45 μ m微孔滤膜滤过，作为人工培植蛹虫草子实体总提物供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μ 1，在上述色谱条件下进样分析，按下式以外标法计算总 提取物中腺苷的百分含量。
权利要求
1.一种用于治疗慢性肾炎的药物，其特征在于，它是按以下步骤制备的人工培植蛹虫 草子实体提取物步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料 粗粉。步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为总浸膏。步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70%，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶 剂，得水提醇沉物。步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃取液。 用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取液，减 压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状人工培植蛹虫草子实体提取物。
2.—种人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺，其特征在于包括以下步骤 步骤一、以当年生人工培植蛹虫草子实体为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉。步骤二、将原料粗粉用30倍量水超声提取1次，30min，提取液过滤，浓缩至1/3量即为 总浸膏。同时制备70醇热回流提取物。步骤三、将总浸膏加入乙醇至体系含醇70%，充分搅拌，静置过夜，取上清液，回收溶 剂，得水提醇沉物。步骤四、取醇沉物，以水分散，用与水等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯萃取液。 用与保留的水分散液相等体积水饱和正丁醇对保留的水分散液萃取6次，合并萃取液，减 压回收溶剂，真空干燥，得淡黄色粉末状本发明人工培植蛹虫草子实体提取物。
3.依据权利要求2所述人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺制备的人工培植蛹 虫草子实体提取物在制备用于治疗慢性肾炎药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种从人工培植蛹虫草子实体中提取的治疗慢性肾炎的药物，同时，本发明还提供了该人工培植蛹虫草子实体提取物的制备工艺，本发明将人工培植蛹虫草子实体干燥粉碎后，依次进行总提取物的制备，化学成分部位的制备和正丁醇部位的大孔树脂纯化，得到纯化合物。研究证实本发明人工培植蛹虫草子实体提取物具有增强免疫力功能作用，能作为治疗慢性肾炎的药物用于治疗慢性肾炎。由于本发明采用了合理的优化工艺，实现了提取人工培植蛹虫草子实体正丁醇部位的最优化条件。
文档编号A61K36/068GK102048770SQ200910272660
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月6日 优先权日2009年11月6日
发明者阮金兰 申请人:华中科技大学