用基质细胞增强对中枢神经系统损伤的治疗的组合物和方法

专利名称：用基质细胞增强对中枢神经系统损伤的治疗的组合物和方法
技术领域：
本发明的领域一般涉及对损伤的中枢神经系统的治疗。更具体地，本发明涉及 通过施用基质细胞和血脑屏障渗透剂治疗损伤的中枢神经系统。相关技术描述大部分中枢神经系统(CNS)损伤由中风(stroke)、创伤性脑损伤(traumaticbrain injury) > 脊髓损伤(spinal cord injury)、低氧-局部缺血(hypoxia—ischemia)、癫痫发作 (seizure) >感染和中毒引起，所有这些可以直接或间接地引起对CNS的血液供应中断。 这些损伤通常导致局部缺血、不可逆的脑和/或脊髓损害、损伤的CNS组织的细胞程序 性死亡，并且在某些情形中，导致损伤个体的死亡。中风是发达国家中第三大主要的死亡原因。中风是主要的成年性残疾(adult disability)的主要因素之一，并且在世界范围内影响大约四千万人。引起中风的脑血管结 构改变的性质包括在脑血管中形成的血液凝块(血栓)、动脉粥样斑或其它由另一个位置 通向脑的物质的血液凝块或血块(栓子)、和血管出血。因此，中风可以由因为脑血管出 血或凝结引起的减少的血流而引起，由此导致不足的血液供应、局部缺血、和/或损伤 组织的梗死。出血性中风，也已知为脑内出血(intracerebral hemorrhage) (ICH)，引起 10%-15%的中风，第三天的死亡率为35%-52% ；半数死亡发生在前两天内(Broderick JP, Brott T, Tomsick T, Miller R, Huster G.JNeurosurgery (神经外科杂志).1993 ； 78 188-191 ； Anderson CS, Chakera TM, Stewart-Wynne EG, Jamrozik KD.J Neurol Neurosurg Psychiatry (神经学、神经外科和精神病学杂志).1994 ； 57: 936-940 ； Counsell C，Boonyakarnkul S，Dennis Μ, Sandercock P, Bamford J，Cerebrovasc Dis.(脑血管疾 病)1995 ； 5 26-3.)。在美国2002年中估计的67,000名患有ICH的患者中，预计仅有 20%在损伤后 6 个月能够功能自立(Counsell C，Boonyakarnkul S, Dennis M，Sandercock P, Bamford J, Cerebrovasc Dis.(脑血管疾病)1995 ； 5 26-3.)。大量急性出血(substantial ongoing bleeding)发生在ICH患者中，特别是在发作后
的前3-4小时内，其与这些患者中的神经退化相关。此外，一个研究表明中风患者通常 在中风后3-6小时才能恰当地受到医学注意(Evenson等，2001 Neuroepidemiology(神经 流行病学)，20(2) 65-76)。通常，急性中风治疗必须在损伤后的前几个小时内实施才 能有效，并且其在损伤的CNS组织中不提供任何神经恢复性作用。因此，如果有效的中 风治疗的时间机会(time window)可以延长超过目前可用于急性神经保护性中风治疗的时
6间机会(即，可能数天或数周，而不是中风后的几分钟或几小时)，则可能存在治疗大部 分(即使不是全部)中风患者的机会。这样的治疗还将在这些患者中增强神经复原和功 能性神经恢复。考虑到这些观察，目前对于寻找可以在超过局部缺血的过急性期外有效 的新的细胞和药理学治疗途径存在迫切的需要。在设计为增强受损脑的结构和功能组织 重构(reOTganization)(即，可塑性)的中风后恢复性治疗中，增强脑关于神经塑形和随后 的神经恢复的固有特性很重要。已经表明，来自胚胎组织的供体干细胞的脑内移植分化成神经细胞(Snyder等，
1997Adv Neurol.(神经学进展) 2 121-32)。纹状体内胚胎移植(intrastriatal fetal grafts) 已经在哺乳动物局部缺血模型中用来重构受损的基底神经节回路和改善行为缺陷(Goto 等，1997 Exp Neurol.(神经学实验)147 503-9)。植入到成年有机体内的胚胎造血干细 胞(HSCs)或植入到胚胎中的成年HSCs形成嵌合体(chimera)，所述嵌合体反映在接种了 所述细胞的微环境内的内源性细胞(Geiger等，1998，Immunol Today (现代免疫学)19 236-41)。另一组发现，成人CNS中携有多能干细胞，并且成人脑可以形成新的神经元 (Gage, 1998 Curr.Opin.Neurobiol.(当代神经学观点)8 671-6 ； Kempermann 和 Gage,
1998NatMed.(自然医学)4 555-7)。神经干细胞由于其在体外和体内分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞 的能力成为治疗中风和其它CNS疾病的重要细胞治疗候选物。干细胞有力的全能潜力通 常可以使得能够有效地治疗伴有复杂的神经回路破坏的疾病或损伤，如中风，其中影响 多于一种的细胞群体。实际上，近年来，大量的精力集中在未分化的多能干细胞改善实 验性神经病症(包括缺血性中风、脑外伤、和脊髓损伤)的能力上(Chopp等，2000; Li 等，2000;和Mahmood等，2003)。特别地，在ICH胶原酶模型中已经使用人胚胎神经 干细胞来恢复神经功能，并且表现出细胞向出血部位的迁移。然而，在提高或增强神经 复原、功能性神经恢复、和治疗性细胞植入方面，目前可用的医学治疗无一表现出一致 的或明确的益处。基于细胞的治疗的另一种潜在的途径是人脐带血细胞(HUCB)，其具有相对 高百分比的造血干细胞，并且已经在动物模型中用来治疗缺血性中风。一些组已经证 明，HUCB细胞存活并且迁移到正常和患病动物的CNS中，并且已经表明在缺血性中 风、脊髓损伤、和脑内出血的动物模型中促进功能恢复(Chen等，2001 Stroke(中风)， 32(11) 2682-8 ； Lu 等，2002 CellTransplant(细胞移植)，11(3) 275-81 ； Saporta 等，2003 J.Hematotherapy&Stem Cell Research (血液治疗和干细胞研究杂志)，12 271-278)。尽管HUCB细胞已经用来治疗缺血性中风、脊髓损伤、和脑内出血，但是关 于HUCB治疗的长期功效及其在中枢神经系统中植入和促进神经复原的潜能仍然存在怀 疑。骨髓基质细胞(BMSCs)还已知为间充质干细胞(MSCs)，具有用于细胞治疗的 潜能(Pereira 等，1995 ； Pereira 等，1998 ； Pittenger 等，1999 ；和 Prockop 等，2003)。 BMSCs在多种非血液组织中具有自我更新和分化的能力。已经使用不同的动物损伤模 型报道了 BMSCs用于修复和重塑损伤的脑组织的潜在应用(Chopp等，2000; Mahmood 等，2003; Li 等，2001; Kopen 等，1999; Li 等，2002;和 Li 等，2000)。BMSC 治疗 在脑中诱导神经复原性变化，这反映了一些作用机制。
在先前的神经损伤模型中，已表明BMSCs通过血脑屏障进入脑损伤的靶点部位 (Li等，2001; Mahmood等，2003;和Zhang等，2002)。在新生小鼠中，BMSCs在发育 的脑中四处广泛迁移，并且已经表现出分化成神经元和星形胶质细胞的能力(Kopen等， 1999)。全身性输注到大鼠中的BMSCs优先迁移到缺血皮层中(Eglitis等，1999)。在最近的研究中，人BMSCs已经在缺血性中风和闭锁性头部外伤(closed head injury)动物模型中表现出显著的益处(Li等，2002和Mahmood等，2003)。在这些神经损 害模型中，BMSCs似乎具有诱导内源性脑源性细胞如来自脑室下区(subventricularzone) 的神经干细胞参与复原过程的能力。然而，BMSCs定位在脑损伤区并且增加局部生长因 子浓度的能力也可以是极为重要的，所述生长因子如神经生长因子、神经胶质来源的神 经生长因子、脑源性神经生长因子和血管内皮生长因子(Villars等，2000; Li等，2002; 和Lu等，2004)。这些生长因子支持并且增强血管生成、神经生成、神经元迁移、和突 触可塑性(Carmeliet等，2002和Jin等，2002)。因此，BMSCs似乎表现为小的生化和 分子工厂与催化剂，在实质细胞内生产并诱导多种增强缺血边界处的血管生成和血管稳 定的细胞因子和营养因子(Chen等，2003)。然而，本领域未能提供提高BMSC治疗形 式的功效的方法。一些组已经研究了多种BMSC浓度和施用途径，以表明BMSC神经损伤治疗的 疗效。使用大鼠MCA闭塞模型的研究表明静脉内施用的一百万hBMSCs在动物恢复中 没有表现出明显益处，而动脉内注射的两百万hBMSCs改善了神经功能(Chen等，2003 和Li等，2001)。先前在实验性创伤性脑损伤模型(TBI)中使用动脉内细胞治疗的工作 提供了直接的施用途径，但是由于治疗细胞本身引起的小血管脑血管血栓症导致了增加 的脑局部缺血(Lu等，2001)。与关于缺血性中风和TBI治疗相比，MSCs用于治疗实验性ICH的应用研究得不 透彻。通过颈动脉递送的四剂两百万间充质干细胞用于治疗胶原酶诱导的ICH在大鼠中 改善了运动功能(Ueda等，1998)。在另一个ICH损伤模型中，一组表明BMSCs定位在 ICH周围(例如，损伤部位)，并且在静脉内(IV)施用300-800万BMSCs后存在活跃的 神经复原和神经再生特征(Seyfried等，2006)。这一研究表明补充到损伤部位的hBMSCs 数目在静脉内输注300-800万BMSCs后达到稳定状态(Seyffied等，2006)。因此，在本 领域中使用较少的BMSCs有效的单次治疗是合乎需要的，因为递送多次施用和/或大量 的BMSCs带来在已经损伤的脑部微血管中引起另外的脑血管闭塞的严重危险。尽管施用BMSCs在受损的CNS中导致功能神经改善，但是这些改善仅是部分 的，在使用BMSCs进行ICH和哺乳动物CNS损伤治疗的功效方面留下巨大的提高空间。 因此，在本领域中对于改善用于治疗CNS损伤的基于细胞的治疗的方法和组合物存在迫 切的需要，以便增强神经复原、功能神经恢复、和治疗性细胞的植入。发明简述本发明提供向具有中枢神经系统损伤的哺乳动物施用包括基于细胞的治疗剂和 血脑屏障渗透剂的治疗组合物。在一个实施方案中，本发明提供在具有中枢神经系统(CNS)损伤的哺乳动物的 损伤中枢神经系统组织中增强神经复原的方法，所述方法包括向所述哺乳动物肠胃外施 用有效量的基质细胞和血脑屏障(BBB)渗透剂。在相关实施方案中，所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基质细胞、脂肪组织来源的基质细胞、肝基质细胞、和脐带 胶质基质细胞。在某些实施方案中，所述基质细胞是骨髓基质细胞。在相关实施方案中，所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基甘油、 RMP-7和甘露醇。在具体的实施方案中，所述BBB渗透剂是甘露醇。在进一步相关的实施方案中，所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施 用。在其它相关实施方案中，所述基质细胞通过动脉内施用，并且所述BBB渗透剂通过 静脉内施用。在具体的相关实施方案中，所述BBB渗透剂在所述基质细胞施用之前或大 约与之同时施用。在其它相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后施 用。在具体的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后大于1，2， 4，8，或12小时施用。在进一步相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神 经系统损伤后约12小时至约1个月施用。在某些实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂 在中枢神经系统损伤后约12小时至约1周施用。在相关实施方案中，基质细胞和BBB 渗透剂在中枢神经系统损伤后约12小时至约48小时施用。在某些相关的实施方案中，所述哺乳动物是人。在其它相关的实施方案中，所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的 组中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、低氧-局部缺血、癫痫发作、感染和中毒。在 其它相关的实施方案中，所述中枢神经系统损伤是缺血性或出血性中风。在进一步 相关的实施方案中，所述中枢神经系统损伤由选自由下列各项组成的组的中枢神经 系统疾病、病症或症状引起泰-萨病(Tay-Sachs disease)，桑霍夫病(Sandhoff' s disease)，胡尔勒综合征(Hurler ‘ s syndrome)，克拉贝病(Krabbe ‘ s disease)，中白 金森病(Parkinson ‘ sdisease)，阿尔茨海默病(Alzheimer ‘ s disease)，肌萎缩性侧 索硬化(amyotropic lateral sclerosis) (ALS)，亨廷顿舞蹈病(Huntington ‘ s disease)， 癫痫(epilepsy)，多发性硬化症(multiple sclerosis)，脊肌肉萎缩(spinal muscle atrophy) (SMA)，弗里德赖希共济失调(Friedreich ‘ s ataxia)，唐氏综合征(Down ‘ s Syndrome),韦尼克-科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoff syndrome)，和克罗伊茨费 尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)。在某些实施方案中，与没有施用基质细胞和BBB渗透剂的哺乳动物中同样损伤 的中枢神经系统组织相比较，在施用基质细胞和BBB渗透剂后，损伤的中枢神经系统 组织具有增加的突触小泡蛋白、神经元III类β-微管蛋白(neuronal class III β -tubulin) (TUJl)、和双皮层蛋白(DCXl)的表达。在另一个实施方案中，本发明提供用于增强具有中枢神经系统损伤的哺乳动物 的认知和/或运动功能神经恢复的方法，所述方法包括向所述哺乳动物肠胃外施用基质 细胞和血脑屏障(BBB)渗透剂。在相关实施方案中，与没有施用基质细胞和BBB渗透剂 的同样损伤的哺乳动物的认知和/或运动功能神经恢复相比较，在施用基质细胞和BBB 渗透剂后，所述哺乳动物的认知和/或运动功能神经恢复更强。在进一步相关的实施方案中，所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基 质细胞、脂肪组织来源的基质细胞、肝基质细胞、和脐带胶质基质细胞。在其它相关的实施方案中，所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基甘油、RMP-7和甘露醇。在某些相关的实施方案中，所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施用。 在相关实施方案中，基质细胞通过动脉内施用，并且BBB渗透剂通过静脉内施用。在进一步相关的实施方案中，BBB渗透剂在基质细胞施用之前或大约与之同时 施用。在其它相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后大于12 小时施用。在某些实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后约12小 时至约1个月施用。在具体的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约12小时至约1周施用。在更具体的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神 经系统损伤后约12小时至约48小时施用。在相关的实施方案中，所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的组中 风、创伤性脑损伤、和脊髓损伤。在进一步相关的实施方案中，所述中枢神经系统损伤 是缺血性或出血性中风。在另一个实施方案中，本发明提供用于增强在具有中枢神经系统损伤的哺乳动 物的损伤的中枢神经系统组织中植入基质细胞的方法，所述方法包括向所述哺乳动物肠 胃外施用有效量的基质细胞和BBB渗透剂。在相关实施方案中，与没有施用基质细胞和 BBB渗透剂的哺乳动物中同样损伤的中枢神经系统组织中植入的基质细胞的量相比较， 在施用基质细胞和BBB渗透剂之后，植入损伤的中枢神经系统组织中的基质细胞的量更 大。在某些相关的实施方案中，所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基质 细胞、脂肪组织来源的基质细胞、肝基质细胞、和脐带胶质基质细胞。在进一步相关的实施方案中，所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基 甘油、RMP-7和甘露醇。在其它相关的实施方案中，所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施用。 在相关实施方案中，基质细胞通过动脉内施用，并且BBB渗透剂通过静脉内施用。在进一步相关的实施方案中，BBB渗透剂在基质细胞施用之前或大约与之同时 施用。在具体的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后大于12小 时施用。在相关实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后约12小时 至约1个月施用。在进一步相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统 损伤后约12小时至约1周施用。在进一步相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂 在中枢神经系统损伤后约12小时至约48小时施用。在相关实施方案中，所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的组中风、 创伤性脑损伤、脊髓损伤、低氧-局部缺血、癫痫发作、感染和中毒。在特别相关的实 施方案中，所述中枢神经系统损伤是缺血性或出血性中风。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗具有中枢神经系统损伤的哺乳动物 的损伤的中枢神经系统组织的方法，所述方法包括肠胃外施用有效量的基质细胞和血脑 屏障渗透剂。在某些实施方案中，所述基质细胞已被遗传修饰过。在相关实施方案中，所述 基质细胞已被遗传修饰过，从而增加选自由下列各项组成的组的生长因子的表达神经 生长因子、神经胶质来源的神经营养因子、睫状神经营养因子、脑源性生长因子、血小
10板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。在具体的实施方案中， 所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基质细胞、脂肪组织来源的基质细胞、肝 基质细胞、和脐带胶质基质细胞。在进一步相关的实施方案中，所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基 甘油、RMP-7和甘露醇。在其它相关的实施方案中，所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施用。在特别相关的实施方案中，血脑屏障渗透剂在基质细胞施用之前或大约与之同 时施用。在相关实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后大于12小 时施用。在进一步相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后约 12小时至约1个月施用。在其它相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经 系统损伤后约12小时至约1周施用。在其它相关的实施方案中，基质细胞和BBB渗透 剂在中枢神经系统损伤后约12小时至约48小时施用。在某些相关的实施方案中，所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的组 中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、低氧-局部缺血、癫痫发作、感染和中毒。在具体 的实施方案中，所述中枢神经系统损伤是缺血性或出血性中风。在其它相关的实施方案 中，所述中枢神经系统损伤由选自由下列各项组成的组的中枢神经系统疾病、病症或症 状引起泰-萨病，桑霍夫病，胡尔勒综合征，克拉贝病，帕金森病，阿尔茨海默病， 肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿舞蹈病，癫痫，多发性硬化症，脊肌肉萎缩(SMA)， 弗里德赖希共济失调(Friedreich' s ataxia),唐氏综合征，韦尼克-科尔萨科夫综合征， 和克罗伊茨费尔特_雅各布病。在另一个实施方案中，本发明的方法提供一种组合物，所述组合物包括有效量 的基质细胞和BBB渗透剂。在相关实施方案中，所述基质细胞已被遗传修饰过。在进 一步相关的实施方案中，所述基质细胞已被遗传修饰过，从而增加选自由组的生长因子 的表达，所述组选自下列各项神经生长因子、神经胶质来源的神经营养因子、睫状神 经营养因子、脑源性生长因子、血小板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子和血管内 皮生长因子。附图的数幅图的简述

图1提供功能性神经检测的结果。描述了 4组(对照，人原代成纤维细胞(FB)； 甘露醇(MT)；人骨髓基质细胞ChBMSC)；联合治疗，hBMSC+MT)的神经严重性评分 (NSS)(右图)和转角拐测试(corner turn test) (CTT)(左图)的定量柱状图。图2提供相对于对侧正常区域，4组(对照，人原代成纤维细胞(FB)；甘露醇 (MT)；人骨髓基质细胞ChBMSC)；联合治疗，hBMSC+MT)的ICH区域中定量纹状体 组织损失百分数的柱状图。统计学显著性水平为> < 0.05。图3提供对照和联合治疗的大鼠纹状体切片的mAb 1281、BrdU、突触小泡蛋 白、TUJl和DCX的代表性免疫染色和定量免疫反应性。对于所有治疗组的定量免疫反 应性显示为每幅图右侧的柱状图。在底部图中显示了 BrdU和TUJl共定位在联合组的损 伤区域附近的细胞亚群中。箭头指示关于BrdU和TUJl 二者阳性染色的细胞。发明详述A.治疗和预防神经损伤的方法
技术领域：
本发明部分基于向损伤的哺乳动物中枢神经系统(CNS)施用治疗性组合物。当 用于本文时，术语“中枢神经系统”或“CNS”应该解释为包括哺乳动物的脑和脊髓。 该术语还包括嗅觉和optic cranial神经。CNS的组织包括，但不限于，脑、脊髓、视神经 的组织，上述组织的单个区域，和包括所述组织和区域的神经元和非神经元细胞。本发明的方法和组合物允许在损伤后的延长时间机会过程中有效施用给具有损 伤的CNS的患者的基于细胞的治疗性组合物。因此，本发明的方法提供有效治疗比先前 认为是可能的还要多的患者人数的机会。此外，本发明提供减少与基于细胞的治疗剂的 动脉内递送相关的脑血管闭塞的危险的方法和组合物，其通过联合施用渗透血脑屏障的 药剂和基于细胞的治疗剂进行。根据本发明，提高基于细胞的治疗剂在损伤的中枢神经系统中的安全性和功效 主要由细胞治疗剂渗透血脑屏障和进入损伤的CNS组织的能力确定。先前的研究表明 补充到损伤的中枢神经系统部位的hBMSCs数量在静脉内输注300-800万hBMSCs后 到达稳定水平，这表明血脑屏障可能是hBMSCs达到损伤部位的限速步骤之一(Seyfried 等，2006)。血脑屏障是一种由连续的内皮细胞层组成的复杂的血管结构，所述内皮细 胞之间保持紧密的连接。血脑屏障的特性表明在血液和脑之间已经发展了高度选择性交 换系统，从而在正常生理状态下提供脑的自我平衡环境。这种受控的环境可以通过增加 生理条件下如高血压下的渗透性或通过物理损坏病态条件下如外伤、缺血、肿瘤和过敏 或炎性疾病下存在的内皮膜而改变。另外，血脑屏障渗透性的增加可以通过释放化学 调控剂如缓激肽(bradykinins)、5-羟色胺(serotonin)、组胺(histamines)、花生四烯酸 (arachidonic acid)、白三烯(Ieukotrienes)禾口自由基而引起。当用于增加药物向脑实质的递送时，使用增加BBB渗透性的化学调控剂可以 是有利的。在实验和临床应用中，发现合成的九肽和缓激肽类似物Cereport(先前称为 RMP-7)选择性增加药物向脑肿瘤的递送，和在豚鼠中增加更昔洛韦(ganciclovir)的血眼 屏障渗透性。当通过静脉内或颈动脉内途径施用时，Cereport通过刺激脑内皮上的日2亚 组受体而选择性开放血脑屏障。这种刺激导致游离的细胞内Ca2+的快速、瞬时增加，其 又引起内皮孔尺寸的增加。由于β 2受体刺激的快速抗药反应或脱敏作用，这种作用是 暂时的( 20分钟)。另一种可以提高血脑屏障渗透性和可能在基于细胞的神经损伤治疗中提供潜在 的改善途径的化合物是甘露醇。例如，甘露醇是一种糖醇和渗透物，其已经用于预防或 治疗由体液/水的增加引起的医学病症(Winkler和Munoz-Ruiz，1995)。作为联合治 疗，甘露醇已被经常用于减少与大量脑损伤相关的水肿或颅内压(Schwarz等，1998与 McGraw和Howard，1983)。甘露醇还已被用于通过暂时收缩形成屏障的紧密偶联的内皮 细胞而开放血脑屏障，因此允许药物直接递送至脑(Kroll和Neuwelt，1998)。另一种提议的甘露醇对脑血管作用的机制是增加的内皮渗透性和小血管扩张 (Machi等，1996)。甘露醇可以改善脑血流的流变性，因为其降低粘度并且允许更好的 毛细流动(Burke等，1981)。甘露醇可以防止细胞肿胀并且减轻损伤部位周围的后发性 细胞损害(Tnmum-Jensen等，1981)。尽管这仍然有些争议，已经报道用高剂量的甘露 醇来治疗急性创伤性脑损伤并且降低升高的颅内压(Craz等，2001和Tnmum-Jensen等， 1981)。
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因此，一种可能性是甘露醇可以提高组织对损伤后急性压力的耐受性，并且甘 露醇可以救助损伤部位周围更多的存活细胞(Lizasoain等，2006)。以这种方式，甘露醇 可以减弱中风打击，并且因此延长损伤组织的存活时间机会(Chen，等2008)。然而，很 少研究诸如甘露醇的药剂作为ICH治疗、或作为用于损伤的CNS组织的基于细胞的治疗 的辅助形式的应用。因此，在多个实施方案中，本发明提供向具有损伤的CNS的哺乳动物肠胃外施 用基质细胞和血脑屏障渗透剂，用以增强神经复原和功能性神经恢复，增强BMSCs植入 到损伤的CNS中，减少与CNS损伤相关的组织损失，并且激活损伤的CNS中更多的内 源性细胞以增加突触形成、不成熟神经元的形成和神经元迁移。在具体的实施方案中，基质细胞选自由下列各项组成的组BMSCs，脂肪组织 来源的基质细胞(ADSCs)；肝基质细胞(LSCs)；和脐带胶质基质细胞。在多个实施方案中，血脑屏障渗透剂选自由下列各项组成的组甘露醇、 RMP-7、和其他适当的烷基甘油。在具体的实施方案中，血脑屏障渗透剂可以在单独或同一组合物中与基质细胞 大约同时或在其之前施用。在具体的实施方案中，本发明的组合物在CNS损伤后施用给 个体。在具体的实施方案中，本发明的组合物在CNS损伤发作后至少1小时、至少2小 时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至 少9小时、至少10小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少 1周、至少2周、至少3周、和至少1个月施用给具有损伤的CNS的个体。在某些实施 方案中，基质细胞和血脑屏障渗透剂都在CNS损伤发作后约1周-1个月、约12小时-1 个月、约12小时-2周、约12小时-1周、约12小时-72小时、约12小时-48小时、或 约12小时-24小时施用。本发明的方法包括通过肠胃外(即，静脉内和动脉内以及其他适当的肠胃外途 径)、鞘内、心室内、实质内(包括进入脊髓、脑干或运动皮层)、池内、颅内、纹状体 内、或黑质内(intnmigral)施用与血脑屏障渗透剂联合的基质细胞。在具体的实施方案中，基质细胞和血脑屏障渗透剂二者的施用可以通过静脉内 或动脉内途径进行。在具体的实施方案中，基质细胞通过与血脑屏障渗透剂不同的途径 施用。在某些实施方案中，血脑屏障渗透剂通过静脉内施用并且在动脉内施用有效量的 基质细胞之前、同时或之后施用给具有损伤的CNS的个体。在其他实施方案中，血脑屏 障渗透剂通过动脉内施用并且在动脉内施用基质细胞之前、同时或之后施用给具有损伤 的CNS的个体。在其它相关的实施方案中，血脑屏障渗透剂通过静脉内施用并且在静脉 内施用基质细胞之前、同时或之后施用给具有损伤的CNS的个体。在其他实施方案中， 血脑屏障渗透剂通过动脉内施用并且在静脉内施用基质细胞之前、同时或之后施用给具 有损伤的CNS的个体。在多个实施方案中，以包括施用血脑屏障渗透剂的方法施用的基质细胞与在不 施用血脑屏障渗透剂的条件下对同样损伤的CNS施用的基质细胞的量相同或比其少， 以获得相同的治疗益处。在具体的实施方案中，与血脑屏障渗透剂联合施用的有效量 的基质细胞的数目少于IxlO12个细胞/100kg，少于IxlO11个细胞/100kg，少于IxIOki 个细胞/100kg，少于IxlO9个细胞/100kg，少于IxlO8个细胞/100kg，少于IxlO7个细胞/100kg，少于5xl06个细胞/100kg，少于4xl06个细胞/100kg，少于3xl06个细 胞/100kg，少于2xl06个细胞/100kg，少于IxlO6个细胞/100kg，少于5xl05个细 胞/100kg，少于4xl05个细胞/100kg，少于3xl05个细胞/100kg，少于&105个细胞 / 100kg,少于IxlO5个细胞/100kg，少于5xl04个细胞/100kg，或少于IxlO4个细胞 /100kg。在多个实施方案中，本发明的方法和组合物增强损伤的哺乳动物CNS或CNS组 织中的神经复原。当用于本文时，术语“神经复原”或“有神经复原作用的”描述包括 突触塑性(例如，突触形成)、不成熟神经细胞的形成(例如，神经形成)、血管形成、 神经元迁移、以及白质和轴突重建的事件，所有这些可以有助于损伤CNS的功能性神经 改善。不希望受到任何具体理论的束缚，应该理解损伤的中枢神经系统组织以多种方式 重演个体发育(Cramer等，2000和Goldman等，1996)。例如，在中风和其它中枢神经 系统损伤后，中枢组织回复到更早期发育阶段，并因此变得高度响应细胞因子、营养因 子和生长因子的刺激。在某些实施方案中，增强的细胞复原部分通过本发明的方法实现，其通过施用 本发明的基于细胞的治疗性组合物而诱导损伤的CNS的内源性细胞内的生长因子(诸如 脑源性神经生长因子(NGF)，神经胶质来源的神经营养因子(GDNF)，睫状神经营养因 子(CTNF)，脑源性生长因子(BDNF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，成纤维细胞生 长因子(FGF)，和血管内皮生长因子(VEGF))和其它细胞因子的表达而进行。因此，在 某些实施方案中，相对于未治疗的或对照治疗的未损伤的或损伤的CNS，“增强神经复 原”与由于施用基于细胞的治疗剂如基质细胞和血脑屏障渗透剂而增加损伤的CNS中进 行突触形成、神经形成、血管形成和/或神经元迁移的细胞速率或数量相关。在具体的实施方案中，与没有施用基质细胞和血脑屏障渗透剂的个体中同样损 伤的中枢神经系统组织相比较，在哺乳动物损伤的中枢神经系统组织中增强的神经复原 表现为增加的突触小泡蛋白、神经元III类β-微管蛋白(TUJ1)、和双皮层蛋白(DCXl) 的表达。熟练的技术人员应该理解，神经复原的指示包括增加的基因表达，特别是如增 加的突触小泡蛋白、神经元III类β-微管蛋白(TUJl)、和双皮层蛋白(DCX)的表达。突 触小泡蛋白表达是突触形成的指示；TUJl在未成熟的神经元和神经元前体细胞中表达； DCX在迁移的神经元中表达。术语“未成熟的神经元”和“神经元前体细胞”在本发明的多个方面中通常 可以互换使用。未成熟的神经元可以进一步通过一种或多种神经/神经元表型标记的表 达而检测，所述神经/神经元表型标记特别诸如Musashi-Ι，巢蛋白(Nestin)，NeuN, III类β-微管蛋白，GFAP，NF-L, NF-M,微管相关蛋白(ΜΑΡ2)，S100, CNP酶 (CNPase),磷脂酰肌醇聚糖(glypican)(尤其是磷脂酰肌醇聚糖4)，神经元五聚环蛋白 IKneuronalpentraxin II),神经元PAS 1，神经元生长相关蛋白43，神经突增生延伸蛋白 (neurite outgrowth extension protein),波形蛋白(vimentin), Hu,丝联蛋白(internexin), 04，髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein)和多营养因子(pleiotrophin)。 当然，本领域普 通技术人员能够认识到存在多种其它通常用于检测突触形成、神经形成、和神经元迁移 的“标记”，其中每一种都适用于确定神经复原。神经复原是一种内源性反应，其通常响应损伤发生在CNS中。例如，在成年人脑中风后，以增加的TUJl表达为标志的成神经细胞群体大量散布到脑室下区(SVZ)，并 且这些细胞补充到梗死边界区域，在那里它们可以分化为神经元，并且由此替换损失的 神经元(Parent 等，Ann Neurol (神经学年刊)2002 ； 52: 802-813 ； Arvidsson 等，Nature Medicine (自然医学)2002 ； 8 963-970)。神经元细胞迁移的增加表现为增加的DCX表
达。另外，成神经细胞可以与微血管协同作用，从而刺激局部微环境中的血管形成(以 增加的VEGF表达为标志)和突触形成(以增加的突触小泡蛋白和生长相关蛋白43表达 为标志)，并且由此促进神经复原和功能性神经恢复。在其它多种实施方案中，本发明提供用于增强具有损伤的CNS的哺乳动物的认 知和/或运动功能神经恢复的方法。预计中枢神经系统损伤不利地影响运动行为和/或 认知能力方面，这取决于损伤的性质。例如，在大鼠中度中枢动脉闭塞模型中，相对 于对照组，在实验组中观察到运动行为、神经功能和认知表现中的缺陷(Borlognan等， 1998 ； Roof 等，2001)。认知和运动功能神经恢复都可以使用本领域普通技术人员已知的各种常规实践 的方法进行测定，从而确定认知和运动功能神经恢复。在啮齿动物中，例如，常用的功 能神经恢复认知检测包括水迷宫(Morris Water Maze) (MWM)、被动回避任务、Y-迷宫 /T-迷宫(Y-maze/T-maze)、畏惧训练、和目标识别任务。用于测量运动机能的功能性 神经恢复的常用测试包括转角拐测试(CTT)、神经严重性评分(NSS)、旷场运动行为测 试(open field locomotor activity test)、转棒测试(rotarod test)、夹持力度测定(grip strength assay)、步态分析(cat-walk gait analysis)、平衡木行走测评(balance beam test)、和倾斜屏 测试(inclined screen test)。类似地，本领域的普通技术人员使用在人类中常用的功能性 神经测定法来确定人类认知和运动功能性神经恢复的水平。本发明的其它不同实施方案提供增强基于细胞的治疗剂如基质细胞在损伤的哺 乳动物CNS中的植入的方法。当用于本文时，术语“移植”或“植入”意指基于细胞 的治疗剂在损伤的CNS或CNS组织中的存活，其中所述基于细胞的治疗剂在实施所述治 疗后保持存在于所述损伤的CNS中至少两周、至少一个月、或至少一年。不希望受到任何具体的理论的束缚，本发明部分预期增强的基于细胞的治疗剂 的植入导致治疗性细胞和内源性细胞之间增加的传递功效。该增加的细胞传递水平增大 内源性细胞在CNS损伤后参与神经再生过程的固有能力。因此，尽管不能正式排除植入 的细胞分化并且替换损伤的CNS细胞，本领域普通技术人员认识到，增加的由内源性中 枢神经系统细胞传递的神经再生信号由增加的细胞治疗剂植入和本发明治疗方法和组合 物的重要有益结果所介导。B.中枢神经系统的疾病、病症和症状本发明的方法可以用于增强具有多种不同类型的CNS损伤中的一种或多种的哺 乳动物中的神经复原、功能性神经恢复、和基于细胞的治疗剂植入，所述CNS损伤这样 包括出血性中风、缺血性中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、低氧-局部缺血、感染和中 毒。本领域普通技术人员将认识到，婴儿和成人发作型遗传病和/或神经变性疾病也包 括针对CNS的损伤，其可以通过本发明的方法和组合物有效地治疗。本发明的治疗性组合物可以施用给具有CNS损伤的成年人、和新生儿和儿童， 所述CNS损伤包括，例如，泰-萨病和相关的桑霍夫病、胡尔勒综合征和相关的黏多糖
15代谢病(mucopolysaccharidoses)与克拉贝病。关于成人CNS病，本发明的方法和组合
物有效用于神经复原、功能性恢复、和治疗各种神经疾病，包括但不限于，帕金森病、 阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿舞蹈病、癫痫等。还包括多发性硬化症的治疗。可以根据本发明进行治疗的其它神经变性病和相关的CNS损伤包括但不限 于，艾滋病痴呆症并发症(AIDS dementia complex)，神经脱髓鞘病(demyelinating diseases)，如多发性硬化症和急性转移酶脊髓炎(acute transferase myelitis)；实验性 自体免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis) (EAE)；椎体夕卜禾口小 脑病症(extrapyramidal and cerebellar disorders)，如 ecorticospinal 系统的损伤(lesions of the ecorticospinal system)；基底神经节病症(disorders ofthe basal ganglia)或小脑病 症(cerebellar disorders)；运动过度运动障石导(hyperkinetic movement disorders)，如亨 廷顿舞蹈症(Huntington ‘ s Chorea)和老年舞蹈症(senile chorea)；药物诱发的运动 障碍(drug-induced movement disorders)，如由阻断CNS多巴胺受体的药物诱发的那 些；运动功能减退运动障碍(hypokinetic movement disorders)，如帕金森病；进行性 supra-nucleopalsy (progressive supra-nucleopalsy) ； ,J、脑结构损伤(structural lesions of the cerebellum)；脊髓小脑变性(spinocerebellar degenerations)，如脊髓共济失调(spinal ataxia)，弗里德赖希共济失调，小脑皮层变性(cerebellar cortical degenerations)，多 系统变性(multiple systems degenerations) (Mencel， Dejerine Thomas, Shi-Drager, 禾口 Machado-Joseph), 多组织病症(systermioc disorders)， 如 Rufsum ‘ s 病， abetalipoprotemia,共济失调(ataxia)，毛细血管扩张(telangiectasia)；和线粒体多系 统病症(mitochondrial multi-system disorder)；神经脱髓鞘核心病症(demyelinating core disorders)，如多发性硬化症，急性横向脊髓炎(acute transverse myelitis)；和运动单元 病症(disorders ofthe motor unit),如神经源性肌肉萎缩(neurogenic muscular atrophies) (前角细胞变性(anterior horn cell degeneration)，如肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)，婴儿脊髓肌肉萎缩(infantile spinal muscular atrophy)和青少年脊髓肌 肉萎缩(juvenile spinal muscular atrophy))；阿尔茨海默病；中年唐氏综合征；弥散性雷 维小体病(Diffuse Lewy body disease)；雷维小体型老年痴呆症(Senile Demetia ofLewy body type)；韦尼克_科尔萨科夫综合征；慢性酒精中毒(chronic alcoholism)；克罗伊 茨费尔特_雅各布病；亚急性硬化性全脑炎哈勒沃登_施帕茨病(Subacute sclerosing panencephalitis hallerrorden-Spatz disease)；禾口拳击手痴呆症(Dementia pugilistica)。 参 见，例如，Berkow 等，(编)(1987)，The Merck Manual, (15.sup.th edition)，Merck and Co., Rahway, NJ.,该参考文献以及其中引用的参考文献通过引用结合于此。C.本发明的细胞本发明的方法和组合物提供施用有效量的基于细胞的治疗剂，例如基质细胞， 以治疗损伤的CNS或CNS组织。当用于本文时，术语“有效量”包括实现目的功能必需 的基于细胞的治疗剂的那些量，所述目的功能例如本文别处所述的增强神经复原、功能 性神经恢复、或植入。有效量取决于多种因素，包括所用的基于细胞的治疗剂的类型、 年龄、体重、性别、整体健康、待治疗病症的严重性、以及与所述基于细胞的治疗剂如 基质细胞一起施用的血脑屏障渗透剂的类型和量。本发明考虑，在本文所述的包括血脑屏障渗透剂的治疗中，基于细胞的治疗剂的有效量通常少于在不存在所述血脑屏障渗透 剂的条件下到达相同治疗程度所需要的基于细胞的治疗剂的有效量。在多个实施方案中，根据本发明可以使用任何类型的细胞。在某些实施方案 中，可以对具有损伤的中枢神经系统的患者施用与血脑屏障渗透剂联合的任何中胚层、 内胚层或外胚层种系的细胞。在本发明的某些实施方案中，优选的基于细胞的治疗剂是基质细胞。在本发明 具体的实施方案中，基质细胞是骨髓基质细胞、脂肪组织来源的基质细胞(ADSCs)、肝 基质细胞(LSCs)或脐带胶质基质细胞。基质细胞，也称为间充质干细胞，是包括干细 胞和祖细胞的混合细胞群体。然而，术语“基质细胞”应该保守为通过明确阐述的标准 表现出干细胞活性的这些细胞子集(Horwitz等，2005.Clarification of the nomenclature for MSC TheInternational Society for Cellular Therapy Position Statement (MSC 命名的说明 国际细胞治疗协会原则声明)，Cytotherapy(细胞疗法)，7，第393-395页)。在一个实施方案中，骨髓基质细胞(BMSCs)用作基于细胞的治疗剂。当用 于本文时，术语“骨髓基质细胞”、“BMSCs”、“骨髓基质细胞”、“间充质干 细胞”或“MSCs”互换使用，并且是指骨髓中可以作为针对骨细胞、软骨细胞、肌 细胞、脂肪细胞、和中枢神经系统中的神经元与非-神经元细胞的干细胞样前体的少 部分细胞。BMSCs已经得到了透彻的研究(Castro-Malaspina等，1980，Blood (血 液)56 289-30125 ； Piersma 等，1985，Exp.Hematol(实验血液学)13 237-243 ； Simmons 等，1991，Blood (血液)78: 55-62 ； Beresford 等，1992，J.Cell.Sci.(细胞 科学杂志)102: 341-351 ； Liesveld 等，1989，Blood(血液)73: 1794-1800 ； Liesveld 等，Exp.Hematol (实验血液学)I9 63_70 ； Bennett 等，1"1，J.Cell.Sci.(细胞科学杂 志)99: 131-139)。BMSCs可以通过各种来源商购获得。例如，可从Cognate Bioservices Incorporated (Baltimore, MD)获得由人、小鼠、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊、猪、和马 分离的BMSCs。备选地，BMSCs可以通过本领域普通技术人员公知的方法由任何动物 新鲜分离。在一些实施方案中，基质细胞来源于哺乳动物，并且在具体的实施方案中， 基质细胞来源于人。本领域已经记述了 BMSCs的来源和由这些来源获得和培养BMSCs的方法(例 如，Friedenstein 等，1976 Exp.Hematol.(实验血液学)4 267-274 ； Friedenstein 等， 1987，Cell Tissue Kinetics(细胞组织动力学)20 263-272 ； Castro-Malaspina 等， 1980，Blood(血液)56 289-301 ； Mets 等，1981，Mech.Aging Develop.(衰老发育机 制)16 81-89 ； Piersma 等，1985，Exp.Hematol.(实验血液学)13 237-243 ； Owen 等，1988，Cell andMolecular Biology ofVertebrate Hard Tissues (脊椎动物硬组织的细胞和 分子生物学)，Ciba Foundation Symposium, Chichester,英国，42-60; Caplan, 1991， J.Orthoped.Res.(整形外科研究杂志)9 641-650 ； Prockop, 1997，Science (科学)276 71-74 ； Beresford 等，1992，J.Cell Sci.(细胞科学杂志)102 341-351 ； Cheng 等， 1994, Endocrinology (内分泌学)1；34 277-286 ； Rickard 等，1"4，Develop.Biol.(发育 生物学)161: 218-228 ； Clark 等，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.(纽约科学学会年刊)770 70-78)。BMSCs可以由基本上任意骨髓获得，包括，例如，通过抽吸人供体的髂骨嵴获 得的骨髓。由供体获得骨髓的方法在本领域中是公知的。
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基质细胞可以在促进生长的条件下培养，所述条件可以包括基质细胞正常增殖 的任何条件组合(温度、气氛、生长培养基组成、湿度、搅动程度等)。这些条件都不是 重要的。温育接近正常的人体温(即，约37°C)，但是可以是基质细胞可以增殖的任何温 度(例如，30-43°C )。例如，基质细胞可以在空气气氛中、或在补充有5% CO2的空气 气氛中生长。生长培养基可以是任何液体培养基，其包含足以支持基质细胞增殖的营养 素和因子。这样的培养基包含，例如，碳源(例如，葡萄糖)和极限必需营养素(minimal essential nutrients),并且优选地包含哺乳动物血清(例如，胎牛血清)、抗生素(例如， 青霉素或链霉素)、和L-谷氨酰胺(即，用以提高对蛋白质生物合成的氨基酸供应)中 的一种或多种。哺乳动物血清可以以占总生长培养基体积1 % -20 %的浓度使用。血清优选地预 先筛选过，以确保其支持基质细胞的活力生长；一些批次，甚至由同一供应商提供的各 个批次不支持基质细胞的活力生长。备选地，哺乳动物血清可以用一种或多种生长因子 (例如，成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素生长因子、或内皮生长因 子)替换。例如，生长培养基可以是极限必需培养基-α，其无脱氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸，补充了胎牛血清、抗生素、和L-谷氨酰胺；可以是Dulbecco' S极限必需培养 基；和本领域普通技术人员公知的那些。在培养基质细胞过程中，优选更换培养基一次 或多次(例如，每3或4天更换)。本领域普通技术人员应该理解，例如，BMSCs可以增殖(expanded)并同时保
持在多能状态(即，分化成多种细胞类型之一的能力，所述细胞类型例如，诸如造骨细 胞、脂肪细胞和CNS细胞)。此外，本领域已经记述了 BMSCs在体外分化成各种细胞 类型的方法(例如，WO 96/30031，WO 99/43286，和美国专利号7,279,331)。以本发明方法施用的基质细胞(例如，BMSCs)可以使用本领域已知的方法培养 约1小时-1年的时间。在一些实施方案中，本发明的基质细胞可以在培养中保持约1-30 天，约5-20天，或约3-14天，并且优选地在不超过约14天、10天、或7天后收集。基质细胞可以通过在存在生长培养基的条件下，将细胞接种在生长表面上进行 增殖，然后之后(例如，10天)收集细胞。备选地，基质细胞增殖可以连续进行，意指 细胞增殖多于一次。例如，在第一生长表面上第一次增殖后，收集基质细胞，然后在第 二生长表面上在生长培养基中增殖。当然，可以收集两次增殖的基质细胞，并且使用相 同的方法进行一轮或多轮另外的增殖。对可以进行的增殖和收集的轮数没有理论限制。然而，应该认识到，对于大部分应用，通常需要不超过约10个基质细胞增殖和 收集周期，并且对于多种应用，包括本文所述的那些中的多种应用(例如，用作基于细 胞的治疗剂用于治疗损伤的CNS或CNS组织)，少如1，2，3，4，或5个周期将是足够 的。另外，本领域普通技术人员应该认识到，分离本文所述的不同类型的基质细 胞的方法在本领域中是已知的(例如，ADSCs，Rodbell(1964) JBiol Chem(生物化学杂 志)239 375 和 Hanuer 等(1989) J Clin Invest (临床研究杂志)84 1663-1670 ； LSCs, 美国专利申请公布号2006/0057125 ；和Wharton' s jelly stromal cells(脐带胶质基质细 胞)，McElreavey 等，1"1，Biochem.Soc.Trans.636th Meeting Dublin 19 29S 和美国专利 申请公布号2004/0136967)。
在一些实施方案中，要被引入到哺乳动物中的基质细胞可以来源于不同的供体 (异源的)或它们可以是由待治疗的个体获得的基质细胞(自体同源的)。另外，要被引 入到个体中的基质细胞可以由完全不同的物种获得(异种的)。D.血脑屏障渗透剂本领域的普通技术人员应该理解，本领域中存在多种已知的可商购获得的血脑 屏障渗透剂，所有这些适合按照本发明的方法使用。例如，CereporK例如，RMP-7)是 可从Alkermes公司(Alkermes Inc.) (Cambridge，ΜΑ)商购获得的一种血脑屏障渗透剂。 在其它具体的实施方案中，血脑屏障渗透剂特别选自由下列各项组成的组RMP-7、甘 露醇、其它适当的烷基甘油、和支链亲脂性分子的磷酸衍生物(例如，包括在美国专利 号7,186,703中所述的那些，美国专利号7,186,703通过引用完全结合于此)。在具体的实 施方案中，所述血脑屏障渗透剂是甘露醇。在相关实施方案中，血脑屏障渗透剂以足以增加血脑屏障渗透性的浓度施用。 在具体的实施方案中，例如，其中所述血脑屏障渗透剂是甘露醇，所述血脑屏障渗透剂 以约 0.25g/kg_3g/kg，约 0.5g/kg_2.5g/kg，约 lg/kg_2g/kg，约 1.25g/kg_1.75g/kg 或 约1.5g/kg的浓度施用。在具体的实施方案中，血脑屏障渗透剂(例如，甘露醇)以大 于.10g/kg，大于.25g/kg，大于.50g/kg，大于.75g/kg，大于 1.0g/kg，大于 1.25g/kg， 大于1.50g/kg，大于1.75g/kg，或大于2.00g/kg或更大的浓度施用。在其它相关的实施方案中，例如，其中血脑屏障渗透剂是Cereport，血脑屏障渗 透剂以约 0.01 μ g/kg-lmg/kg，约 0.1 μ g/kg-100 μ g/kg，或约 1 μ g/kg-10 μ g/kg 的浓度 或在其间的任何增量浓度施用。例如，在具体的实施方案中，Cereport以约1 μ g/kg，约 2 μ g/kg,约 3yg/kg，约 4yg/kg，约 5yg/kg，约 6 μ g/kg，约 7yg/kg，约 8yg/kg， 约9 μ g/kg,或约10 μ g/kg施用。在具体的实施方案中，Cereport以大于.005 μ g/kg，大于.01yg/kg，大于 1.0 μ g/kg,大于 10yg/kg，大于 50yg/kg，大于 100yg/kg，大于 250yg/kg，大于 500 μ g/kg,或大于1000 μ g/kg或更大的浓度施用。如本领域普通技术人员应该理解 的，任何具体的血脑屏障渗透剂的剂量可以使用本领域的常规方法确定。另外，可以使 用供应商推荐的剂量来激发需要的血脑屏障渗透性持续时间。在这一点上，上述剂量仅 是举例，并不应该解释为限制性的。在具体的实施方案中，血脑屏障渗透剂诱导暂时的血脑屏障渗透。在相关实施 方案中，渗透的持续时间在约1分钟-约1小时、约2分钟-45分钟、约5分钟-30分 钟、约10分钟-30分钟、或约15分钟-25分钟之间。在相关实施方案中，暂时的血脑屏障渗透保持约1分钟、2分钟、5分钟、10分 钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分 钟、或60分钟或其间的任何分钟的持续时间。E.增强损伤CNS中的神经复原近来对损伤CNS中神经复原性治疗的关注集中在使用未分化的多能基质细胞 (例如，BMSCs)来改善实验性神经损伤后的神经学结果，所述实验性神经损伤包括缺血 性中风、头部损伤、和脊髓损伤(Chopp等，2000 ； Eglitis等，1999 ；和Mahmood等， 2003)。然而，血脑屏障调节多种血_携带的物质进入脑，并且可以排除潜在的治疗剂进入脑。重要的是，在实验条件下已经表明BMSCs通过血脑屏障进入脑损伤的靶点部位 (Prockop等，1997; Li等，2001;和Zhang等，2002)。BMSCs已经表现出分化成神经 元和星形胶质细胞的能力，并且具有优先迁移到受损皮层的能力(Kopen等，1999)。特 别重要的是BMSCs分泌或刺激生长因子的分泌的能力，所述生长因子产生有益于神经再 生和神经复原的局部环境(Chopp和Li，2002)。在多份报道中，用人BMSCs治疗的动物在缺血性中风和创伤性脑损伤后已经表 现出显著的改善(Mahmood 等，2003; Li 等，2001; Li 等，2002; Li 等，2000;和 Lu 等，2004)。Seyfried与同事已经证明hBMSC输注在经历了出血性中风或脑内出血(ICH) 的大鼠中的有益作用，其由减少的组织损失、有丝分裂活性、未成熟神经元形成、突 触形成、和神经元迁移证实(Seyfried等2006)。然而，使用最低注射浓度获得最大的 hBMSCs治疗性递送是临床相关的关注。为了使最少量的BMSCs的治疗潜力最大，本发 明提供与基质细胞联合施用血脑渗透剂。本发明的多个实施方案针对通过扩大针对中枢神经系统损伤的内源性反应而增 强损伤的哺乳动物CNS中的神经复原。在具体的实施方案中，这通过施用有效量的基质 细胞和血脑屏障渗透剂组合而实现，由此增强损伤的CNS中的突触形成、神经形成、和 神经元迁移。因此，增强这些神经复原事件中的一种或多种的基于细胞的治疗剂可以在 损伤的CNS中增强神经复原并且提高功能性神经恢复。此外，这种神经复原性反应通过 联合施用基质细胞与血脑屏障渗透剂而得到强化。在一个实施方案中，在哺乳动物损伤的CNS组织中增强神经复原的方法通 过施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂实现。当用于本文时，术语"血脑屏障 渗透齐U (blood-brain barrier permeabilizer)‘‘禾口〃 血脑屏障渗透齐Ll (blood-brain barrier permeabilizing agent)“意指能够破坏血脑屏障完整性的物质。本发明的方法包括部分破 坏血脑屏障，以促使增加数量的基质细胞和更高水平的神经营养生长因子进入脑，并且 因此，增强哺乳动物损伤的CNS中的神经复原。在具体的实施方案中，所述哺乳动物选 自由下列各项组成的组人、小鼠、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊、猪、和马。在其它实 施方案中，所述哺乳动物是人。F.施用本发明的细胞在本发明的多个实施方案中，在哺乳动物损伤的CNS中增强神经复原的方法通 过施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂实现。在具体的实施方案中，与以不包括施 用血脑屏障渗透剂的步骤的方法，为了获得治疗效果必须向具有同样损伤的CNS的哺乳 动物施用的基质细胞的量相比，为获得治疗功效向具有损伤的CNS的哺乳动物施用的基 质细胞的量更少、大约与之相同或更多。例如，由于血脑屏障渗透剂允许更多的细胞到 达损伤的CNS，可以施用更少量的细胞。在某些实施方案中，更多数量的细胞可以与血 脑屏障渗透剂联合使用，而不具有不利的副作用(例如，脑血管闭塞)。在具体的实施方案中，与以缺少施用血脑屏障渗透剂的方法向具有同样损伤的 CNS的哺乳动物施用的基质细胞的数量相比，与血脑屏障渗透剂联合施用的基质细胞的 有效量少至少或约2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、或10-倍。 在其它实施方案中，与以缺少施用血脑屏障渗透剂的方法向具有同样损伤的CNS的哺乳 动物施用的基质细胞的数量相比，与血脑屏障渗透剂联合施用的基质细胞的有效量为大约相同到少约5-倍、约2-倍至4-倍、或约2.5-倍至3.5-倍。在具体的实施方案中， 与以缺少施用血脑屏障渗透剂的方法向具有同样损伤的CNS的哺乳动物施用的基质细 胞的数量相比，与血脑屏障渗透剂联合施用的基质细胞的有效量少于该数量的99%，少 于95%，少于90%，少于80%，少于70%，少于60%，少于50%，少于40%，少于 30%,少于20%，或少于10%。在一些实施方案中，向具有损伤的CNS的哺乳动物施用的基质细胞的有效量为 约IxlO4-约IxlO13个细胞/IOOkg哺乳动物。在一些实施方案中，施用的有效量的基质 细胞的数目为约IxlO6-约IxlO9个细胞/IOOkg或约IxlO8-约IxlO12个细胞/100kg。在 一些实施方案中，施用的有效量的基质细胞的数目为约IxlO9-约5x10"个细胞/100kg。 在一些实施方案中，施用的有效量的基质细胞的数目为约5xl01(l个细胞/100kg。在一些 实施方案中，施用的有效量的基质细胞的数目为IxIOici个细胞/100kg。在具体的实施方案中，与血脑屏障渗透剂联合施用的有效量的基质细胞的数目 少于IxlO12个细胞/100kg，少于IxlO11个细胞/100kg，少于IxIOki个细胞/100kg，少 于IxlO9个细胞/100kg，少于IxlO8个细胞/100kg，少于IxlO7个细胞/100kg，少于 5xl06个细胞/100kg，少于4xl06个细胞/100kg，少于3xl06个细胞/100kg，少于&106 个细胞/100kg，少于IxlO6个细胞/100kg，少于5xl05个细胞/100kg，少于4xl05个 细胞/100kg，少于3xl05个细胞/100kg，少于&105个细胞/100kg，少于IxlO5个细 胞/100kg，少于5xl04个细胞/100kg，少于IxlO4个细胞/100kg，或少于IxlO3个细胞 /100kg。本领域的普通技术人员将能够使用常规方法来确定用于本发明的方法的有效量 基质细胞的正确剂量。在某些实施方案中，与不包括联合施用血脑屏障渗透剂的方法相比较，有利地 与血脑屏障渗透剂联合施用包括较少基质细胞的有效量，从而减少基于细胞的治疗的脑 血管闭塞的危险。本领域的普通技术人员将理解，这样的闭塞对于损伤CNS中的神经复 原和功能性神经恢复是有害的。本发明的方法在CNS损伤发作后适当地有效用于增强神经复原和功能性神经恢 复。典型地，在损伤的几个小时内发生对缺血性和出血性中风的紧急管理，并且主要导 致神经保护作用。此外，尽管考虑在某些情形中，对神经损伤的某些紧急管理可能是必 需的，但是这些治疗不总是作用为在损伤的CNS中建立持续长久的负责神经复原和功能 性神经恢复的细胞改变，而本发明的方法提供这些。在一个实施方案中，在损伤的哺乳动物CNS中增强神经复原的方法通过施用有 效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂实现，其中基质细胞和血脑屏障渗透剂二者在CNS损 伤发作后施用。在其它相关的实施方案中，基质细胞和血脑屏障渗透剂二者在CNS损伤 后至少12小时施用给具有损伤的CNS的个体。在其它相关的实施方案中，基质细胞和 血脑屏障渗透剂二者在CNS损伤发作后大约至少1小时，至少2小时，至少3小时，至 少4小时，至少5小时，至少6小时，至少7小时，至少8小时，至少9小时，至少10 小时，至少12小时，至少24小时，至少48小时，至少72小时，至少1周，至少2周， 至少3周，或至少1个月施用给具有损伤的CNS的个体。另外，在其它具体的实施方案 中，基质细胞和血脑屏障渗透剂二者在CNS损伤发作后约1周-1个月，约12小时-1个 月，约12小时-2周，约12小时-1周，约12小时-72小时，约12小时-48小时，或约12小时-24小时施用。本领域的普通技术人员应该理解，本发明的方法和组合物可以在 CNS损伤后的任何时间实施，包括CNS损伤后至少12小时，并且仍然激发合乎需要的作用。考虑因为施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂的时间选择，在某些实施方 案中，适当地在多种CNS损伤的紧急治疗策略机会之后，多得多的患者将成为治疗的候 选者。此外，通过本发明特定方法使用的所述晚期治疗导致增强的神经复原和功能性神 经恢复，这在本领域中目前所用的紧急管理策略或其它晚期治疗中没有观察到。本发明的方法部分考虑施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂不必恰好同时 发生。在具体的实施方案中，血脑屏障渗透剂在基质细胞施用之前、同时或之后施用给 具有损伤的CNS的个体。在具体的实施方案中，血脑屏障渗透剂在施用基质细胞之前立 即或在施用基质细胞之前约30分钟、20分钟、10分钟、5分钟、2分钟、1分钟、或30 秒施用给损伤的CNS。在某些实施方案中，血脑屏障渗透剂在施用基质细胞之前立即至 约30分钟施用给损伤的CNS，或在基质细胞施用前约0-30分钟的任何时间间隔施用。 在具体的实施方案中，在向损伤的CNS施用基质细胞前约24小时、18小时、12小时、6 小时、3小时、2小时、或1小时加入血脑屏障渗透剂。本发明的方法包括通过本领域普通技术人员已知的各种途径施用有效量的 基质细胞和血脑屏障渗透剂。当用在本文中时，在整个说明书中使用术语“施用 (administration)”或“施用(administering)”来描述出于治疗的目的，将本发明的基质细 胞和血脑屏障渗透剂递送至具有损伤的CNS的个体的过程。本发明组合物的施用可以以多种方式实现，特别包括但不限于，肠胃外(所述 术语是指静脉内和动脉内以及其他适当的肠胃外途径)、鞘内、心室内、实质内(包括进 入脊髓、脑干或运动皮层)、池内、颅内、纹状体内、和黑质内，其允许本发明的方法中 所用的基质细胞最终迁移到所需要的靶点部位。在具体的实施方案中，施用可以随治疗的疾病或病症改变，并且可以优选地通 过肠胃外途径，例如，静脉内、或动脉内，或通过直接施用到脑中受影响的组织中。例 如，在脑血管损伤中，用于递送本发明的基质细胞的动脉内途径从理论观点来看是有吸 引力的，所述理论观点是使给定数量的细胞直接到受影响的组织的血管区域的递送最大 化。从临床观点来看，动脉内途径是吸引人的，因为其广泛地与其他疗法一起使用，所 述其他疗法包括化疗、肿瘤和动静脉畸形的栓塞、和颅内动脉狭窄或急性血栓形成闭塞 的内血管治疗。在具体的实施方案中，本发明的方法包括施用相对高剂量的血脑屏障渗透剂， 诸如甘露醇，以本文别处所述的范围提供，其可以有利地影响基质细胞向CNS损伤部位 的迁移，并且减少与血管内施用基质细胞相关的并发症，并且因此，增强神经复原和功 能性神经恢复。在一个实施方案中，在哺乳动物损伤的CNS组织中增强神经复原的方法通过肠 胃外施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂实现。在相关实施方案中，基质细胞和血 脑屏障渗透剂二者的施用可以通过静脉内或动脉内途径进行。在具体的实施方案中，基 质细胞通过与血脑屏障渗透剂不同的途径施用。本领域的普通技术人员应该理解，对于 基质细胞和血脑屏障渗透剂使用不同的施用途径不相对于基质细胞的施用时间而改变血
22脑屏障渗透剂的施用时间。例如，在本发明的某些方法中，血脑屏障渗透剂通过静脉内施用并且在动脉内 施用有效量的基质细胞之前、同时或之后施用给具有损伤的CNS的个体。在其他实施方 案中，血脑屏障渗透剂通过动脉内施用并且在动脉内施用基质细胞之前、同时或之后施 用给具有损伤的CNS的个体。在其它相关的实施方案中，血脑屏障渗透剂通过静脉内施 用并且在静脉内施用基质细胞之前、同时或之后施用给具有损伤的CNS的个体。在其他 实施方案中，血脑屏障渗透剂通过动脉内施用并且在静脉内施用基质细胞之前、同时或 之后施用给具有损伤的CNS的个体。本领域的普通技术人员应该理解，基质细胞、血脑屏障渗透剂、基质细胞的有 效量、基质细胞和血脑屏障渗透剂施用的时间和途径、以及关于本文所述用于在哺乳动 物损伤的CNS中增强神经复原的细胞和药剂的剂量适当地与本发明的方法和组合物一起 使用，所述本发明的方法和组合物通常针对在哺乳动物损伤的CNS中增强认知和运动功 能性神经恢复，并且增强基质细胞的植入。G.在损伤的CNS中增强功能性神经恢复本发明的其他多个实施方案涉及通过肠胃外施用有效量的基质细胞和血脑屏障 渗透剂(例如，甘露醇)，在具有损伤的CNS的哺乳动物中增强认知和运动功能性神经 恢复的方法。当用于本文时，术语“功能性神经恢复”或“认知和运动功能性神经恢 复”意指，作为使用本发明的方法或组合物的结果，在具有损伤的CNS的哺乳动物中改 善认知能力或运动和/或运动行为。改善可以作为任何给定的功能性神经任务在治疗之 前和之后的差别进行测量。因此，增强具有损伤的CNS的哺乳动物的认知和运动功能性 神经恢复意指，相对于具有同样损伤的CNS但未施用基质细胞和血脑屏障渗透剂(即， 单独的基质细胞或单独的血脑屏障渗透剂)的哺乳动物中的任务表现，在其中已向所述 哺乳动物施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂时，给定的功能性神经任务的表现的 提尚。在相关实施方案中，认知和运动功能性神经恢复增强约1 % _100%，约 5% -75%,约10%-60%，约25%-50%，或约35%-40%，其中100%表示在哺乳动 物未损伤的CNS中存在的认知和运动神经功能的正常水平。在某些实施方案中，认知 和运动功能性神经恢复增强约1%，2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,或 100%或其间的任何百分数恢复。H.在损伤的CNS中增强基质细胞的植入本发明的其他多个实施方案涉及通过肠胃外施用基质细胞和血脑屏障渗透剂如 甘露醇，在哺乳动物损伤的CNS组织中增强基质细胞的植入的方法。当用于本文时，术 语“植入”意指在实施治疗后约2周-约1年，施用的基质细胞存在于损伤的哺乳动物 CNS中。因此，在损伤的CNS中增强基质细胞的植入意指，相对于在用基质细胞而无血 脑屏障渗透剂的治疗后在损伤的CNS中存在的施用的基质细胞的数目，在包括基质细胞 和血脑屏障渗透剂的治疗后约2周-约1年的时间里在损伤的哺乳动物CNS中存在的施 用的基质细胞的数目增加。本发明部分考虑，在哺乳动物损伤的CNS组织中植入的基质细胞的数目的增加将促进更多的损伤CNS组织内源性细胞的神经再生，并且因此，通过增强所述损伤 的CNS中的神经复原、功能性神经恢复、和神经再生的速率和/或量级而对哺乳动物有益。植入的基质细胞可以使用本领域普通技术人员已知的多种技术检测。用于追踪 遗传修饰的基质细胞在哺乳动物损伤的中枢神经系统组织中的整合、分化、和迁移的蛋 白可以包括，但不限于，绿色荧光蛋白(GFP)，任意其他荧光蛋白(例如，增强型绿色、 青色、黄色、蓝色和红色荧光蛋白；Clontech，Mountain View, Calif.),或其他标签蛋白 (例如，LacZ，FLAG, Myc，His6, V5 等)。追踪遗传修饰的基质细胞在哺乳动物损伤的中枢神经系统组织中的整合、分 化、和迁移不限于使用由载体或病毒表达的可检测的分子。基质细胞的迁移、整合、和 分化可以使用一系列允许定位植入的骨髓基质细胞的探针来确定。这样的探针包括用于 人特异性Alu的那些，其是在每5000个碱基对中的约1个处存在的丰富的可易位的元 件，因此使得本领域技术人员能够追踪植入的细胞的进展。追踪植入的细胞可以进一步 通过使用本文他处详述的对细胞特异性标记的抗体或核酸探针来实现，所述标记诸如， 但不限于，NeuN，MAP2,神经丝蛋白等。本领域普通技术人员还应该理解，可以区分施用的基质细胞与施用所述基质细 胞的哺乳动物损伤CNS的内源性细胞的任何类型的探针、抗体、标记物、标记、标签、 核酸、或蛋白等可以用来定量本发明的基质细胞的植入。在具体的实施方案中，相对于在施用基质细胞而不施用血脑屏障渗透剂时观察 到的植入的量，与血脑屏障渗透剂联合施用有效量的基质细胞增强基质细胞的植入约 1.1-倍至10-倍，约1.2-倍至5-倍，约1.25-倍至2.5-倍，或约1.25-倍至2-倍。在 某些实施方案中，基质细胞的植入增强至少1.1-倍，1.2-倍，1.3-倍，1.4-倍，1.5-倍， 2-倍，2.5-倍，5-倍，10-倍，或更多。在具体的实施方案中，植入发生在损伤的CNS 组织中或损伤的CNS组织附近。I.在本发明的方法中所用的遗传修饰的基质细胞还提供本发明的方法和组合物用于与表达外源蛋白或分子(例如，用于治疗目 的或用于追踪它们在哺乳动物损伤的中枢神经系统组织中的整合、分化和迁移)的基质 细胞联合施用血脑屏障渗透剂。因此，本发明包括使用包括表达载体的基质细胞。向 基质细胞中引入外源DNA以在所述基质细胞中同时表达所述外源DNA的方法，诸如 通常关于细胞记述的那些，例如，记述在Sambrook等(2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港实验 室)，纽约)，和在 Ausubel 等(2007，Current Protocols in Molecular Biology (现代分子生 物学方法)，JohnWiley&Sons，纽约)中。用于向细胞中引入转基因的方法是公知的。对于本领域普通技术人员，多种用 于在哺乳动物细胞中递送和表达核酸的方法是已知的。这样的方法包括，例如，病毒载 体、基于脂质体的基因递送(WO 9VMMO ； Mannino Gould-Fogerite，BioTechniques (生 物技术)，vol.6 (7) 682-691(1988)；美国专利号 5,279,833 ； WO 91/06309 ； Feigner, 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，vol.84 7413-7414(1987)；和 Budker，等，Nature Biotechnology (自然生物技术)，vol.14 (6) 760-764 (1996))。技术人员已知的其他方法包括电穿孔(美国专利号5,545,130，4,970,154，5,098,843，和 5,128,257)，直接基因转移，细胞融合，沉淀方法，粒子轰击，和受体介导的摄入(美国 专利号 5,547,932，5,525,503，5,547,932，和 5,460,831)。还参见美国专利号 5,399,346。广泛应用的反转录病毒载体包括基于下列的那些鼠白血病病毒(MuLV)， 长臂猿(gibbon ape)白血病病毒(GaLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，人免疫缺陷病毒 (HIV)，及其组合。例如，参见，Buchscher，等，J.Virol.(病毒学杂志)，vol.66 (5) 2731-2739(1992) ； Johann,等，J.Virol.(病毒学杂志)，vol.66 (5) 1635-1640(1992)； Sommerfelt,等，Virol.(病毒学)，vol.176 58-59 (1990) ； Wilson，等，J.Virol. (病毒学杂志)，vol.63 2374-2378 (1989) ； Miller,等，J.Virol.(病毒学杂志)， vol.65 2220-2224(1991) ； PCT/US94/05700,以及 Rosenburg 和 Fauci, Fundamental Immunology (基础免疫学)，第三版(Paul ed.，1993))。基于AAV的载体也用来使用靶标核酸转导细胞，例如，在体外生产核酸和多肽 中，和在体内和离体基因治疗方法中。参见，West，等，Virology(病毒学)，vol.160 38-47(1987)；美国专利号 4,797,368 ； WO 93/24641 ； Kotin, Human Gene Therapy (人类 基因治疗)，vol.5 793-801(1994) ； Muzyczka, J.Clin.Invest.(临床研究杂志)，vol.94 1351 (1994)，和Samulski (同前)关于AAV载体的概述。重组AAV载体的构建记述在多 个出版物中，包括 Lebkowski，美国专利号 5,173,414 ； Tratschin,等，Mol.Cell.Biol.(分 子细胞生物学)，vol.5 (11) 3251-3260(1985) ； Tratschin,等，Mol.Cell.Biol.(分子细胞 生物学)Vol.4: 2072-2081(1984) ； Hermonat和Muzyczka，Proc.Natl.Acad.ScL, USA(美 国国家科学院学报)，vol.81 6466-6470(1984)；和 Samulski，等，J.Virol.(病毒学杂 志)，vol.63 03822-3828 (1989)。与直接将基因转移到体内相比，使用遗传修饰的基质细胞进行的基因治疗提供 一些特有的优点。首先，向基质细胞加入治疗性转基因在患者外发生，这允许临床医师 有重要的控制措施，因为他们可以选择并且仅用包含转基因且以充足量产生治疗剂的那 些基质细胞进行操作。因此，本发明还提供用于施用基质细胞的方法，所述基质细胞在向其中引入分 离的核酸，并且通过其表达由所需要的核酸编码的蛋白时，获得益处，其中所述蛋白先 前不存在于细胞中或者在细胞中不表达，或者其中其现在以与引入转基因之前不同的水 平或在与其不同的情况下表达。这样的益处可以是治疗性的，或者可以包括这样的事 实，现在已经提供了可以在实验室中体外研究或在细胞所存在的哺乳动物中研究所需要 的核酸的表达的系统，提供了其中包括引入的核酸的细胞可以用作研究、诊断和治疗工 具的系统，和提供了其中产生有效用于开发关于哺乳动物中所选疾病状态的新的诊断和 治疗工具的哺乳动物模型的系统。施用表达所需要的分离核酸的基质细胞可以用来向另一种细胞、组织、或整个 哺乳动物提供所述分离核酸的产物，其中较高水平的基因产物有效用于治疗或减轻与异 常表达、和/或活性相关的疾病、病症或病况。因此，本发明包括施用表达所需要的分 离核酸的基质细胞，其中增加所需要的蛋白的表达、蛋白水平和/或活性可以有效用于 治疗或减轻涉及CNS的疾病、病症或病况。另外，本发明的多个实施方案提供通过肠胃外施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂如甘露醇而治疗哺乳动物损伤的CNS的方法。在本发明的某些实施方案中，考 虑当与哺乳动物中同样损伤的CNS (其中不施用遗传修饰的基质细胞和血脑屏障渗透剂或 者其中仅施用基质细胞)相比，用血脑屏障渗透剂如甘露醇和有效量的基质细胞治疗哺 乳动物损伤的CNS将进一步增强所述哺乳动物中的神经复原、神经再生和功能性神经恢 复，其中所述遗传改造的基质细胞表达多种CNS生长因子、营养因子和细胞因子。还考虑本发明使用遗传改造的基质细胞的方法将有效用于治疗基本上任何如本 文别处所述的中枢神经系统疾病、病症、或病况。在某些实施方案中，在向具有损伤的中枢神经系统的哺乳动物施用有效量的基 质细胞和血脑屏障渗透剂之前，可以遗传改造所述基质细胞，以使其生产这样的分子， 诸如营养因子、生长因子、细胞因子、神经营养蛋白，诸如神经生长因子、神经胶质来 源的神经营养因子、睫状神经营养因子、脑源性生长因子、血小板衍生的生长因子、成 纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子，其对于在CNS中已经存在的细胞是有益的。例如，可以在将基质细胞引入到具有损伤的CNS的哺乳动物中之前培养基质细 胞并进行遗传改造。改造的基质细胞与血脑屏障渗透剂如甘露醇一起施用至具有损伤的 CNS的哺乳动物，以促进修饰的BMSCs的增强的植入。与其中不施用遗传修饰的基质 细胞和血脑屏障渗透剂的哺乳动物中相同损伤的CNS相比时，增加的遗传改造的BMSCs 的增强植入将进一步增强所述哺乳动物中的神经复原、神经再生、和功能性神经恢复。J.本发明的基于细胞的组合物本发明进一步提供可以用于增强神经复原、功能性神经恢复、基质细胞植入的 组合物，并且提供用于本文通篇所述的哺乳动物损伤的中枢神经系统的治疗。除血脑屏 障渗透剂外，本发明的组合物包括有效量的遗传修饰或未修饰的基质细胞。在具体的实 施方案中，基质细胞是骨髓基质细胞、脂肪组织来源的基质细胞、肝基质细胞、或脐带 胶质基质细胞。在相关实施方案中，血脑屏障渗透剂是烷基甘油、RMP-7或甘露醇。本 领域的普通技术人员将直接明白，本文别处所述的关于基质细胞和血脑屏障渗透剂的浓 度范围适用于本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物包括有效量的遗传修饰或未修饰的基质细 胞和血脑屏障渗透剂，任选地与药用载体、添加剂或赋形剂组合。在本发明的某些方 面，包括基质细胞和血脑屏障渗透剂的组合物可以进一步包括无菌盐水、林格溶液、 Hanks平衡的盐溶液(HBSS)、或Isolyte S，pH7.4。任一种本发明的组合物可以任选地 包括不含血清的细胞培养基。现在将通过下述实施例更充分地描述本发明。然而，本发明可以以多种不同形 式具体说明，并不应该解释为限于本文所述的实施方案；相反，提供这些实施方案以使 本公开内容透彻和完整，并且将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。
实施例实施例1在大鼠脑内出血(ICH)模型中，预先施用甘露醇改善HBMSCS的动脉内递送并 且显著提高功能性神经恢复实验概述
由先前的研究，清楚的是，在大鼠ICH模型中，血管内注射300-800万hBMSCs 显著提高功能性神经恢复(Seyfried等，2006)。随后，我们发现在ICH后共同施用血脑 屏障渗透剂(在这种情形中，是甘露醇)和hBMSCs进一步提高血管内MSC递送效率 (即，获得在不存在甘露醇条件下施用的300-800万hBMSCs的相同治疗功效，将需要较 少的注射细胞)，并且在与对照治疗相比较时，导致改善的功能性神经学结果。在进行实验性诱导的ICH的成年雄性Wister大鼠中，与分开施用的治疗相反， 或者与人成纤维细胞的对照施用相反，共同施用甘露醇和hBMSCs显著改善功能性神经 学结果。通过纹状体内输注自体同源血液，在36只雄性Wister大鼠中诱导ICH。有4 个ICH后组(N = 9)组1，阴性对照，仅动脉内注射100万人成纤维细胞；组2，静脉 内注射甘露醇；组3，动脉内注射100万hBMSCs;组4，静脉内注射甘露醇，然后动脉 内注射100万hBMSCs。所有动物在2周的实验期间是存活的，并且使用神经严重性评 分(NSS)和转角拐测试评分测量功能性结果。图1显示仅有接受甘露醇和hBMSCs组合 治疗的大鼠在转角拐和NSS测试中表现出显著的改善。本实验的结果表明共同施用甘露醇增加低剂量动脉内施用的hBMSCs的功效。 所述治疗不引起未成年死亡率(premature mortality)，并且是用于实验性诱导的ICH的 有效治疗。本研究表明，与动脉内给予治疗ICH的任一单独的治疗相比，甘露醇和 hBMSCs的联合治疗更有效地增加功能性神经恢复。材料和方法动物和试剂。成年雄性Wistar大鼠购自Jackson实验室。所有的动物研究均在 亨利福特卫生系统(HenryFordHealthSystem)研究动物养护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)的指导下进行。人骨髓基质细胞(hBMSCs)由 Cognate Therapeutics (Sunnyville, CA)提供。人原代成纤维细胞由 Theradigm (Baltimore, MD)提供。甘露醇获自西格玛(Sigma) (St丄ouis，MO)。静脉内出血、静脉内输注甘露醇和动脉内输注hBMSCs的动物手术方法。将36 只重量为270-320克的雄性Wistar大鼠用于脑内出血研究。在如先前所述的通用麻醉下 在大鼠中使用定向稳定(Stereotacticstabilization)和定位(Seyfried等，2006)。通过将由 股静脉获得的100μ1自体同源的血液以10 μ 1/分钟的稳定输注速率注射到右纹状体中诱 发ICH (Seyfried等，2004)。ICH后24小时，将动物分成4个实验组。组1仅接受动脉 内(通过内颈动脉)注射在磷酸缓冲盐水(PBS)中的100万人原代成纤维细胞作为对照。 组2接受通过尾静脉静脉内注射的剂量为1.5g/kg的在PBS中的甘露醇。组3接受动脉 内(内颈动脉)注射的在PBS中的100万hBMSCs。组4接受静脉内注射的剂量为1.5g/ kg的甘露醇，而后10分钟后动脉内注射在PBS中的100万hBMSCs。所有的治疗在诱发 ICH后24小时实施。所有的大鼠还从ICH后第1天开始接受每日腹膜内注射的IOOmg/ kg BrdU 共 14 天。功能性神经学测试。通过神经学严重性评分测试(NSS) (Chen等，2001)和转角 拐测试(Zhang等，2002)，如先前在Seyffied等，2006中所述，测量功能性神经学结果。统计学分析。功能性评分的统计学分析使用斯氏双尾t检验 (Student' stwo-tailedt-test)对独立的样品进行。数据表示为中值士标准误差，且认为 P值<0.05是显著性的。
结果在ICH动物模型中静脉内施用甘露醇然后动脉内注射hBMSCs导致显著改善的 功能性神经学结果。4组成年雄性Wistar大鼠如在材料和方法部分所述进行治疗，并且 功能性神经学结果在ICH后第1、7和14天通过NSS和转角拐测试评分进行测定。所有 动物在2周的实验期间存活。如在图1中所示，在ICH后第1天，在实施4组治疗后刚 开始，在所有4组动物中通过NSS和转角拐测试没有观察到明显的差别。在实验诱发的 ICH后7天，仅对于甘露醇和hBMSC联合治疗组，通过NSS测量的功能性神经学结果开 始表现出统计学显著性改善(图1，右图，组4)。在猝发后第二周末期，与人成纤维细胞 治疗对照组相比较，甘露醇和hBMSC联合治疗组表现出通过NSS和转角测试测定的显著 改善的功能性神经学结果(P < 0.05)(图1，比较组1和组4)。单独的甘露醇和hBMSC 治疗组表现出改善的倾向，但是未能表现出任何统计学显著的神经学改善(图1，组2和 组3)。在这一大鼠ICH模型中，静脉内甘露醇然后是低剂量动脉内hBMSC的联合治疗 证明早在猝发后七天是安全且有效的治疗。治疗性处理没有导致未成年死亡率，并且仅 在hBMSCs在甘露醇之后时有显著的功能性益处。通过在BMSCs之前施用甘露醇，使 用比先前所述低得多的BMSCs剂量，获得功能性神经学结果(通过NSS和转角拐测试测 量)的显著改善(Seyfried等，2006)。尽管由动脉内施用hBMSCs组成的治疗在脑局部缺血模型中是有效的，但是可 能的是，由于固有的血液凝结病理学的不同性质，甘露醇在ICH模型中的益处更明显。 实质血肿产生急性大量影响，包括周围的小血管，并且分泌血管原性血液降解产物；甘 露醇可以抵消这些影响，同时提高细胞的递送(Boulard等，2003)。这些结果对于靶向 损害的血管结构的治疗，或者在水肿可能限制给定的治疗的效用的情形中，具有重要分 歧，其中其可以有利地与甘露醇一起施用较小剂量的BMSCs，以获得与较高BMSCs剂量 相关的相同益处，而无限定。实施例2在大鼠ICH模型中，与仅用HBMSCS治疗相比较，使用甘露醇和HBMSCS治 疗显著减少组织损失实验概述本实验检测这样的假设共同施用甘露醇和hBMSCs将在大鼠ICH模型中导致 统计学显著性的脑组织损失程度减少。在猝发后14天，由实施例1中所用的成年雄性 Wistar大鼠制备石蜡脑切片。每只大鼠脑的6张切片用苏木精和曙红(H&E)染色，并且 计数细胞总数。与其他治疗组相比较，在甘露醇和hBMSCs联合治疗组中，作为未治疗 的身体对侧半球的百分数的身体同侧纹状体组织损失的百分数显著减少(图2)。这些实验结果表明甘露醇和hBMSCs的联合治疗在大鼠ICH模型中不但提供改 善的功能性神经学结果，还显著减少组织损失。另外，仅对于联合治疗组表现出ICH后 脑组织损失的显著减少(图2，组4)。材料和方法组织学和免疫组织化学。在手术后14天，将动物麻醉，并且经心脏 (tnmscardially)灌注4%在磷酸缓冲盐水中的低聚甲醛。切下脑组织，固定在甲醛中，并且切成2mm厚的切片。将切片包埋在石蜡中，并且每隔40张冠状切片(coronal section)， 切下在每个大鼠脑前囟点+0.1mm至-0.86mm之间的6μιη的厚度，总共6张切片，用于 Η&Ε染色和免疫组织化学染色。使用图像分析系统(Data Translation，Marlboro, ΜΑ)，
计算与身体对侧纹状体相比较的纹状体组织损失的百分数。统计学分析。ICH-相关组织损害区域的统计学分析使用独立的斯氏t检验进 行。数据表示为中值士标准误差，并且认为P值<0.05是显著性的。结果进一步分析作为实施例1中的实验受试体的36只成年雄性Wistar大鼠，以检验 治疗组中在ICH影响的区域的脑组织损失的程度。与另外3组中的组织损失百分数相比， 在接受甘露醇和hBMSC联合治疗的大鼠中，组织损失的百分数显著减小。相对于正常半球中纹状体组织损失，计算身体同侧纹状体组织损失的百分 数。在出血一侧的纹状体组织的实际损失百分数在图2中表示如下人成纤维细胞 =32.4士2.8%;单独的 100 万 hBMSCs = 24士3.4% (P > 0.05)；单独的甘露醇= 25.9 士 1.75% (P > 0.05)；和甘露醇与 hBMSCs = 21 士 3.2 % (P < 0.01)。因此，当与 对照组比较时，联合组中的纹状体组织损失的百分数显著减少。当单独施用甘露醇或 hBMSCs时，也观察到改善的趋势，但是这种趋势不是统计学显著性的。本实验中的甘露醇然后动脉内hBMSC的联合治疗表现出显著减少量的脑软化 (encephalomalacia)或组织损失。这种减少的组织损失仅在动物接受甘露醇和hBMSCs 时是显著的，在动物接受单独的动脉内hBMSCs时不显著的。这些结果突出了甘露醇和 hBMSCs联合治疗在神经学局部缺血模型中减少组织损失的另外的积极作用。实施例3免疫染色损失周围ICH大鼠脑切片显示甘露醇和HBMSCS联合治疗组中的增强 的神经复原实验概述本实验检测这样的假设共同施用甘露醇和hBMSCs将在大鼠ICH模型中导致 统计学显著性的脑组织损失程度减少。在猝发后14天，由实施例1中所用的成年雄性 Wistar大鼠制备石蜡脑切片。来自每个大鼠脑的6张切片与指示神经复原的抗体杂交， 如下文所述。这些实验的结果表明，甘露醇和hBMSCs的联合治疗增强身体同侧大鼠纹状体 中的hBMSCs植入，这由增加的mAb 1281染色所证实，而且还表明增加的神经复原，这 由增加的BrdU、突触小泡蛋白、双皮层蛋白和神经元β-微管蛋白同种型III染色所证实。材料和方法试剂。5‘-溴-2 ‘脱氧尿苷(BrdU)获自西格玛(Sigma) (St.Louis, MO)。 使用下述一级抗体针对下列各项的单克隆抗体BrdU(l 100 Dako, Carpenteria, CA.)；突触小泡蛋白(1 l,000mAb，Clone SY 38 ； Chemicon.Temecula.CA)；双皮层蛋 白(DCX) (1 50; Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA)，神经元 β-微管蛋白同 种型 III (TUJl) (1 5,OOOmAb ； Covance, Berkeley, CA)和抗-核仁(1 500 ；对所有 人类细胞型特异；Chemicon.Temecula.CA)。
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组织学和免疫组织化学。在手术后14天，将动物麻醉，并且经心脏 (tnmscardially)灌注4%在磷酸缓冲盐水中的低聚甲醛。切下脑组织，固定在甲醛中，并 且切成2mm厚的切片。将切片包埋在石蜡中，并且每隔40张冠状切片(coronal section)， 切下在每个大鼠脑前囟点+0.1mm至-0.86mm之间的6 μ m的厚度，每只大鼠总共6张 切片，用于H&E染色和免疫组织化学染色。切片在包含5%正常山羊血清、1%BSA和 0.05%吐温-20的Tris缓冲盐水中封闭。然后，将切片与一级抗体温育用以定位BrdU(增 殖细胞标记)，TUJl (未成熟神经元的标记)，DCX(迁移的成神经细胞的标记，Feng 等，2001)和mAb 1281 (对人核仁特异性的标记，Mahmood等，2003)。所有免疫染色 同时进行，其中两个阴性对照不使用一级抗体，和使用预先免疫的血清用于免疫染色步 骤的质量控制。对于突触小泡蛋白、TUJl和DCX的半定量测量，使用来自相同封闭不 同水平的一系列6张载玻片。测量纹状体区中的突触小泡蛋白。TUJl和DCX在脑室下 区测量。突触小泡蛋白、TUJl和DCX在20X物镜(Olympus BX40 ；奥林巴斯光学公 司(Olympus Optical Co)，东京，日本)下使用3-CCD彩色摄影机(型号DXC-970MD ； 索尼公司(Sony Corp)，东京，日本)进行数字成像，所述3-CCD彩色摄影机与MCID 图像分析系统(Imaging Research，Inc, St.Catharines, ON, Canada)连接。对于突触 小泡蛋白、TUJl和DCX，数据表示为每个视野中免疫阳性面积除以视野的总面积(628x 480 μ m2)的百分数(Chen等，2003)。在损伤周围边缘处计数BrdU-阳性细胞数目。 MAB1281定量数据表示为在每张载玻片损伤周围边缘处内的MAB1281免疫反应性细胞 总数。还进行免疫组织化学分析和身体同侧组织损失的百分比，以描述增殖的未成熟的 神经元和神经元迁移。统计学分析。功能性评分、ICH-相关的组织损坏的面积、和组织化学结果的 统计学分析均使用独立的斯氏t检验进行。数据表示为中值士标准误差，并且认为P值 <0.05是显著性的。结果将来自作为实施例1和2中的实验受试体的36只成年雄性Wistar大鼠的脑切片 针对BrdU、mAb 1281和突触小泡蛋白、TUJl和DCX的基因表达进行免疫组织化学染色。如图3A所示，使用mAb 1281的免疫组织化学染色表明，在联合组的损伤区域 中实质上存在比hBMSC组(157士21)更多的阳性染色的细胞(216士 16，P < 0.05),这 表明甘露醇有效地加强hBMSCs迁移到损伤部位。基于mAb 1281免疫染色，当与单独的 甘露醇治疗相比较时，在联合治疗组中补充到损伤的区域的hBMSCs的数目显著增加。针对BrdU的免疫染色表明，与对照组相比较，在甘露醇和hBMSCs联合治疗组 中在损伤部位边缘区中存在显著更多的BrdU阳性染色细胞(P < 0.05)(图3B)。这种 BrdU阳性细胞数目的增加表明，甘露醇和hBMSCs协同作用促进细胞增殖和向损伤区域 迁移。一个显著的观察是单独的甘露醇显著增加损伤部位附近的BrdU标记(P < 0.05)， 这表明甘露醇本身可以包含起始DNA复制的促有丝分裂活性。甘露醇和hBMSC联合治疗组的免疫组织化学染色揭示与对照组相比较在ICH影 响区域中突触小泡蛋白、TUJl和DCX表达的显著增加(P < 0.05)(图3，C，D，和E 图)。增加的突触小泡蛋白表达表明增加的突出形成。TUJl表达的增加与增殖的未成熟神经元的增加相一致，而DCX表达的增加表示神经元迁移的增加。为了检测是否形 成了任何新的未成熟的神经元，进行了使用BrdU和TUJl 二者的共同免疫染色。如在图 3F中所表明的，关于BrdU和TUJl的双染色揭示表达神经元标记同时仍然分裂的细胞亚 群，这表明在联合治疗组中在恢复阶段新形成了未成熟的神经元。在本实验中甘露醇然后动脉内hBMSC的联合治疗证明通过甘露醇输注到达损 伤区域的hBMSCs数量显著增加，并且表明，存在改善的通过微血管的递送和/更好的 血脑屏障渗透性。另外，表明甘露醇是ICH后神经复原过程中的有效辅助物，因为与对 照相比较，在受影响的ICH区域中存在的BrdU阳性细胞增加。尽管当单独用甘露醇或 hBMSCs治疗时没有观察到功能性神经学结果的统计学显著性改善，但是单独的甘露醇 或单独的低剂量hBMSCs在损伤部位显著引发细胞增殖。这表明使用hBMSCs和甘露醇 的联合治疗在该ICH模型中真正是协同性的，并且导致显著的功能性神经恢复。动脉内输注MSCs的有益作用在静脉内注射甘露醇时增大。这导致具有 5'-溴-2'脱氧尿苷结合的细胞数量增加，和用针对神经元标记的抗体染色的未成熟细 胞的数量增加。预先施用甘露醇显著增加定位在ICH区域中的hBMSCs数量，改善神经 再生和神经复原的组织化学参数，并且减少ICH的解剖学和神经病理学后果。本研究进 一步表明甘露醇和hBMSCs的联合治疗比动脉内单独给予的治疗更有效地治疗ICH。此外，本研究表明，使用本文所述的本发明的组合物治疗远远超出正常期间常 规急性管理疗法的中枢神经系统损伤是可能的，并且在重塑损坏的中枢神经系统组织方 面非常有效。在本说明书中引用和/或在申请数据表中列出的所有上述美国专利、美国专利 申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用完全结 合于此。从前文应该理解，尽管本发明出于举例说明的目的已经描述了具体的实施方 案，但是可以在不背离本发明的精神和范围的条件下进行各种修改。因此，本发明除受 后附的权利要求限制外不受限制。
权利要求
1.增强具有中枢神经系统(CNS)损伤的哺乳动物的损伤的中枢神经系统组织的神 经复原的方法，所述方法包括向所述哺乳动物肠胃外施用有效量的基质细胞和血脑屏障 (BBB)渗透剂。
2.权利要求1的方法，其中所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基质细 胞，脂肪组织来源的基质细胞，肝基质细胞和脐带胶质基质细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述基质细胞是骨髓基质细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基甘油， RMP-7和甘露醇。
5.权利要求4的方法，其中所述BBB渗透剂是甘露醇。
6.权利要求1的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施用。
7.权利要求6的方法，其中所述基质细胞通过动脉内施用，并且所述BBB渗透剂通 过静脉内施用。
8.权利要求1的方法，其中所述BBB渗透剂在所述基质细胞施用之前施用或大约与 之同时施用。
9.权利要求1的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后 施用。
10.权利要求1的方法，其中所述基质细胞和BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后约2 小时施用。
11.权利要求1的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后 约12小时施用。
12.权利要求1的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后 约1周施用。
13.权利要求1的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤后 约1周-约1个月施用。
14.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
15.权利要求1的方法，其中所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的组中 风，创伤性脑损伤，脊髓损伤，低氧-局部缺血，癫痫发作，感染和中毒。
16.权利要求15的方法，其中所述中枢神经系统损伤是缺血性或出血性中风。
17.权利要求1的方法，其中所述中枢神经系统损伤由选自由下列各项组成的组的中 枢神经系统疾病、病症或症状引起泰-萨病，桑霍夫病，胡尔勒综合征，克拉贝病， 帕金森病，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿舞蹈病，癫痫，多发性硬 化症，脊肌肉萎缩(SMA)，弗里德赖希共济失调，唐氏综合征，韦尼克_科尔萨科夫综 合征和克罗伊茨费尔特-雅各布病。
18.权利要求1的方法，其中与没有施用所述基质细胞和所述BBB渗透剂的哺乳动物 中同样损伤的中枢神经系统组织相比较，在施用所述基质细胞和所述BBB渗透剂后，损 伤的中枢神经系统组织具有增加的突触小泡蛋白、神经元III类微管蛋白(TUJl)、和 双皮层蛋白(DCXl)的表达。
19.增强具有中枢神经系统损伤的哺乳动物的认知和/或运动功能神经恢复的方法， 所述方法包括向所述哺乳动物肠胃外施用基质细胞和血脑屏障(BBB)渗透剂。
20.权利要求19的方法，其中与没有施用所述基质细胞和所述BBB渗透剂的同样损 伤的哺乳动物的认知和/或运动功能神经恢复相比较，在施用所述基质细胞和所述BBB 渗透剂后，所述哺乳动物的认知和/或运动功能神经恢复更强。
21.权利要求19的方法，其中所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基质细 胞，脂肪组织来源的基质细胞，肝基质细胞和脐带胶质基质细胞。
22.权利要求19的方法，其中所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基甘 油，RMP-7和甘露醇。
23.权利要求19的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施用。
24.权利要求23的方法，其中所述基质细胞通过动脉内施用，并且所述BBB渗透剂 通过静脉内施用。
25.权利要求19的方法，其中所述BBB渗透剂在所述基质细胞施用之前施用或大约 与之同时施用。
26.权利要求19的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后施用。
27.权利要求19的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约2小时施用。
28.权利要求19的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约12小时施用。
29.权利要求19的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约1周施用。
30.权利要求19的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约1周-约1个月施用。
31.权利要求19的方法，其中所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的组中 风，创伤性脑损伤和脊髓损伤。
32.权利要求31的方法，其中所述中枢神经系统损伤是缺血性或出血性中风。
33.增强在具有中枢神经系统损伤的哺乳动物的损伤的中枢神经系统组织中植入基 质细胞的方法，所述方法包括向所述哺乳动物肠胃外施用有效量的基质细胞和BBB渗透 剂。
34.权利要求33的方法，其中与没有施用基质细胞和BBB渗透剂的哺乳动物中同样 损伤的中枢神经系统组织中植入的基质细胞的数量相比较，在施用所述基质细胞和BBB 渗透剂之后，植入损伤的中枢神经系统组织中的基质细胞的数量更大。
35.权利要求33的方法，其中所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基质细 胞，脂肪组织来源的基质细胞，肝基质细胞和脐带胶质基质细胞。
36.权利要求33的方法，其中所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基甘 油，RMP-7和甘露醇。
37.权利要求33的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施用。
38.权利要求37的方法，其中所述基质细胞通过动脉内施用，并且所述BBB渗透剂 通过静脉内施用。
39.权利要求33的方法，其中所述BBB渗透剂在所述基质细胞施用之前施用或大约与之同时施用。
40.权利要求33的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后施用。
41.权利要求33的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约2小时施用。
42.权利要求33的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约12小时施用。
43.权利要求33的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约1周施用。
44.权利要求33的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约1周-约1个月施用。
45.权利要求33的方法，其中所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的组中 风，创伤性脑损伤，脊髓损伤，低氧-局部缺血，癫痫发作，感染和中毒。
46.权利要求45的方法，其中所述中枢神经系统损伤是缺血性或出血性中风。
47.治疗具有中枢神经系统损伤的哺乳动物的损伤的中枢神经系统组织的方法，所述 方法包括肠胃外施用有效量的基质细胞和血脑屏障渗透剂。
48.权利要求47的方法，其中所述基质细胞已被遗传修饰过。
49.权利要求48的方法，其中所述基质细胞已被遗传修饰过，从而增加选自由下列各 项组成的组的生长因子的表达神经生长因子，神经胶质来源的神经营养因子，睫状神 经营养因子，脑源性生长因子，血小板衍生的生长因子，成纤维细胞生长因子和血管内 皮生长因子。
50.权利要求48的方法，其中所述基质细胞选自由下列各项组成的组骨髓基质细 胞，脂肪组织来源的基质细胞，肝基质细胞和脐带胶质基质细胞。
51.权利要求48的方法，其中所述BBB渗透剂选自由下列各项组成的组烷基甘 油，RMP-7和甘露醇。
52.权利要求48的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂通过血管内施用。
53.权利要求48的方法，其中所述血脑屏障渗透剂在所述基质细胞施用之前施用或大 约与之同时施用。
54.权利要求48的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后施用。
55.权利要求48的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约2小时施用。
56.权利要求48的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约12小时施用。
57.权利要求48的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约1周施用。
58.权利要求48的方法，其中所述基质细胞和所述BBB渗透剂在中枢神经系统损伤 后约1周-约1个月施用。
59.权利要求48的方法，其中所述中枢神经系统损伤选自由下列各项组成的组中风，创伤性脑损伤，脊髓损伤，低氧-局部缺血，癫痫发作，感染和中毒。
60.权利要求59的方法，其中所述中枢神经系统损伤是缺血性或出血性中风。
61.权利要求48的方法，其中所述中枢神经系统损伤由选自由下列各项组成的组的中 枢神经系统疾病、病症或症状引起泰-萨病，桑霍夫病，胡尔勒综合征，克拉贝病， 帕金森病，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，亨廷顿舞蹈病，癫痫，多发性硬 化症，脊肌肉萎缩(SMA)，弗里德赖希共济失调，唐氏综合征，韦尼克_科尔萨科夫综 合征，和克罗伊茨费尔特-雅各布病。
62.一种组合物，其包括有效量的基质细胞和BBB渗透剂。
63.权利要求62的组合物，其中所述基质细胞已被遗传修饰过。
64.权利要求63的组合物，其中所述基质细胞已被遗传修饰过，从而增加选自组的生 长因子的表达，所述组选自下列各项神经生长因子，神经胶质来源的神经营养因子， 睫状神经营养因子，脑源性生长因子，血小板衍生生长因子，成纤维细胞生长因子和血 管内皮生长因子。
全文摘要
本发明提供用于治疗哺乳动物中枢神经系统损伤的新方法和组合物。这些方法包括联合施用基质细胞和血脑屏障渗透剂，从而增强神经复原、功能性神经恢复、基质细胞植入、和神经变性疾病的治疗。
文档编号A61P25/28GK102014935SQ200980114941
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月24日 优先权日2008年2月28日
发明者迈克尔·乔普 申请人:亨利福特保健系统公司