专利名称：肽及其作为进入癌细胞的载体的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及在癌细胞的分析或治疗中用于诊断或治疗目的的产品的领域。
背景技术：
自上世纪起人们就已经知道染色体异常与肿瘤发展之间的关系。然而直至近二十 年来，随着细胞遗传学和分子生物学的发展，人们才明确证实了肿瘤形成遗传学的原理并 且认识到染色体改变是人类肿瘤发病机理中的关键因素。在最近的一项研究中，人们检测脂肉瘤细胞株并发现其在细胞培养基中可 分泌和生成多种蛋白质。在这些蛋白质中，特别鉴定出锰超氧化物歧化酶(已知为 LSA-type-MnSOD)，它除了转化自由基为过氧化氢的酶活性(所有SOD都具有的普遍活性) 外，证实它具有其他结构和功能性质例如其可从髓细胞性白血病细胞株U937中表达的相 应MnSOD中分化而来。一方面LSA-Type-MnSOD由LSA细胞分泌，而天然MnSOD位于线粒体基质中，前者 的分子量(30kDa)显著高于天然MnSOD Q4kDa)。此外，如果体内或体外注射LSA-type-MnSOD，它能够到达所有细胞并且与其中存 在的自由基反应，生成过氧化氢。但是其在肿瘤细胞中比在正常细胞中更容易达到毒性阈 值，这是由于肿瘤细胞没有足够数量的过氧化氢酶，不能代谢这种过氧化物。这样导致了对 增生的选择性抑制并且仅增加肿瘤细胞的死亡。这证实了 LSA-type-MnSOD对于肿瘤细胞 的细胞毒性具有选择性和专一性。由特定cDNA克隆生产的LSA-type-MnSOD的重组体(rMnSOD)也保留了该天然蛋 白质的结构和细胞毒性性质，此外提取出的LSA-type-MnSOD和rMnSOD都在N-末端具有一 段M个残基的肽，这段肽与MnSOD的引导序列精确对应。附图简述
图1 (a-d)表示单独的顺钼(d)、与rMnSOD的引导肽缀合的顺钼(c)以及单独的 rMnSOD的引导肽(b)与阴性对照(a)相比较的对不同细胞株的作用。图2表示凋亡基因Bax仅在用rMnSOD-Lp-CC处理的肿瘤细胞中具有活性。发明详述现在人们惊讶地发现代表rMnSOD引导肽的肽序列为 MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ(SEQ 1)它能够穿透癌细胞从而作为载体来运送用于治疗或诊断目的的分子或放射性同 位素至所述细胞中，并且考虑到与以上序列的相似性，LSA-type-MnSOD的引导肽序列也具 有此性质。根据另一个实施方案，本发明还涉及一个以下序列的肽MLSRAVC (SEQ 2)它也能够以与上述肽(SEQ 1)类似的方式作为载体。此外，本发明还涉及通过插入一个半胱氨酸至前述七肽(与N-末端甲硫氨酸相连)或通过用一个半胱氨酸取代所述甲硫氨酸且在所述插入的半胱氨酸和之前已存在的 半胱氨酸之间环化形成一个二硫桥来获得的肽；因此所述肽分别具有以下序列CMLSRAVC (SEQ 3)CLSRAVC (SEQ 4)在所述肽中两个末端半胱氨酸通过一个二硫桥连接在一起。本发明还涉及前述的引导肽与能够结合放射性同位素的螯合基团(例如D0TA、 DTPA、ΝΟΤΑ、HYNIC等等)、染料例如荧光素、若丹明等等、具有细胞毒性性质的分子例如顺 钼、紫杉酚、表阿霉素等等、或具有酶活性的分子例如能够阻止有丝分裂信号转导的激酶抑 制剂、以及反义寡核苷酸(ο. η.)形成的缀合物。此外，如果需要，已和顺钼缀合的引导肽(SEQ 1)(在下文中涉及时表示为 rMnSOD-Lp-CC的一种复合物)还可进一步与生物多聚物或脂质体缀合并且用于通过口服 或皮下方式给药的抗肿瘤治疗。因此本发明还涉及一种控制释放rMnSOD-Lp-CC的制剂。所述制剂可包括例如由 生物可降解材料制成的微球体，其中生物可降解材料为例如透明质酸、PEG、聚乳酸-乙醇 酸共聚物(PLGA)和其他制药领域中完善使用的生物可降解的和生物相容的共聚物。如果使用PLGA，为了评价聚合物性质如何影响微球体的性质，可以使用具有不同 的乳酸-乙醇酸比例(75 25和50 50)、不同的分子量和不同亲水性的PLGAs ；例如可 使用Resomer RG 504H和Resomer RG 756 (或其等价物)，它们的固有粘度分别为0. 5和 0. 8dl/g 而分子量(Mw)分别为 20，000 和 89，OOODa0以与上述类似的方式与DOTA缀合并结合于生物多聚物或脂质体的引导肽还可用 作纳米技术方法中的分子载体，这些方法已通过了美国FDA的批准。此外，rMnSOD-Lp-CC可用来进行预测试验(通过免疫细胞化学技术)以了解使用 rMnSOD-Lp-CC的抗肿瘤治疗是否对肿瘤产生影响。在这一方面，如果使用rMnSOD-Lp-CC处理肿瘤的组织冷冻切片60分钟，然后 在Zamboni液体固定后，用抗rMnSOD的抗体处理，可以确定肿瘤组织细胞是否掺入了 rMnSOD-Lp-CC。阳性结果表示如果rMnSOD-Lp-CC注射入肿瘤侵袭的生物体，那么它可以到达肿 瘤并且破坏肿瘤。此外，通过比较rMnSOD-Lp-CC穿透肿瘤细胞的能力和这些细胞中雌二醇受体的 存在，可以通过描述的免疫细胞化学分析来确定该肿瘤的雌二醇受体表达程度。因此本发明涉及用于治疗肿瘤疾病和诊断方法的包含至少一种前述缀合物的药 学组合物。本发明可通过以下实施例来更好地理解。实施例1序列为MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ(SEQ 1)的肽的合成使用固相合成技术和标准Fmoc方法在手动反应器中合成M个氨基酸的引导肽 (SEQ 1)。使用半制备RP-HPLC和C18结合硅胶柱(Vydac 218TP1010)来进行纯化。得到 99%纯度的肽；肽的分子量通过质谱和氨基酸分析来确认。实施例2
序列为MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1)的肽和 DOTA 的缀合以及用 68fei 标记 所获得的复合物。实施例1中获得的合成引导肽随后与20 μ g DOTA和放射性68^i在!fepes缓冲液 中120°C下缀合15分钟。然后通过反相色谱法在C18柱上纯化被标记的肽，用水冲洗并在 空气中风干。然后将肽在400 μ 1的96%乙醇中再次溶解。将此种肽在醋酸/醋酸钠缓冲液或龙胆酸缓冲液中用9°Y、mLu、mh在90°C下标 记30分钟。对与DOTA缀合的rMnSOD弓丨导肽进行分析以确定其在生理溶液中的稳定性。发现 此肽可稳定存在48小时而不表现出任何物理化学结构上的变化。实施例3序列为MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1)的肽和荧光素的缀合在固相上通过标准偶联方法使用5(6)-羧基荧光素(FAM)在母体肽 MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ和其较短的类似物MLSRAVC的N-末端进行标记。实施例4序列为MLSRAVC(SEQ幻的肽的合成在一个手动反应器中使用固相合成技术和标准Fmoc方法来合成实施例1中 获得的肽序列的前7个氨基酸形成的肽。通过半制备RP-HPLC使用C-18结合硅胶柱 (Vydac218TP1010)来进行纯化。肽的纯度为99%；通过质谱和氨基酸分析来确认肽的分子量。实施例5SEQ 2肽的环化通过对肽序列MLSRAVC引入第二个半胱氨酸残基来获得两个环状类似物类似物1CMLSRAVC(SEQ 3)类似物2CLSRAVC (SEQ 4)类似物1 通过原始肽序列的甲硫氨酸上结合一个半胱氨酸来获得。类似物2 通过用半胱氨酸取代原始肽上的N-末端甲硫氨酸来获得。通过末端的两个半胱氨酸上的SHs的键来形成二硫桥。添加0. IMNH4HCO3水溶液至肽链(每IOmg肽加IOml溶液)然后在室温下只用空 气氧化大约48小时以完成环化。获得两个环状肽与螯合剂结合并在醋酸/醋酸钠缓冲液或龙胆酸缓冲液中用9°Y、 17W11In在90°C下标记30分钟。实施例6将ImCi实施例2中获得的标记缀合物注射至一只患有多发乳腺肿瘤的13年龄大 的雌性犬中。注射后使用ECAT 47PET扫描仪(Siemens)扫描大约30分钟，根据轴状面、冠状面 和矢状面构建图像。实施例7在室温下用实施例3获得的缀合物和一个“乱序”肽分别处理MCF-7细胞1小时，该“乱序”肽具有相同的氨基酸组成但是顺序不同，也对其进行了标记且用作对照。处理后，使用共聚焦显微镜检测细胞。在用实施例3获得的缀合物孵育的细胞中可见标记的细胞质荧光，而在乱序肽处 理的对照组细胞中没有见到任何荧光；这说明标记的肽能够进入细胞而乱序肽没有表现出 所述的穿透细胞的能力。实施例8与顺钼缀合的rMnSOD弓|导肽复合物的合成rMnSOD的引导肽由M个氨基酸组成，其序列为MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ,它通过固相Fmoc法在适合的反应管中合成。获得的样品随后通过半制备HPLC使用C18结合硅胶柱(Vydac 218TP1010)来进 行纯化。RP-HPLC分析确认肽纯度为99 %。然后在肽残基的N-末端位置(M)结合一个二氨基-乙基-甘氨酸，由于两个游离 的氨基功能团处于适合的距离0个共价键)，所以其可以与PTCl2B式的钼(II)离子缀合。 根据Mewart JM, Young JD.的方法(固相肽合成)通过质谱分析和氨基酸序列分析检测 和确认正确的分子量和肽质量。实施例9免疫细胞化学来源于人源乳腺肿瘤、连续培养的靶细胞(MCF-7)在(a)没有与任何其他分子缀 合的rMnSOD-Lp-CC的M个氨基酸引导肽、(b)与顺钼缀合的M个氨基酸引导肽的存在和 不存在下孵育三小时。孵育后，将细胞用Zamboni固定剂低聚甲醛+15%苦味酸组成的溶液)固定 60分钟且用PBS冲洗。然后在含有0. 3%过氧化氢的PBS中保存细胞以封闭内源性过氧化 物酶。然后添加1/200稀释的多克隆抗体(抗兔源rMnSOD引导肽)至细胞中，在室温下孵 育1小时。使用DAKO SLAB Peroxidase K0679试剂盒来显影该反应。实施例10使用原子吸收分光光度法通过rMnSOD引导肽定量来确定转运至肿瘤细胞中的顺 钼胰蛋白酶消化靶细胞MCF-7，用缓冲溶液(PBS)冲洗两次，然后用50 μ 1 35% HNO3 处理16小时。使用Analyst 800仪器(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)根据以下参数 对样品进行原子吸收检测来确定钼含量预处理温度，1300°C ；原子化温度，2200°C ；使用 0. 015mg钼和0. Olmg Mg (N03) 2的组合物作为基质校正物。使用“塞曼效应背景”校正系统 和热解石墨包被的THGA管(Perkin Elmer)来进行检测，而Lvov型整合平台用于金属检测。
NH — CH2- C(O) — MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ我们用2. 5% HN03溶液(Spectrascan)作为标准溶液来获得校正曲线上的三个参考点。图1从左至右表示了用rMnSOD引导肽处理多种正常细胞株(MCFlO)和肿瘤细胞 株(MCF7、M1735、MRC5和A2780)的细胞(b)、用与顺钼缀合的引导肽处理细胞(c)和最后 用顺钼单独处理细胞(d)获得结果并与各个未处理对照细胞(a)比较。免疫组织化学反应 表明此种肽自身可穿透肿瘤细胞而不损伤细胞，而与顺钼缀合的肽在仅三个小时的孵育后 产生了很强的细胞凋亡反应。从以下表1中可看出，rMnSOD弓丨导肽可转运至细胞中的顺钼的量是单独添加顺钼 至肿瘤细胞时进入细胞的顺钼的量的两倍。表 1通过rMnSOD引导肽转运至肿瘤细胞中的顺钼量(通过原子吸收法定量)
权利要求
1.含有序列MLSRAVC(SEQ2)的肽作为靶向癌细胞的载体的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述肽具有MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1)序列。
3.由序列MLSRAVC(SEQ2)组成的肽作为靶向癌细胞的载体的用途。
4.肽，其具有以下序列MLSRAVC(SEQ2)。
5.肽，其具有序列CMLSRAVC(SEQ3)和CLSRAVC(SEQ 4)，其中两个末端半胱氨酸通过 一个二硫桥连接在一起。
6.缀合物，所述缀合物包含序列为MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ(SEQ 1)的肽或权利要 求4和5所述的肽，以及具有能够与放射性同位素、染料结合的螯合基团的分子、具有细胞 生长抑制性质的分子、具有酶活性的分子、反义寡核苷酸。
7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述具有螯合基团的分子是D0TA、DTPA、N0TA、 HYNIC。
8.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述染料是荧光素或若丹明。
9.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述具有细胞生长抑制性质的分子选自顺钼、 紫杉酚、表阿霉素。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述具有细胞生长抑制性质的分子是顺钼。
11.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述具有酶活性的分子是能够阻止有丝分裂 信号转导的激酶抑制剂。
12.根据权利要求6至8中任一权利要求所述的缀合物作为诊断试剂的用途。
13.根据权利要求6至11中任一权利要求所述的缀合物用于制备治疗肿瘤疾病的药学 组合物的用途。
14.由rMnSOD-Lp-CC复合物组成的缀合物，其可能与DOTA结合，其与生物多聚物或脂 质体缀合。
15.rMnSOD-Lp-CC缀合物的控释制剂，所述制剂包含生物可降解材料制备的微球体，其 中装载有所述缀合物。
16.根据权利要求14所述的制剂，其中所述生物可降解材料选自透明质酸、PEG、聚乳 酸-乙醇酸共聚物和其他已在制药领域完善使用的生物可降解和生物相容的共聚物。
17.根据权利要求14所述的缀合物作为纳米技术方法的分子载体的用途。
18.rMnSOD-Lp-CC缀合物用于抗肿瘤治疗活动中预测性诊断剂的用途。
19.rMnSOD-Lp-CC缀合物用于确定肿瘤的雌二醇受体的表达程度的用途。
全文摘要
本发明描述了肽作为将分子或放射性同位素转运至癌细胞中的载体的用途；还描述了所述肽的变体以及它们的用途。
文档编号A61K47/48GK102105172SQ200980125779
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月8日 优先权日2008年7月8日
发明者奥尔多·曼奇尼 申请人:高级催化剂应用品有限公司