专利名称：抗-hepcidin-25选择性抗体及其用途的制作方法
抗-HEPCIDIN-25选择性抗体及其用途本发明属于医药领域，特别是抗人hepcidin-25的抗体的领域。更特别的，本发明 涉及一些疾病的治疗，例如贫血，通过向需要其的患者施用抗hepcidin-25选择性抗体。本 发明还涉及检测h印cidin-25和/或诊断以升高的h印cidin-25水平为特征的疾病病况的 方法和试剂盒，。人h印cidin，是主要由肝细胞表达的多肽，被认为是重要的铁调控蛋白，其负调控 肠的铁吸收、巨噬细胞的铁再循环和从肝铁储藏中的铁移动。过量产生hepcidin表现出在 贫血和/或慢性疾病贫血的病理生理学中扮演主要角色。目前，贫血和/或慢性疾病贫血的合适且有效的疗法是有限的。尤其是促红细胞 生成素施用仅对所有患者的约50%有效，并与不理想的副作用相关联。此外，由于污染、感 染和铁过载，输血也是不理想的。人h印cidin编码为84个氨基酸的前原肽(pr印rop印tide)，含有典型的N端 24个氨基酸的内质网靶向信号序列和35个氨基酸的原区(proregion)，所述原区具有共 同的弗林蛋白酶(furin)切割位点，其后紧接着C端25个氨基酸的生物学活性铁调控激 素(hepcidin-25, SEQ IDNO :1)。各种N端截短形式的h印cidin，例如h印cidin-20 (例 如，对于人，SEQ ID NO 1的氨基酸6-25)和h印cidin-22 (例如，对于人，SEQ IDNO 1的 氨基酸4-25)也是已知在体内形成的。然而，即使不是唯一，h印cidin-25被认为是与人 中的h印cidin生理学最相关的形式。选择性调控h印cidin-25而非其前体或截短形式的 浓度的疗法是特别理想的。特别的是，选择性结合h印cidin-25而非其前体或截短形式的 抗体将为与升高的hepcidin-25水平相关的病症的治疗或诊断提供多种优势。例如，与 非选择性的h印cidin抗体相比，高亲和力的h印cidin-25选择性抗体将降低副作用的风 险，且有效治疗所需的临床剂量较低，因为治疗性抗体将不结合h印cidin的生理学相关形 式。尽管之前已报道过针对hepcidin的非人多克隆和单克隆抗体(参见例如，美国专利申 请公开2006/0019339、2007/0224186和2008/0213277)，本领域仍然极其需要选择性结合 hepcidin-25的单克隆抗体。因此，本发明的一个方面是提供了与人h印cidin-25选择性的 结合在h印cidin-25的氨基酸1_7(含端点)中的抗体。此类抗体可用于在人中增加血清 铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容，用于治疗疾病、病况或 病症，例如贫血。另外，对h印cidin的现有免疫测定不区分活性的、生理学相关的h印cidin-25与 无活性的、生理学不相关的h印cidin种类(参见例如，Kemna, E. H.等人，Haematologica, 93(1) 90-7(2008) ；Roe Μ. A.等人，Br J Nutr.，97 :544_9 (2007)；和 Luukkonen S.和 Punnonen K.，Clin Chem Lab Med.，44 1361-2 (2006))。目前，目前可获得的选择性测 定h印cidin-25的唯一方法涉及LC/MS(液相色谱/质谱)或类似的繁琐方法，所述方法 需要分离不同类型的h印cidin(参见例如，Gutierrez, J. Α.等人，BioTechniques, 38 S13-S17(2005) ；Murphy 等人，Blood, 110 1048-54(2007)和 Kemna, E. H.等人，Clin. Chem. ,53 :620_8 (2007))。虽然这些测定可以是准确和精准的，它们的复杂性、昂贵和需要 高水平的操作专家妨碍了它们的常规应用。因此，出于在检测或测量hepcidin-25的免疫测定中的应用，还极其需要以高亲和力选择性结合人hepcidin-25的抗体。因此，本发明的 另一个方面提供了在相对简单但仍高敏感、强效且选择性的免疫测定中使用hepcidin-25 选择性抗体的方法，用于在哺乳动物组织和生物学流体中检测和测量hepcidin-25。本发明提供了在h印cidin-25的氨基酸1_7 (含端点)中选择性的结合人 h印cidin-25的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体选择性的结合具有SEQ ID NO 1 显示的氨基酸序列的多肽，而非相关的前体和截短的多肽，并包括选自以下的6个CDR (i) 分别具有SEQ ID NOs :9、10、11、32、33和34所示的氨基酸序列的LCDRU LCDR2、LCDR3、 HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (ii)分别具有 SEQ ID NOs :12、13、14、35、36 和 37 所示的氨基酸 序列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (iii)分别具有 SEQ ID NOs :45、13、 14、35、36 和 37 所示的氨基酸序列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (iv) 分别具有SEQ ID NOs :12、13、14、38、36和37所示的氨基酸序列的LCDRU LCDR2、LCDR3、 HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (ν)分别具有 SEQ ID NOs 15、10、16、39、40 和 41 所示的氨基酸序 列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRU HCDR2 和 HCDR3 ； (vi)分别具有 SEQ ID NOs :20、21、22、 42、43 和 44 所示的氨基酸序列的 LCDRl、LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ； (vii)分别 具有 SEQ IDNOs 20、21、23、42、43 和 44 所示的氨基酸序列的 LCDRl、LCDR2、LCDR3、HCDRl、 HCDR2和HCDR3 ； (viii)分别具有SEQ ID NOs :24、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的 LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 ； (ix)分别具有 SEQ ID NOs :26、25、27、42、43 和44所示的氨基酸序列的LCDRl、LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2和HCDR3 ；和(χ)分别具有 SEQ ID NOs :26、25、28、42、43和44所示的氨基酸序列的1^0 1丄0)1 2丄0)1 3、!10)1 1、!10)1 2 和 HCDR3。在另一个实施方案中，本发明的抗体结合在包含在人hepcidin-25的氨基 酸1-7 (含端点)中所含表位的抗体，即，SEQ ID NO 1的DTHFPIC或啮齿类动物 hepcidin-25 (SEQ ID NO :2或3)的DTNFPIC。优选的，本发明的抗体包含轻链可变区 (“LCVR”)多肽和重链可变区(“HCVR”)多肽，其中(i) LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQ ID NOs 48和49显示的氨基酸序列；(ii) LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQ ID NOs 50和 51显示的氨基酸序列；(iii) LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQID NOs :52禾口 51显示的氨 基酸序列；(iv) LCVR和HCVR分别具有如SEQ ID NOs :53和54显示的氨基酸序列；(v) LCVR 和HCVR分别具有如SEQ ID NOs 55和56显示的氨基酸序列；(vi) LCVR和HCVR分别具有 如SEQ ID NOs 59和58显示的氨基酸序列；(vii) LCVR和HCVR分别具有如SEQ ID NOs 60 和58显示的氨基酸序列；(viii) LCVR和HCVR分别具有如SEQ ID NOs 61和58显示的氨 基酸序列；(ix)LCVR和HCVR分别具有如SEQ ID NOs 62和58显示的氨基酸序列；或(χ) LCVR和HCVR分别具有如SEQ ID NOs 63和58显示的氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明提供了编码本发明抗体的分离的核酸分子；包含编码 本发明抗体的核酸分子的载体，所述编码本发明抗体的核酸分子任选的与用载体转化的宿 主细胞识别的控制序列有效连接；包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本发明抗体的 核酸分子；生产本发明抗体的方法，包括培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码本发 明抗体的核酸分子，使得表达核酸，并任选的从宿主细胞培养基中回收抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗体，和可药用 的载体或稀释剂。优选的，药物组合物包含同质的或基本同质的本发明的单克隆抗体的群
7体，以及可药用的载体或稀释剂。在另一个实施方案中，本发明提供了选择性结合成熟的人hepcidin的人工程化 的单克隆抗体，用于治疗。在另一个实施方案中，本发明提供了选择性结合成熟的人hepcidin的人工程化 的单克隆抗体，用于在人对象中治疗或预防贫血。本发明还涉及选择性结合成熟的人h印cidin的人工程化的单克隆抗体的用途， 用于制备药物。本发明还涉及选择性结合成熟的人h印cidin的人工程化的单克隆抗体在 这样的方法中的用途，所述方法用于在动物中，优选的在哺乳动物物种中，更优选的在人对 象中增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容。本发明还提供了增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或 血细胞比容的方法，包括向需要其的人对象施用有效量的结合成熟的人h印cidin的人工 程化的单克隆抗体。本发明的另一个实施方案提供了在人对象中治疗疾病、病况或病症的方法，所述 疾病、病况或病症受益于增加的血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/ 或血细胞比容，包括但不限于贫血，例如由感染、炎症、慢性疾病和/或癌症导致的贫血。本发明还提供了测量从哺乳动物中获得的组织或生物学流体的样品中的 hepcidin-25的量的方法，所述方法包括步骤(i)从所述哺乳动物获得组织或生物学流体 的样品；(ii)使所述样品与h印cidin-25选择性抗体或其片段接触；和(iii)通过定量、半 定量或定性的方式直接或间接的检测所述样品中的hepcidin-25的量。在另一个实施方案中，本发明的抗体可用于定量从哺乳动物中获得的组织或生物 学流体的样品中的h印cidin-25的量，包括(i)用与包含在SEQ ID NO =USEQ ID N0:3(小 鼠5-25)或SEQ ID NO :2(大鼠5_25)的氨基酸5_25 (含端点)中所含的表位结合的第一种 抗体包被固体支持物；(ii)从所述哺乳动物获得组织或生物学流体的测试样品；(iii)将 测试样品应用到抗体包被的固体支持物上；(iii)在对于hepcidin-第一种抗体结合合适 的条件下，允许任何存在的h印cidin形成h印cidin-第一种抗体复合体；(iv)去除未结合 的样品；(ν)向固体支持物应用与在人或啮齿类hepcidin-25的氨基酸1-7(含端点)中所 含的表位(即，分别是DTHFPIC或DTNFPIC)结合的第二种抗体；(vi)在对于第二种抗体结 合任何h印cidin-25-第一种抗体复合体合适的条件下，允许任何存在的h印cidin-25形成 第二种抗体_h印cidin-25-第一种抗体复合体；以及(ν)去除未结合的第二种抗体；(vi) 和检测第二种抗体的存在或缺失。可以直接或间接的检测第二种抗体的存在或缺失，并可 以对其定量、半定量或定性的测量。
附图简介
图1描述了用抗h印Cidin-25选择性Mab 3. 23从人血清中免疫沉淀的人 h印cidin形式的MALDI-T0F质谱。信号1具有与完整的人h印cidin-25 (近似分子量(MW) 为2790道尔顿(Da))预期质量相符的质量。信号2具有与完整的人h印cidin-20 (MW 为2192Da)预期质量相符的质量。如色谱显示，抗h印Cidin-25Mab 3.23与可检测的 量的h印cidin-25结合，并与更少的量的h印cidin-20结合。Mab 3. 23没有表现出与 hepcidin-22(MW 2436Da)、h印cidin-24 (MW 2674Da)或原 _h印cidin (MW 6929Da)可检测的水平结合。使用阳离子、线性模式方法，在MALDI-T0F质谱仪上产生质谱，所述方法基本 如下文实施例6所述，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(肽基质)作为样品基质。图2描述了图1所示质谱在相关区域(MW 2000-3000Da)中的放大图像。如色谱 显示，Mab 3. 23结合h印cidin-25(信号1)，且以更低的程度结合h印cidin-20 (信号2)。 抗 h印cidin 选择性 Mab 3. 23 没有表现出与 h印cidin-22 (MW 2436Da)或 h印cidin-24 (MW 2674Da)可检测的水平结合。图3描述了用抗h印cidin-25选择性Mab 5E8从人血清中免疫沉淀的人h印cidin 形式的MALDI-T0F质谱。信号1具有与完整的人h印Cidin-25(2790Da)预期质量相符的质 量。如色谱显示，抗h印Cidin-25Mab 5E8仅与可检测的量的h印cidin-25结合。使用阳离 子、线性模式方法，在MALDI-T0F质谱仪上产生质谱，所述方法基本如下文实施例6所述，使 用α-氰基-4-羟基肉桂酸(肽基质)作为样品基质。图4描述了图3所示质谱在相关区域(MW 2000-3000Da)的放大图像。如色谱显 示，Mab 5E8结合可检测的量的h印cidin-25 (信号1)。Mab 5E8没有结合可检测的水平 的11印(^乜11-20(丽为21920&)、11印(^乜11-22(丽 2436Da)、h印cidin-24 (MW 2674Da)或 原-h印cidin(MW 6929Da)。图5显示了通过梯度稀释合成的h印cidin_25(实心圆)产生的h印cidin-25 的校准曲线的图，起自10yg/L(10ng/mL)的浓度，并如实施例8描述的进行MSD免疫测 定。MSD免疫测定是对h印cidin-25特异性的，且不识别h印cidin-20 (实心三角)或 h印cidin-22 (空心圆)。本文使用下列缩写ACN:乙腈；BSA:牛血清白蛋白；DTT 二硫苏糖醇；EDTA 乙 二胺四乙酸；ELISA 酶联免疫吸附测定；IMAC 固定的金属-亲和层析；IPTG 异丙基 β -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷；Mab 单克隆抗体；Mabs 单克隆抗体(复数)；MALDI-T0F 基质相关的激光解吸离子化飞行时间；PBS 磷酸缓冲盐溶液；sra 表面等离振子共振； TFA 三氟乙酸。该公开文本中使用的所有氨基酸缩写都是美国专利商标局接受的，如37C. F. R. § 1.822(B) (2)中所述。本发明提供了通过靶向包含在h印cidin-25的氨基酸1-7 (含端点)中的表位，来 选择性结合h印cidin-25的抗体。此类抗体可用于在人中增加血清铁水平、网织红细胞计 数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容，用于治疗疾病、病况或病症，例如贫血。此外， 本发明提供了在相对简单但仍高敏感和选择性免疫测定中使用此类抗体的方法，用于在哺 乳动物组织和生物学流体中检测和/或测量hepcidin-25。当在本文中使用时，术语“hepcidin”指已知存在于哺乳动物中的任何形式的 h印cidin蛋白。当在本文中使用时，术语“成熟的h印cidin”指在哺乳动物中表达的任何 成熟的、生物活性形式的h印cidin蛋白。当在本文中使用时，术语“人h印cidin”指存在于 人中的任何形式的h印cidin蛋白。当在本文中使用时，术语“人h印cidin-25”指具有如 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的成熟形式的人h印cidin。抗体的一般结构是本领域普遍已知的。对于IgG类型的抗体，存在通过链内和链 间二硫键交联的4条氨基酸链(2条“重”链和2条“轻”链)。当在一些生物系统中表达 时，具有未修饰的人Fc序列的抗体在Fc区域是糖基化的。抗体可以在其它位置也是糖基 化的。抗体的亚基结构和三维构象是本领域普遍已知的。每条重链包含N端重链可变区(“HCVR”)和重链恒定区(“HCCR”)。IgG、IgD和IgA的重链恒定区包括3个结构域(CHl、 CH2和CH3) ；IgM和IgE包括4个结构域(CHI、CH2、CH3和CH4)。各轻链包含轻链可变区 (本文中“LCVR”)和轻链恒定区(本文中“LCCR”)。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。HCVR和LCVR区可以进一步细分为高 变区，名为互补决定区(CDR)，其中散布着更保守的区域，名为框架区(FR)。各HCVR和LCVR 包含3个CDR和4个FR,从氨基端至羧基端以下列顺序排列=FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、 ⑶R3、FR4。在本文中，重链的3个⑶R被称为“⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3”，而轻链的3个CDR 被称为“⑶RL1、⑶RL2和⑶RLH3”。⑶R含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。根 据普遍已知的常规安排每个结构域的氨基酸(例如，Kabat，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。本发明的抗体可以具有选自任何免疫球蛋白类别(IgA、IgD、IgG、IgM和IgE)的 重链恒定区。优选的，本发明的抗体含有源自人或小鼠IgGFc区的恒定区。术语“单克隆抗体”指源自单拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核的、原核的或 噬菌体克隆，而不指生产抗体的方法。优选的，本发明的单克隆抗体以同质的或基本同质的 群体存在。本发明的抗体可以是完整的，即包括完整的或全长的恒定区(包括Fc区)，或者 是此类抗体的部分或片段，只要任何缩短的形式包含抗原结合部分且保留了抗原结合能 力。此类缩短的形式包括例如Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段，所述片段包括所公开 的抗h印cidin-25选择性抗体的⑶R或可变区。此外，此类缩短的抗体形式可以是单链 Fv片段，所述片段可以通过将编码LCVR和HCVR的DNA与接头序列连接来生产。(参见， Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编著，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994)。不论是否说明了片段或部分，除 非另外指出，本文使用的术语“抗体”包括此类片段或部分以及单链形式。只要蛋白质部分 或蛋白质片段保留了选择性结合h印cidin-25且在体内或体外中和一种或多种哺乳动物 hepcidin-25的生物活性特征的能力，它就包含在术语“抗体”中。可以使用本领域普遍已知的技术生产本发明的抗体，例如重组技术、噬菌体展示 技术、合成技术或此类技术的组合，或本领域容易已知的其它技术(参见例如，Jayasena, S. D. , Clin. Chem.，45 1628-50 (1999)和 Fellouse, F. A.等人，J. Mol. Biol. ,373(4) 924-40(2007))。下表1和2描述了用于本发明抗体的优选的⑶R。表 权利要求
1.单克隆抗体，如通过25°c下Sra所确定的，所述抗体以在约50nM和约SOOpM之间的 Kd结合由SEQ ID NO 1显示的氨基酸序列组成的人h印cidin_25。
2.权利要求1的抗体，其中如通过25°C下Sra所确定的，所述抗体以下述Kd结合 原-h印cidin和人h印cidin-20，其中所述Kd比抗体结合人h印cidin-25的Kd至少高约10倍。
3.权利要求1的抗体，其中如通过25°C下Sra所确定的，所述抗体以下述Kd结合 原-h印cidin和人h印cidin-20，其中所述Kd比抗体结合人h印cidin-25的Kd至少高50倍。
4.权利要求1的抗体，其中如通过25°C下Sra所确定的，所述抗体以下述Kd结合 原-h印cidin和人h印cidin-20，其中所述Kd比抗体结合人h印cidin-25的Kd至少高100倍。
5 权利要求1-4的任一项的抗体，其中如通过25°C下SI3R所确定的，所述抗体结合人 hepcidin-22 的 Kd 大于约 200nM。
6.权利要求1-5的任一项的抗体，如通过25°C下SI3R所确定的，所述抗体还以下述Kd 结合小鼠和/或大鼠h印cidin-25 (分别是SEQ ID NO :3或4)，所述Kd低于约500nM。
7.权利要求1-6的任一项的抗体，其包括选自以下的6个⑶R⑴分别具有SEQ ID NOs :9、10、11、32、33和；34所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ii)分别具有SEQID NOs :12、13、14、35、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iii)分别具有SEQ ID NOs :45、13、14、35、36和 37所示的氨基酸序列的 LCDI 1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iv)分别具有SEQID NOs :12、13、14、38、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(ν)分别具有SEQ ID NOs :15、10、16、39、40和41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(vi)分别具有SEQID NOs :20、21、22、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(vii)分别具有SEQID NOs :20、21、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(viii)分别具有SEQID NOs :24、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、 LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ix)分别具有SEQID NOs J6、25、27、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；禾口(χ)分别具有SEQ ID NOs J6、25J8、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。
8.选择性结合h印cidin-25的单克隆抗体，其包括选自以下的6个⑶R⑴分别具有SEQ ID而8:9、10、11、32、33和；34所示的氨基酸序列的^1 1、1^0)1 2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ii)分别具有SEQID NOs :12、13、14、35、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(iii)分别具有SEQID NOs :45、13、14、35、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iv)分别具有SEQID NOs :12、13、14、38、36和37所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ν)分别具有SEQ ID NOs :15、10、16、39、40和41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(vi)分别具有SEQID NOs :20、21、22、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(vii)分别具有SEQID NOs :20、21、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(viii)分别具有SEQID NOs :M、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、 LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ix)分别具有SEQID NOs :26、25、27、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；禾口(χ)分别具有SEQ ID NOs :26,25,28,42,43和44所示的氨基酸序列的LCDRl、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。
9.权利要求1-8的任一项的抗体，其是人工程化的单克隆抗体。
10.权利要求1-9的任一项的抗体，其中单克隆抗体是片段。
11.单克隆抗体，所述抗体包括轻链可变区(LCVI )多肽和重链可变区(HCVI )多肽，其中(i)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQID NOs 48和49显示的氨基酸序列；(ii)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQID NOs 50和51显示的氨基酸序列；(iii)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQ ID NOs 52和51显示的氨基酸序列；(iv)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQ ID NOs 53和M显示的氨基酸序列；(v)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQID NOs 55和56显示的氨基酸序列；(vi)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQID NOs 59和58显示的氨基酸序列；(vii)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQID NOs 60和58显示的氨基酸序列；(viii)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQID NOs 61和58显示的氨基酸序列；(ix)LCVR和HCVR多肽分别具有如SEQ ID NOs 62和58显示的氨基酸序列；或(x)LCVR和HCVR分别具有如SEQID NOs 63和58显示的氨基酸序列。
12.药物组合物，其包含权利要求1-11的任一项的抗体组合一种或多种可药用的载 体、稀释剂或赋形剂。
13.权利要求1-11的任一项的抗体用于治疗中的用途。
14.权利要求1-11的任一项的抗体在制备治疗贫血的药物中的用途。
15.权利要求1-11的任一项的单克隆抗体，其用于在人对象中增加血清铁水平、网织 红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的方法中。
16.权利要求1-11的任一项的抗体在制备在人对象中增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的药物中的用途。
17.权利要求1-11的任一项的抗体，其用于在人对象中增加血清铁水平、网织红细胞 计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的方法中。
18.增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的方 法，其包括向人对象施用有效量的权利要求1-11的任一项的抗体。
19.在需要其的人对象中治疗贫血的方法，其包括向人对象施用有效量的权利要求 1-11的任一项的抗体。
20.测量组织或生物学流体的样品中的hepcidin-25的量的方法，所述方法包括步骤(i)获得组织或生物学流体的样品；(ii)使样品与抗体或其片段接触，如通过25°c下sra所确定的，所述抗体或其片段以 在约50nM和约800pM之间的Kd与包含在SEQ IDNO 1的氨基酸1_7 (含端点)中所含的表 位结合，并以至少高约10倍的Kd与原-h印cidin和人h印cidin-20结合；和(iii)定量、半定量或定性的检测所述样品中与抗体或片段结合的hepcidin-25的量。
21.权利要求20的方法，其中如通过25°C下Sra所确定的，抗体或抗体片段进一步以 大于约200nM的KD结合人h印cidin_22。
22.定量组织或生物学流体的样品中的h印cidin-25蛋白质的量的方法，其包括(i)用与(a)包含在SEQID NO=I的氨基酸1_7(含端点)中所含的表位，或(b)包含 在SEQ ID N0:1的氨基酸5-25(含端点)中所含的表位结合的第一种抗体包被固体支持 物；( )将样品应用到所述抗体包被的固体支持物上；(iii)去除未结合的样品；(iv)如果第一种抗体结合表位(a)，则向固体支持物应用与表位(b)结合的第二种抗 体，或者如果第一种抗体结合表位(b)，则向固体支持物应用与表位(a)结合的第二种抗 体；(ν)去除未结合的第二种抗体；和(vi)定量、半定量或定性的检测所述样品中与第二种抗体结合的hepcidin-25的量。
23.权利要求22的方法，其中结合表位(a)的抗体进一步包括选自以下的6个CDR⑴分别具有SEQ ID NOs :20、21、22、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ii)分别具有SEQID NOs :20、21、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3；(iii)分别具有SEQID NOs :24、25、23、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(iv)分别具有SEQID NOs :26、25、27、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3 ；(ν)分别具有SEQ ID NOs J6、25J8、42、43和44所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、 LCDR3、HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。
24.权利要求22-23的任一项的方法，其中结合表位(a)的抗体包括选自以下的LCVR 禾口 HCVR ⑴分别具有如SEQ ID NOs 59和58显示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ；(ii)分别具有如SEQID NOs 60和58显示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ；(iii)分别具有如SEQID NOs 61和58显示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ；(iv)分别具有如SEQID NOs 62和58显示的氨基酸序列的LCVR和HCVR ； (ν)分别具有如SEQ ID NOs 63和58显示的氨基酸序列的LCVR和HCVR。
25.权利要求22-M的任一项的方法，其中结合表位(a)的抗体选自Mab5E8、Mab 0B1、 Mab 0B3、Mab 0H4 禾口 Mab OE1。
26.权利要求22-25的任一项的方法，其中结合表位(b)的抗体包括具有如SEQID NOs 82和83显示的氨基酸序列的LCVR和HCVR。
27.权利要求22-25的任一项的方法，其中结合表位(b)的抗体包括具有如SEQID NOs 84和85显示的氨基酸序列的LCVR和HCVR。
28.权利要求22-27的任一项的方法，其中仅第一种或第二种抗体用可检测的部分标记。
29.权利要求20-28的任一项的方法，其中所述检测是间接的。
30.权利要求20-29的任一项的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清、尿、脑脊液 (CSF)、羊膜液、唾液、汗、腹水(ascite fluid)、淋巴、囊液(cyst fluid)、乳汁、创伤渗液 (wound fluid)或源自上述的，且其中所述样品在酶免疫测定(EIA)、ELISA、夹心ELISA测 定、放射性免疫测定、沉淀反应或荧光免疫测定中与所述抗体或其片段相接触。
31.用于检测或定量hepcidin-25的试剂盒，其包括权利要求1_11的任一项的抗体。
全文摘要
提供了与人hepcidin-25的N端结合的单克隆抗体，特征是具有对多肽的高亲和力和选择性。本发明的抗体可用于在人中增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容，和用于在人对象中治疗多种病症，例如贫血。本发明的抗体还可用作分析工具，例如在夹心ELISA中。
文档编号A61K39/395GK102112489SQ200980129864
公开日2011年6月29日 申请日期2009年7月29日 优先权日2008年8月6日
发明者D·D·M·梁, D·R·威彻, P·P·亚齐, 唐鹰, 栾鹏 申请人:伊莱利利公司