用apoe肽治疗癌症的方法

专利名称：用apoe肽治疗癌症的方法
技术领域：
本发明涉及通过施用至少一种衍生自载脂蛋白E(ApoE)的肽治疗癌症的方法。施 用ApoE肽诱导肿瘤细胞的细胞凋亡并减少肿瘤形成、肿瘤生长和肿瘤细胞的扩散。具体而 言，描述了治疗多种类型白血病和乳腺癌的方法。
背景技术：
癌症是其中一组细胞呈现不受控制的生长，侵袭并破坏邻近组织，以及转移(异 常细胞扩散至身体的其他部位的扩散)，或者其中细胞无法在合适的时间进行程序性细胞 死亡(例如，细胞凋亡)的一类疾病。癌症造成所有死亡的约13%，且根据美国癌症协会 (American Cancer Society)，在2007年全世界有760万人死于癌症。目前对癌症的治疗 取决于具体的癌症类型和涉及的组织，包括手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法和单克隆 抗体疗法以及其他疗法。尽管这些治疗方法在一些情况下取得了成功，但是其受到有害副 作用或有限效力所妨碍。例如，通过手术移除肿瘤来消除癌组织的效力常常受限于癌症侵 袭邻近组织并转移至身体其他位点的倾向。化学疗法，以及放射疗法，常常受限于对身体其 他组织的毒性和损害。因此，癌症仍然是主要的健康忧虑(health concern)，且需要改进的 治疗癌症的方法。在美国对于男性和女性的两种最常见的致命癌症分别是白血病和乳腺癌。有四个 基本类别的白血病急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴 细胞性白血病(CLL)以及慢性髓细胞性白血病(CML)。CLL是西方世界最常见的白血病，在 7个最大的工业化国家中有接近84，000个病例。CLL是一种恶性病状，其主要由称作细胞 凋亡的程序性细胞死亡过程中的缺陷导致。作为失调的(dysregulated)细胞凋亡的结果， 容易在制备血涂片时破坏的成熟单核B细胞在血中累积(Rozman等(1995)N. Engl. J. Med.， Vol. 333 :1052-1057)。在CLL中，恶性细胞为特征为表达大部分成熟B细胞呈递的表面标 记而具有一些次要的异质性的小B淋巴细胞(Caligaris-Cappio和Janossy (198 kmin Hematol.，Vol. 22 :1-12)。恶性CLL细胞最显著的表型特征是实质上无法检测量的单克隆 表面免疫球蛋白和⑶5的表达，其为通常见于成熟T细胞但不见于成熟B细胞的表面标记 (Boumsell 等(1978)Eur. J. Immunol. ,Vol. 8 :900-904 ；Ternynck 等(1974)Blood，Vol. 43 789-7%)。CLL的临床进程是异质的，其中一些患者可能遭受需要加强治疗(intensive treatment)的攻击性的进程，而另一些可能经历较长的存活而从头到尾无需治疗。该疾病 是进行性的，因为恶性克隆获得顺次遗传异常，其进行性地增加其恶性表现。CLL在较老的 男性中最为流行，且其诊断时的中位年龄为64岁。值得注意的是，CLL是唯一的不与暴露 于电离辐射或化学品相关的成人白血病，且其并不在罹患免疫缺陷综合征的患者中以更高频率发生。CML在世界范围影响约15，000位患者，且其为具有两个不同期的多能性造血干细 胞的病症。延长的骨髓增生慢性期继以迅速地致命性原始细胞危象。在CML中，染色体移 位导致BCR蛋白和Abl激酶之间的融合的产生，其导致Abl的组成型激活。该Abl的组成型 激活显示足以诱导慢性期的CML。尽管在引入Gleevec和其他BCR/Abl抑制剂之后对CML 的治疗取得进展，但是近来报道了 Gleevec抗性的CML而愈发可虑。考虑到对于每种具体类型癌症的不同治疗的数目以及上述治疗潜在的严重副作 用，对于开发对于超过一种类型的癌症有效并不导致对健康组织不受欢迎的毒性或损伤的 新的癌症治疗法存在需求。

发明内容
本发明基于ApoE肽可用于治疗癌症的发现。因此，本发明提供了在有所需要的受 试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的至少一种ApoE肽。在一个实施方 案中，所述ApoE肽的施用减少了受试者中肿瘤的形成。在另一个实施方案中，所述ApoE肽 的施用减少了受试者中肿瘤的大小。在另一个实施方案中，所述ApoE肽的施用在受试者中 诱导癌细胞的细胞凋亡。还在另一个实施方案中，所述ApoE肽的施用在受试者中减少了癌 细胞扩散至健康组织。所述ApoE肽可含有十个或更多天然ApoE全蛋白质的残基。在本发明的一个实 施方案中，所述ApoE肽是C0G133(SEQ ID NO :1)。在另一个实施方案中，所述ApoE肽是 COGl 12 (SEQ ID NO 2)或C0G068 (SEQ ID NO :8)。还在另一个实施方案中，所述ApoE肽是 C0G133 衍生物如 C0G1410(SEQ IDNO :4)或 COG;345 (SEQ ID NO :6)。其他可用于本发明的 ApoE肽描述于美国申请公开2009/0042783A1号中，其以全文提述的方式并入本文。在一个实施方案中，所述ApoE肽可含有SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 4或任何描述于美国申请公开2009/0042783A1号中的衍生物，其在N-端或C-端或N-端以 及C-端连接于一至五个其他氨基酸或氨基酸类似物，其中上述其他氨基酸并不有害地影 响所述肽的活性。所述含有SEQ IDNO :1或SEQ ID NO 2的ApoE肽或其他ApoE衍生的肽 可含有12或更多个氨基酸，13或更多个氨基酸，14或更多个氨基酸，15或更多个氨基酸， 16或更多个氨基酸，17或更多个氨基酸，18或更多个氨基酸，19或更多个氨基酸，20或更多 个氨基酸，25或更多个氨基酸，30或更多个氨基酸，35或更多个氨基酸或40或更多个氨基 酸。在一些实施方案中，所述ApoE肽基本上由SEQ IDNO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4 组成。在其他实施方案中，所述ApoE肽偶合于蛋白质转导域以促进对细胞的穿透。所述蛋 白质转导域可包括衍生自触角蛋白(antermapedia)、TAT、SynBl、SynB3、SynB5和聚精氨酸 的肽。本发明还涵盖了在有所需要的受试者中通过施用有效量的至少一种ApoE肽来治 疗白血病的方法。在一个实施方案中，所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在另 一个实施方案中，所述白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。在一些实施方案中，所述ApoE 肽的施用可在受试者中减少CD5+B细胞的数量。在其他实施方案中，所述ApoE肽的施用可 减少受试者中BCR/ABL+细胞的生长。在某些实施方案中，所述ApoE肽的施用可减少受试 者中伊马替尼(imatinib)或达沙替尼(dasatinib)-抗性BCR/ABL+细胞的生长。
本发明还涵盖了在有所需要的受试者中治疗乳腺癌的方法。在一个实施方案中， 所述方法包括向受试者施用有效量的至少一种ApoE肽。在另一个实施方案中，所述乳腺癌 以Her2表达为特征。在另一个实施方案中，所述乳腺癌以雌激素受体表达为特征。附图简述

图1.在多种形式的癌症中异常信号传导级联的概图(A) PI-3激酶-Akt信号传导 级联的作用过度产生慢性髓细胞性白血病(CML)和乳腺癌中的持久的抗细胞凋亡状态。由 异常受体激酶如BCR/Abl和Her2/NeU产生的该途径的组成型激活导致Akt激酶持久的磷 酸化和激活。然后激活的Akt可磷酸化促细胞凋亡蛋白质(以绿色显示)，包括胱天蛋白 酶-9和Bad，导致其失活。激活的Akt还激活I κ K，导致NF κ B转录活性的激活，其导致抗 细胞凋亡蛋白Al，Bcl-xL和诱导型一氧化氮合酶(以红色显示)的表达。PP2A的激活，例 如通过用ApoE肽的处理，通过直接将Akt、I κ K和Bad脱磷酸化而逆转了该信号传导途径 的组成型激活。(B)B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的TCLl-Akt信号传导途径。生 长和存活因子通过其受体激活PI-3激酶。PI-I磷酸化位于质膜上的磷脂，诱导Akt激酶 移位至膜上，于此其在Thr308和kr473受磷酸化，由此激活该激酶。TCL1，其在CLL中的成 熟B细胞中过表达，结合Akt激酶，进一步增加其激酶活性。TCLl的过表达(如在CLL中) 增加了 Akt靶的磷酸化水平，导致对细胞凋亡的抗性和细胞存活的增加。图2. COG肽抑制Akt/NF κ B信号传导级联的激活。㈧将BV2小神经胶质细胞在 6-孔板中在5μ M C0G133存在下用100ng/ml LPS处理。收获细胞，将其在Laemmli样品缓 冲液中裂解，在10%聚丙烯酰胺凝胶上运行，并在硝酸纤维素上进行Western印迹。用抗磷 酸-ΙκΒα抗体或同种抗ΙκΒα抗体探测印迹。⑶通过裂解来自受刺激的BV2小神经胶 质细胞的分离的核并用32Ρ末端标记的结合κ B的寡核苷酸温育并在聚丙烯酰胺凝胶上运 行来监视NFk B的核易位。将凝胶干燥并对X射线胶片曝光。箭头表示NFK B的位置。(C) 对探测从仅用LPS或在C0G112肽存在下刺激的小胶质细胞分离的磷酸-Akt激酶和肌动蛋 白的Western印迹的光密度分析。将来自磷酸化的Akt激酶的信号针对肌动蛋白信号标准 化。探测磷酸-Akt激酶的代表图示于条形图之下。(D)在COGl 12肽存在(实心方块)或 不存在(空心方块)下将YAMC细胞暴露于啮齿类柠檬酸杆菌(C. rodentium)。通过ELISA 测定法在受刺激的细胞的细胞裂解液中在指明的时间测量I κ K活性。O时点代表未经啮齿 类柠檬酸杆菌刺激的细胞。§ ρ < 0. 05，§ §对于仅啮齿类柠檬酸杆菌，ρ < 0. 01 ;n = 3 个单独实验，每个重复进行两次。图3.通过用COGl 12处理激活PP2A。将细胞粗培养物用指明的化合物处理30分 钟，然后在NP40裂解缓冲液中裂解。将PP2A免疫沉淀，并就其活性进行测定。图4. COGl 12对于来自人类患者的CLL或PBMC的剂量应答曲线。CLL细胞分离自 7位CLL患者，而PBMC细胞分离自5个健康患者。分离人CLL细胞和PBMC，并在将其暴露 于多种浓度的C0G112之后就细胞毒性进行测定。图5. C0G112对CLL细胞的细胞凋亡的剂量应答曲线。分离人CLL细胞并将其暴 露于浓度渐增的C0G112。细胞凋亡是通过用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭对细胞进行染色 然后进行流式细胞术分析来测量的。将々皿^111-￥+/碘化丙锭+细胞的百分比针对0 112 浓度作图。使用依托泊苷作为阳性对照。图6. SET在CLL细胞中过表达。对于来自12位CLL患者(CLL)和5位正常患者(PBMC)的细胞样品测量的SET/ β -肌动蛋白比例的散点图显示B-CLL细胞中SET表达的显 著增加。对于SET和β -肌动蛋白代表性的Western印迹描述于该图之下。图 7. COGl 12 对 BCR/ABL+K562CML 细胞的作用。(A) COGl 12 对 K562CML 细胞的剂量 应答曲线。使用伊马替尼作为阳性对照。(B)C0G112和伊马替尼对K562CML细胞生长施加 协同作用。将BCR/Abl+K562CML细胞在所指明的化合物或化合物的组合物存在下生长，并 用锥虫蓝(Trypan Blue)染色。对经锥虫蓝染色的细胞进行计数，并针对其培养时间进行 作图。图8. A.针对未用化合物或用COGl 12以0. 5或1. 0 μ M的剂量处理M小时的Κ562 细胞的磷酸-BCR/ABL的Western印迹分析。B.用指明剂量的COGl 12处理M小时的K562 细胞的PP2A活性。图9. JurkatT细胞白血病细胞在1 μ M COGl 12肽存在或不存在时的生长曲线。发明详述本发明是基于ApoE肽可用于治疗多种形式癌症的发现。因此，本发明提供了通过 将至少一种ApoE肽施用于有所需要的受试者而在该受试者中治疗癌症的方法。ApoE肽，亦称作COG肽，为衍生自天然ApoE全蛋白质的肽。在本发明的一个实施 方案中，所述ApoE肽可包含ApoE的残基133-149。在另一个实施方案中，所述ApoE肽是 C0G133 (LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO :1))。之前证明了 C0G133可用于治疗或减少脑缺血 或脑部炎症。参见2002年9月23日提交的美国专利申请公开No. 2003/0077641A1号，其以 全文提述的方式并入本文。之前构建了大量ApoE 130-150肽的类似物且在抑制炎性细胞 因子和自由基的基于细胞的测定法和受体结合测定法中对其进行了检测。Lynch等Q003) J.Biol. Chem. , Vol. 278 (4) =48529-33以及2002年9月23日提交的美国申请公开系列号 2003/0077641A1 ；2007年4月17日授权的美国专利7，205, 280号；以及1999年3月1日提 交的美国申请系列号09/260，430，其每一个的内容均以全文提述的方式并入本文。可用于 本发明方法中的ApoE肽可为含有十个或更多个来自天然ApoE蛋白的残基的肽的衍生物， 包括具有非天然氨基酸(如氨基异丁酸和乙酰赖氨酸，以及其他增加所述肽α螺旋含量的 修饰)取代的衍生物。例如，适用于本发明方法的ApoE肽衍生物包括但不仅限于LRVRLASH- (We) -LRKLRKRLL-NH2(SEQIDNO
Ac--ASH-Aib-RKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO:17)
Ac--AS-Aib-LRKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO:18)
Ac--D S-Aib-LRKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO:19)
Ac--ASHLRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO:20)
Ac--DR-Aib-ASHLRKLRKR-Aib-L-NH2(SEQIDNO
Ac--DS-Aib-LRKLRKR-Aib-L-NH2(SEQIDNO 22)
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Ac--DS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQIDNO 24)
Ac--DR-Aib-AS-Aib-LRKLRKRLL-NH2(SEQIDNO 25)
Ac--DR-Aib-ASHLRKLRKRLL-NH2(SEQIDNO 26)
Ac--CAS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQIDNO 27)
Ac--DS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQ IDNO:28)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLV-NH2 (SEQ ID NO 29)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLM-NH2(SEQ ID NO 30)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLI-NH2 (SEQ ID NO 31)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLA-NH2(SEQ ID NO 32)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KALL-NH2(SEQ ID NO 33)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(orn)LL-NH2(SEQIDNO:34)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(narg)LL-NH2(SEQIDNO:35)
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Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(dmarg)LL-NH2(SEQIDNO:37)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-ARLL-NH2(SEQ IDNO:38)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-(aclys)RLL-NH2(SEQIDNO:39)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-(azlys)RLL-NH2(SEQIDNO:40)
Ac-ASH-Aib-RKL-Aib-KRLL-NH2(SEQIDNO:41)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRL-(NLe)-NH2(SEQIDNO:42)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KR-(NLe)-L-NH2(SEQIDNO:43)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KR-(NLe) - (NLe)-NH2(SEQIDNO 44)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(orn)L-(NLe)-NH2(SEQIDNO:45)
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Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(orn)-(NLe) - (NLe)-NH2 (SEQIDNO:47)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(harg)L-(NLe)-NH2(SEQIDNO:48)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(harg)-(NLe)-L-NH2(SEQIDNO:49)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(harg)-(NLe) - (NLe)-NH2(SEQIDNO:50)
Ac-AS-Aib-L(orn)KL-Aib-KRLL_NH2(SEQIDNO:51)
Ac-AS-Aib-L(orn)KL-Aib-K(orn)LL-NH2(SEQIDNO 52)
Ac-AS-Aib-L(orn)KL-Aib-KRL-(NLe)-NH2(SEQ IDNO:53)
Ac-AS-Aib-L(orn)KL-Aib-KRL-(NLe) - (NLe)-NH2 (SEQIDNO 54)
Ac-AS-Aib-L(orn)KL-Aib-K(orn)L-(NLe)-NH2 (SEQIDNO 55)
Ac-AS-Aib-L(orn)KL-Aib-K(orn)-(NLe) - (NLe)-NH2(SEQIDNO 56)
Ac-ASHLRKLRKRLL-NH2(apoel38_149)(SEQIDNO:57)
Ac-ASHCRKLCKRLL-NH2(SEQIDNO:58)
Ac-ASCLRKLCKRLL-NH2(SEQ IDNO:59)
Ac-CSHLRKLCKRLL-NH2(SEQ IDNO:60)
Ac-ASHLRKCRKRCL-NH2(SEQIDNO:61)
Ac-ASHCRKLRKRCL-NH2(SEQIDNO:62)其中(匪e)-L是N-甲基化亮氨酸，Aib是氨基异丁酸，(orn)是鸟氨酸，(narg)是 硝基精氨酸，(NLe)是正亮氨酸(neurleucine)，(harg)是高精氨酸，(dmarg)是二甲基精 氨酸，(aclys)是乙酰赖氨酸，(azlys)是氮杂赖氨酸(azalysine)而Ac是乙酰化羧基端。在一些实施方案中，所述ApoE肽可结合蛋白质磷酸酶2A的内源抑制剂_2 (I2PP2A)， 也称作SET，如WO 2008/080082所述，其以全文提述的方式并入本文。在其他实施方案中，所述ApoE肽是C0G133的类似物或衍生物，C0G133是具有序列LRVRLASHLRKLRKRLL (SEQ ID NO 1)的肽。在另一个实施方案中，所述 ApoE 肽是 C0G1410 (Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH 2 (SEQ ID NO :4))。在另一个实施方案中，所述 ApoE肽是 C0G345(LRVRLAS-aib-LRKLRK(ac) RLL(SEQ ID NO :6))。在本发明的另一个实施方案中，C0G133和其他ApoE肽的效力可通过偶合于如 2005年9月2日提交的PCT申请WO 2006/(^9028 (其要求2004年9月2日提交的美国临时 申请 60/606，506，2004年 9 月 9 日提交的 60/608，148，2004年9 月 2 日提交的 60/606，507 的优先权，其以全文提述的方式并入本文)所述的蛋白质转导域(PTD)来改善。PTD为短的 碱性肽，其促进否则将无法或仅最低限穿过细胞膜的载荷(cargo)的胞内递送。一些可偶 合于ApoE肽的PTD的非限定性实例包括触角蛋白(antennapedia)、SynBU SynB3、SynB5、 TAT和聚精氨酸。例如，可偶合于本发明的ApoE肽的示例性的PTD序列包括GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO 9)RQIKIffFQNRRMKffKK(SEQ ID NO: 10)RRMKffKK (SEQ ID NO :11)RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO :12)RRLSYSRRRF(SEQ ID NO :13)RGGRLAYLRRRffAVLGR(SEQ ID NO :14)RRRRRRRR(SEQ ID NO :15)其他合适的载体公开于美国专利7，205，280号，其以全文提述的方式并入本文。 在一个优选实施方案中，所述ApoE肽偶合于触角蛋白。在另一个优选实施方案中，所述 ApoE 肽是 C0G112(RQIKIWFQNRRMKWKKCLRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO :2))。在一个实施方 案中，所述ApoE肽偶合于SynB3。在另一个实施方案中，所述ApoE肽是C0G068 (RRLSYSRRR FLRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO :8))。此外，如C0G1410的试剂具有增强的效力，且表现更佳的治疗指数。如本文中使用 的“治疗指数”指无动物死亡的最高可容忍剂量除以损伤之后的表现比盐水对照显著更佳 的最低有效剂量。不愿拘于任何理论，本发明的发明人有理由相信C0G133及其衍生物为蛋白质磷 酸酶2A(PP2A)的激活剂。因此，在本发明的一个实施方案中，ApoE肽在受处理的细胞中增 加PP2A的活性。ApoE肽对PP2A的激活还可减少Akt激酶、I κ K激酶和NF κ B的活性，从 而促进诱导细胞凋亡。因此，在一些实施方案中，ApoE肽在受处理的细胞中减少Akt激酶 活性。在其他实施方案中，ApoE肽诱导受处理的细胞即癌细胞的细胞凋亡。本发明的肽可通过如本领域已知的标准技术产生。本发明的肽可附加多种标记部 分如放射性标记、重原子标记和荧光标记以供检测和示踪。荧光标记包括但不仅限于萤光 素(Iuciferin)、焚光素(fluorescein)、曙红、Alexa Fluor、0regon Green、罗丹明 Green、 四甲基罗丹明、罗丹明RecUTexas Red、香豆素和NBD荧光团、QSY7、Dabcyl和Dabsyl生色 团、B0DIPY、Cy5 等。对本文中公开的肽的修饰以增强与这些肽相关的功能活性可容易地由本领域技 术人员达成。例如，用于本发明方法中的肽可经化学修饰或偶合于其他分子以增强如溶解 性、血清稳定性等参数，而保留功能活性。具体而言，本发明的肽可在N-端乙酰化和/或在C-端酰胺化，或偶合、复合或融合于增强其血清稳定性的分子，包括但不仅限于白蛋白、免 疫球蛋白及其片段、转铁蛋白、脂蛋白、脂质体、α-2-巨球蛋白和α-1-糖蛋白、PEG和右旋 糖酐。上述分子具体描述于US 6，762，169，其以全文提述的方式并入本文。本发明肽试剂的另一种变化是将一至十五个氨基酸或其类似物连接于所述治疗 肽的N-端或C-端氨基酸。本发明肽的类似物还可通过将一至十五个另外的氨基酸添加至 活性肽的N-端、C-端或N-和C-端两者来制备，其中上述氨基酸的添加并不不利地影响所 述肽在本发明的肽结合的位点结合受体的能力。例如，可通过将一至十五个另外的氨基酸 添加至所述活性肽的N-端、C-端或N-和C-端两者来构建C0G133、C0G1410和C0G345变 体。本发明的ApoE肽还包括本文中所述肽的保守变体。如本文中使用的保守变体指 其氨基酸序列中的改变并不不利地影响所述肽的生物学功能。当取代、插入或缺失所改变 的序列阻止或破坏与所述肽相关的生物学功能时，则称其为不利地影响所述肽。例如，可改 变所述肽的总体电荷、结构或疏水/亲水特性而不不利地影响生物学活性。因此，可改变其 氨基酸序列，例如，以使得所述肽更加疏水或更加亲水，而不不利地影响所述肽的生物学活 性。一般而言，所述肽的保守取代变体、类似物和衍生物具有与公开的序列SEQID NO :1,2, 4和6至少约55 %，至少约65 %，至少约75 %，至少约80 %，至少约85 %，至少约90 %，至少 约95 %，或至少约96 %至99 %相同的氨基酸序列。对于上述序列的同一性或同源性在本文 中定义为候选序列中与已知肽在将所述序列比对并视需要引入缺口以取得最大的同源性 百分比之后相同的氨基酸序列的百分比，且并不将任何保守取代考虑为序列同一性的一部 分。N-端、C-端或内部的延伸、缺失或对所述肽序列的插入不应视为影响同源性。因此，本发明的肽包括具有公开于SEQ ID NO :1、2、4或6中的氨基酸序列的分子； 其具有所述治疗肽至少约3、4、5、6、10、15或更多个氨基酸残基的连续序列的片段；上述肽 的氨基酸序列变体，其中氨基酸残基被插入至所公开序列的N-或C-端或之内；和公开序列 的氨基酸序列变体或其由另一个残基取代的如上所定义的片段。包含本发明肽序列的肽化 合物可为约 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 或更多个氨基酸。考虑到的变 体还包括那些通过例如同源重组、定点或PCR诱变而包含预决突变的那些，以及其他动物 物种的相应肽，其中所述动物物种包括但不仅限于兔、大鼠、猪、牛、羊、马和非人灵长类物 种，和包括其中的肽用除了天然存在的氨基酸之外的部分经取代、化学、酶或其他合适手段 而共价修饰的衍生物(例如，可检测部分如酶或放射性同位素)。所述ApoE肽，包括但不仅限于C0G133、COGl 12及其衍生物，可为游离形式或盐形 式，其中所述盐是药学上可接受的。这包括钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰等的无机盐。 还可用包括但不仅限于乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂 酸、水杨酸等制备所述肽的多种有机盐。在一个实施方案中，将本发明的肽与药学上可接受的载体组合使用。因此，本发明 还提供了适用于施用于受试者的药学组合物。上述组合物包含有效量的本发明的ApoE肽 与药学上可接受的载体组合。所述载体可为液体，从而使得该组合物适用于肠胃外施用，或 可为固体，即配制用于口服的片剂或丸剂。此外，所述载体可为可喷雾的液体或固体形式， 从而使得所述组合物适用于吸入。当肠胃外施用时，所述组合物应不含致热原，并载于可接受的肠胃外载体中。或者，活性剂可使用已知方法配制为包埋于脂质体中。用于鼻内施用 的本发明肽的制备可使用如本领域中已知的技术来实施。本发明的肽还可配制为供局部施 用，例如乳膏(cream)或凝胶的形式。局部制剂对于治疗皮肤癌特别有用。在其他实施方 案中，所述ApoE肽可配制为供直肠施用，如栓剂的形式。在一些实施方案中，对于治疗结肠 直肠癌，优选所述ApoE肽的直肠施用。本发明肽的药物制备物可任选地包括药学上可接受的稀释剂或赋形剂。本发明的ApoE肽的有效量是与不存在该肽时会发生的相比减少至少一种与癌症 相关的症状或病理(如肿瘤大小、肿瘤生长、癌细胞的扩散、癌细胞数和存活)的量。在一 个实施方案中，有效量的ApoE肽在受试者的细胞中调节Akt激酶活性或PP2A活性。所述 有效量(和施用模式)根据个体的情况确定，以及基于具体使用的肽并考虑到受试者(大 小、年龄、一般健康状况)，受治疗的具体癌症(例如，CLL、CML、乳腺癌)，待治疗的症状的严 重程度，寻求的结果，具体的载体或药物制剂，施用途径以及其他对于本领域技术人员显而 易见的因素。本文中所述的治疗有效量的肽可使用如本领域已知的体外测试、动物模型或 其他剂量应答研究来确定。施用本发明肽的另一种方法是通过向受试者施用携带编码所述肽的核酸序列的 载体来实施的，其中所述载体能够进入身体中的细胞从而使得所述肽表达并分泌。合适的 载体通常为病毒载体，包括DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒。利用载体递送系统并实施基 因疗法的技术在本领域是已知的。疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和慢病毒载 体是可用于施用本发明化合物的具体类型的载体。本发明的肽可单独用于治疗癌症或与其他通常用于治疗癌症的治疗剂组合使用， 所述治疗剂例如化疗剂(苯丁酸氮芥、环磷酰胺)，皮质类固醇(泼尼松、泼尼松龙)，氟达 拉滨，喷司他丁，克拉屈滨，伊马替尼(Gleevec)，达沙替尼(Sprycel)，激素疗法(他莫昔 芬、芳香酶抑制剂)和辐射。本发明的肽可急性施用(即，在发病时或紧接着导致癌症诊断的事件时)，或可预 防性施用(例如，在预定日程的手术之前，或在癌症病征或症状出现之前)，或在癌症发病 期间施用，以减轻或缓解否则将会发生的症状的进展。施用的时机和间隔根据受试者的症 状变动，且可由本领域技术人员确定以几个小时至几日的间隔，历经数小时、数日、数周或 更长的时间进程来进行施用。通常的每日施用方案可为从每日约0. 01 μ g/kg体重，从每日约lmg/kg体重，从每 日约10mg/kg体重，从每日约100mg/kg体重，从每日约1000mg/kg体重。取决于具体待施 用的ApoE肽，剂量可为每日约1至约500mg/kg体重，优选每日约25至约400mg/kg体重， 或更优选每日约50至250mg/kg体重。本发明提供了通过施用有效量的至少一种本文中所述的ApoE肽在有所需要的哺 乳动物受试者中治疗癌症的方法。ApoE肽可减少一种或多种与癌症相关的症状，包括但 不仅限于肿瘤形成、肿瘤生长、癌细胞数、癌细胞向健康组织的扩散以及减少的存活。可用 本发明的肽和方法治疗的癌症包括但不仅限于多种形式的白血病(CLL、CML、ALL、AML)、乳 腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、脑癌、皮肤癌(黑色素瘤和非 黑色素瘤)、头部和颈部癌症、膀胱癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、甲状腺癌、胃癌、食道癌、胆 囊癌、肝癌、淋巴瘤和肉瘤。在一个实施方案中，所述ApoE肽可减少信号传导途径如Akt/NFkB途径的激活，其在多种形式的癌症中异常激活(参见实施例1)。ApoE肽还可激活 PP2A(实施例2、。报道了 PP2A负调节内皮细胞运动性，其为癌症中血管发生和肿瘤转移 所必需(Gabel 等，1999，Otolaryngol Head Neck Surg. 121 :463-468 ；Young, MR.，1997， AdvExp Med Biol. 407 :311-318)。冈田酸对PP2A的抑制通过破坏细胞骨架网络增加细胞 运动性从而增强了肿瘤细胞的侵袭性。因此，本发明的肽会通过激活PP2A减少肿瘤细胞转 移和癌症相关的血管形成。在本发明的一个实施方案中，ApoE肽的施用增加受试者的癌细 胞中的PP2A活性。在另一个实施方案中，ApoE肽的施用减少受试者的癌细胞中的Akt激酶 活性。在另一个实施方案中，ApoE肽的施用减少受试者的癌细胞中的I κ K激酶活性。在 另一个实施方案中，ApoE肽的施用减少受试者的癌细胞中的NF κ B激酶活性。还在另一个 实施方案中，ApoE肽的施用诱导受试者的癌细胞的细胞凋亡。本发明还提供了用于治疗白血病的方法，包括将至少一种ApoE肽以与所述肽不 存在时会发生的相比减少疾病症状的量施用。在一个实施方案中，所述白血病是慢性髓细 胞性白血病(CML)。SET，一种PP2A的内源阴性调节剂，在CML中过表达并抑制PP2A，从而 保持致癌的BCR/ABL激酶途径的激活(Neviani等(2005) Cancer Cell. 8 =355-368)。因此， ApoE肽如C0G133、C0G1410、COGl 12或任何其他ApoE类似物的施用会激活PP2A，然后其能 够自由地将细胞增殖和存活的调节剂去磷酸化，以及抑制BCR/ABL激酶的致癌活性，从而 减少白血病发生。在一些实施方案中，ApoE肽的施用减少了受试者中BCR/ABL+细胞的生 长。在某些实施方案中，BCR/ABL+细胞对伊马替尼(Gleevec)和/或达沙替尼(Sprycel) 具有抗性，即，上述伊马替尼和/或达沙替尼抗性细胞的生长并不由这些化合物中的任一 所抑制。不愿拘于理论，相信ApoE肽可通过增加细胞内的PP2A活性(其随即使BCR/ABL激 酶去磷酸化并失活)来有效地抑制伊马替尼和/或达沙替尼抗性细胞。上述机理与伊马替 尼或达沙替尼的机理不同，后者直接对BCR/ABL激酶起作用，并受所述激酶的突变影响。在 另一个实施方案中，所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在优选实施方案中，ApoE 肽的施用减少受试者中CD5+B细胞数。在另一个实施方案中，所述白血病是急性淋巴细胞 性白血病(ALL)。本发明还涵盖了通过将有效量的至少一种ApoE肽施用于受试者而在受试者中治 疗乳腺癌的方法。在一个实施方案中，所述乳腺癌以Her2表达为特征。在另一个实施方案 中，所述乳腺癌以雌激素受体表达为特征。ApoE肽的施用优选在其施用之后减少肿瘤生长。在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种ApoE肽的药物组合物。在某些实 施方案中，本发明提供了包含至少一种ApoE肽与另一种用于治疗、预防或缓解癌症的药物 的药物组合物。本发明的肽的药物组合物可以以下述方式提供使得其便于向有所需要的 受试者通过包括例如静脉内、肌内、皮下或经皮施用。参见Remington，s Pharmaceutical Sciences, 19th ed. Remingtonand Gennaro, eds. Mack Publishing Co. , Easton, PA。其以 提述的方式并入本文。本发明的方法还提供了多种给药日程，施用时机，治疗的间隔和持续 时间，预防或缓解癌症如CLL，CML和乳腺癌。还如本领域中已知的，包括了公开的肽的功能 性变体。与之一致，本发明还包括公开的肽及其功能性变体在制备用于如本文中所讨论治 疗多种形式的癌症的药物中的用途。列出下述实施例用于说明本发明，其不应视为对本发明的限制。实施例实施例1 :C0G肽调节Akt/NF κ B途径多种类型的癌症以磷脂酰肌醇-3激酶(PI_3K)/Akt途径异常的组成型激活为特 征，该激活导致在癌细胞中建立抗细胞凋亡的环境，其与不良后果相关。当生长因子如胰 岛素在质膜处激活PI3激酶时，磷酸肌醇发生磷酸化，导致Akt易位至质膜，于此其通过在 Thr308和kr473磷酸化而激活。一旦被激活，Akt通过两个机理调节细胞存活必需的蛋白 质(图1)。首先，Akt可通过藉由激酶介导的激活或抑制控制存活蛋白的功能来调节这些 存活蛋白。已经阐明了激活的Akt直接磷酸化胱天蛋白酶-9和Bad，从而使其失活。胱天 蛋白酶-9是在正常细胞凋亡级联中早期激活的蛋白酶，而Bad是Bcl-2家族的促细胞凋亡 蛋白，其结合Bcl-xL并抑制其促存活功能。Akt对Bad的磷酸化抑制其促细胞凋亡活性， 并增加细胞中促生长的癌状态。激活的Akt将细胞移向抗细胞凋亡状态的第二种机理是通 过增加存活蛋白的转录和产生的信号传导。例如，Akt激活通过激活I κ B激酶(I κ K)增 加Mcl-I的表达，其随即磷酸化I κ B，NFkB的内源抑制剂，导致NFK B的释放和激活。其 他调节NFk B的抗细胞凋亡基因包括Bcl-xL和Al，以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。独 立地显示了 iNOS的上调与乳腺癌患者中的快速进展、复发的频率和死亡率相关。在大约30%的乳腺癌中，组成型Akt激活可追踪至HER2/Neu基因产物的增强表 达，所述产物为组成型激活的受体酪氨酸激酶，其激活PI-3激酶而导致Akt激活。PI-I 的类似激活导致BCR/Abl融合蛋白诱导慢性髓细胞性白血病(图1A)。发现T细胞白血病 /淋巴瘤1癌基因(TCL1)，其涉及B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的疾病发生，直 接结合 Akt 并增强 Akt 激酶活性(Pekarsky 等 Q000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97 3028-3033)。因此，预计成熟B细胞中TCLl的表达产生增强的Akt激酶活性并增加多个抗 细胞凋亡因素的产生，导致CLL的下述特征，即细胞凋亡受破坏(图1B)。为了确定COG肽是否调节PI-3激酶/Akt途径以及NF κ B的后续激活，分析在COG 肽不存在和存在下暴露于细菌或细菌抗原(脂多糖)的细胞中该途径中蛋白质的磷酸化状 态。在第一系列的实验中，将六孔板中的小鼠BV2小胶质细胞仅用lOOng/mL LPS或在5 μ M C0G133(SEQ ID NO :1)肽存在下用lOOng/mL LPS进行温育。裂解细胞，并通过离心制备澄 清的提取物。将每泳道30 μ g的提取物上样于聚丙烯酰胺凝胶，并在SDS缓冲液中运行。将 蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上，随后用10%脱脂干奶粉(nonfat dry milk)对其进 行封闭。然后用抗磷酸-I κ Ba抗体对膜进行探测。用EnhancedChemiluminescence底物 (GE healthcare)对膜进行显色，并通过胶片曝光显影。然后剥去膜上的抗体，并使用非磷 酸特异性的抗I κ Ba抗体来重新探测总I κ B。将复制的印迹用抗GAPDH抗体探测。如图 2A所示，C0G133肽减少LPS诱导的I κ B磷酸化。在去磷酸状态，I κ B结合转录因子NFk B并阻止其易位至核而激活促存活蛋白的 转录。为了确定C0G133是否也减少NF κ B向核的易位，仅用LPS或在C0G133存在下用LPS 刺激BV2小胶质细胞，并从受刺激的细胞制备核提取物。将含有NFk B结合位点的放射性标 记的寡核苷酸添加至来自核提取物的蛋白质，并随后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 所述蛋白质。存在于核提取物中的NFk B的量通过放射自显影来检测(图2B)。在C0G133 存在下，核NF κ B减少，从而提供了该信号转导级联在用ApoE肽处理的细胞中被抑制的进 一步证据。
为了确定COG肽是否还可抑制上游Akt激酶的激活，将BV2小胶质细胞仅用IOng/ mL LPS或在ΙμΜ COGl 12 (SEQ ID NO 2)肽存在下用10ng/mLLPS处理。将细胞裂解液在 10%聚丙烯酰胺凝胶上运行，并随后转移至硝酸纤维素膜。用抗磷酸-Akt抗体或肌动蛋白 抗体探测印迹。进行Western印迹的光密度分析，并将从磷酸化Akt激酶获得的信号相对 来自肌动蛋白的信号进行标准化。光密度分析的结果示于图2C。COGl 12显著地减少了 LPS 诱导的Akt激酶的磷酸化。Akt激酶可磷酸化并激活I K B激酶(I K K)，其导致I K B对NFK B的去阻抑 (de-pression)。如上所述，COG肽减少I κ B的磷酸化和随后Toll样受体4激动剂(LPS) 诱导的NFkB激活。为了确定COG肽是否还影响I κ K激活，在C0G112 (SEQ ID NO :2)存 在或不存在下暴露于啮齿类柠檬酸杆菌细菌的年轻成年小鼠结肠(YAMC)细胞的胞质细胞 裂解液中评价I κ K活性。使用特定的ELISA测定法(K-LISATM检测试剂盒，Calbiochem/ EMD Biosciences)测量I κ K活性。将胞质细胞提取物在96孔板的谷胱甘肽包被的孔中 用谷胱甘肽S转移酶(GST)标记的ΙκΒ-α融合多肽底物温育，所述底物包含和 Ser36lKB-a激酶磷酸化位点。磷酸化的GST-I κ Β_ α底物是使用辣根过氧化物酶偶合 的抗磷酸-ΙκΒ-α抗体来检测的。在板读数器中在450nm测量了与激酶活性成比例的吸 光度。由啮齿类柠檬酸杆菌在COGl 12存在(实心方块)或不存在(空心方块)下诱导的 I κ K激活的时间进程示于图2D。时间0表明细胞未用啮齿类柠檬酸杆菌刺激。与C0G133 处理中观察到的阻抑I κ B磷酸化和NF κ B激活类似，COGl 12实质性地减少了 I κ K活性。这些实验的结果显示COG肽能够减少Akt激酶的激活，以及由刺激物诱导的下游 信号传导，表明COG肽能够有效地调节Akt/NF κ B信号传导途径的过度激活。实施例2 COGl 12 激活 PP2A将小鼠RAW巨噬细胞用2μ M COGl 12 (SEQ ID NO :2)或IOnM冈田酸(PP2A的抑制 剂)，或用R田酸以及C0G112温育。在30分钟之后，裂解细胞，并通过添加靶向PP2A催化 性C亚基的抗体将PP2A免疫沉淀。将一半的免疫沉淀通过SDS-PAGE分离，印迹至硝酸纤 维素上，并用抗PP2AC抗体探测。对剩下的部分通过将125 μ L含磷酸-苏氨酸底物肽的测 定合剂添加至经免疫沉淀的酶来测定其活性。在37°C振荡温育之后，移取25 μ L等分试样 并添加至钼酸铵溶液(Upstate)，后者螯合游离的磷酸并在螯合物形成时变色。以多种时间 间隔移取等分试样，并通过与磷酸标准曲线比较来确定从肽释放的游离磷酸的量。磷酸释 放的速率是通过线性拟合至时间进程数据来确定的，并用PP2A相对浓度进行标准化。通过 磷酸释放测量的PP2A活性在C0G112存在下增加(图3)，表明ApoE肽缓解了 PP2A活性的 基线抑制。如预想，在冈田酸单独存在时，PP2A活性减少。然而，C0G112在冈田酸存在时增 加PP2A活性，表明在细胞中存在活性PP2A和无活性PP2A之间的平衡，且COGl 12可移动该 平衡以调节活性PP2A酶的量(图幻。因此，细胞中PP2A的活性汇集可由ApoE肽调节。实施例3 :C0G112在体外杀灭B-CLL细胞认为B细胞在慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)中持久的抗细胞凋亡状态是部分由 于Akt/NF κ B信号传导级联的过度激活。已知PP2A通过将Akt激酶和I κ K激酶去磷酸 化和失活来制衡该信号传导途径(Kuo等(2008) J Biol Chem.，Vol. 283 :1882-1892 ；Kray 等(2005) J Biol Chem.，Vol. 280 :35974-8 。PP2A还可通过将胱天蛋白酶去磷酸化和激 活来调节细胞凋亡途径，胱天蛋白酶在细胞凋亡诱导的早期起作用。因此，细胞中减弱的(compromised)PP2A活性将促使Akt途径的组成型激活，保持抗细胞凋亡状态。事实上， 包含PPP2R1B基因一部分的Ilq22_q23处的缺失代表了 B-CLL中第二常见的染色体异常。 PPP2R1B基因编码PP2A的Αβ恒定调节亚基，ΡΡ2Α通常作为肿瘤抑制剂为人所知。该缺失 导致PPP2R1B表达减少，并与B-CLL细胞中ΡΡ2Α活性的减少相关(Kalla等Q007)Eur J Cancer, Vol. 43 :1328-35)。这些患者以不良的存活为特征，且CLL肿瘤细胞显示增加的存 活率。如实施例1和2中所示，COG肽可减少Akt/NFkB信号传导级联的激活，并激活 PP2A。为了确定COG肽是否能够对抗B-CLL细胞中Akt/NFkB途径的过度激活并有效地诱 导细胞凋亡，对从CLL患者新鲜分离的B-CLL细胞用COG肽进行了细胞毒性测试。收集来 自 CLL 患者的血，并使用B Cell Enrichment Cocktail 分离了 CD5+/ ⑶19+CLL细胞。该方法使用一种含有抗-⑶14、抗-⑶2和抗⑶16抗体的专利抗体合剂分别 耗尽了全血中的T细胞、单核细胞和NK细胞以去除T细胞、单核细胞和NK细胞。该抗体合 剂在人全血中与不需要的细胞交联以倍增形成免疫花环(immunorosette)的红血细胞，从 而增加了形成花环的细胞的密度，从而使得当用具有浮力的密度介质如Ficoll-Paque 离心时，其与游离的RBC —同沉淀。高度富集的B细胞或B-CLL细胞留在Ficoll和血浆的 界面处。将COG肽施与分离的B-CLL细胞(在96孔板中，0. 25 X IO6个细胞/孔)72小 时，之后，使用MTS测定法(Pharmacia)评价存活的细胞。确定了有效杀灭50%的输入CLL 细胞的COG肽的浓度(ED50)。如表I所示，C0G133(SEQ ID NO 1)相对于C0G056 (SEQ ID NO 3)对照其活性略有改善。C0G056是与C0G133含有相同氨基酸组成但是具有消除了该 肽体内和体外活性的乱序序列的形式。C0G248 (SEQ ID NO :5)为C0G133的修饰形式，与 C0G133相比显示增强的活性。由触角蛋白同源框域蛋白质转导域提供的细胞穿透的增加 导致C0G133(C0G112 ;SEQ ID NO :2)的EC50强烈地增加至2 士 120nM。有趣的是，相对于 C0G133显示出改进的在小胶质细胞中抑制NO产生的效力的C0G1410(SEQ ID NO 4)在针 对B-CLL细胞的细胞毒性的效力方面未显示区别。
权利要求
1.一种在有所需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的至少 一种ApoE肽。
2.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽的施用减少受试者中至少一种癌症症状。
3.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽的施用增加受试者癌细胞中的PP2A活性。
4.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽的施用减少受试者癌细胞中的Akt激酶、Iκ K 激酶或NF κ B活性。
5.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽含有17个或更多个氨基酸。
6.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽含有20个或更多个氨基酸。
7.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽含有30个或更多个氨基酸。
8.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽含有40个或更多个氨基酸。
9.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽含有SEQID NO=I的序列。
10.权利要求1的方法，其中所述ApoE肽偶合于蛋白质转导域。
11.权利要求10的方法，其中所述蛋白质转导域选自下组来源于触角蛋白、TAT、 SynBU SynB3, SynB5和聚精氨酸的肽。
12.权利要求11的方法，其中所述ApoE肽含有SEQID NO 2的序列。
13.权利要求1的方法，其中所述癌症为白血病。
14.权利要求13的方法，其中所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
15.权利要求14的方法，其中所述ApoE肽的施用减少受试者中CD5+B细胞数。
16.权利要求13的方法，其中所述白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。
17.权利要求16的方法，其中所述ApoE肽的施用减少受试者中BCR/ABL+细胞的生长。
18.权利要求17的方法，其中所述BCR/ABL+细胞对伊马替尼或达沙替尼有抗性。
19.权利要求13的方法，其中所述白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
20.权利要求1的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
21.权利要求20的方法，其中所述乳腺癌以Her2表达为特征。
22.权利要求20的方法，其中所述乳腺癌以雌激素受体表达为特征。
全文摘要
公开了在受试者中通过施用ApoE肽治疗慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和乳腺癌的方法。
文档编号A61K38/00GK102137680SQ200980133762
公开日2011年7月27日 申请日期2009年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者戴尔·J·克里斯滕森, 迈克尔·P·维特克 申请人:克格诺西有限公司