专利名称：嘌呤核苷磷酸化酶作为核苷前体药物的酶激活剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用尾部突变体和野生型阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylases)作为前体药物底物的酶激活剂的方法，特别涉及前体药物底物例如9- ( β -D-阿拉伯呋喃糖)-2-氟腺嘌(9- ( β -D-arabinofu ranosyl) -2-fluoroadenine, F—araA，fludarabine (氣达拉滨))禾口 2-氣一2'-脱氧腺昔 (2-C1-2' -deoxyadenosine, Cl-dAdo, cladribine (克拉曲 宾))。
背景技术：
一种用于选择性损害肿瘤细胞的前体药物激活策略涉及编码外源酶的基因在肿瘤细胞中的表达和用于该酶的底物的施用。酶作用于底物以产生对靶定肿瘤细胞有毒的物质。这项技术相对于直接毒性基因，例如蓖麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin), 或绿脓杆菌外毒素(pseudomonas exotoxin)，的表达具有优势。这些优势包括能够1)用滴定法测量细胞受损；幻通过调节前体药物或重组酶表达的水平优化治疗指数；和幻通过停止施用前体药物中断毒性。另外，该技术使用前体药物，在不同细胞类型上具有不同效果，允许根据具体疾病状态调整治疗。
在前体药物激活方法中有用的酶已经被描述并包括酶，例如胸苷激酶(thymidine kinase)、胞啼 脱氛醇(cytosine deaminase)禾口口票吟核昔憐酸化醇(purine nucleoside phosphorylase, PNP)，如在美国专利 US 5338678、5552311、6017896 和 6207150 中描述的。 然而，在底物施用的副作用存在的情况下，使用前体药物激活技术的肿瘤治疗的有效性是有限的。例如，前体药物更昔洛韦(ganciclovir)，常常与胸苷激酶联合使用，可能会导致不期望的免疫抑制效果。
用于重要的化学治疗剂F-araA的带有裂解活性的特定的嘌呤核苷磷酸化酶的研究以前没有成功过，部分原因是由于大量需要验证的PNP候选物和关于分离和表达每个 PNP的困难。许多微生物产生能够将含腺嘌呤的核苷(adenine-containing nucleosides) 裂解成腺嘌呤的PNPs。举例来说，具有至少17种微生物单独报道表达PNP，包括利什曼原虫(Leishmania donovani)；阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)；克氏锥虫 (Trypanosoma cruzi)；血吸虫(Schistosoma mansoni)；热带禾丨」什曼原虫(Leishmania tropica)；法氏短膜虫(Crithidia fasciculata)；曲霉(Aspergillis)禾口青霉(Penicillium)；欧文氏菌(Erwinia carotovora)；蜗牛(Helix pomatia)；石班(Ophiodon elongates (Iingcod))；大肠杆菌(E. coli)，沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；梭状芽孢杆菌(Clostridium)；支原体(mycoplasma)；冈比 Mlfljil (Trypanosoma gambiense)；和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)。
因此，存在需要一种用于治疗肿瘤的提高疗效和克服副作用问题的前体药物激活方法。
发明内容
本发明提供了一种方法用于通过提供野生型阴道毛滴虫嘌呤核苷磷酸化酶 (Trichomonas vaginalis purine nucleoside phosphorylase, Tv-PNP)丨临近癌细胞禾口夺该酶接触由该酶裂解以产生细胞毒性嘌呤类似物的底物，底物是氟达拉滨(fludarabine)、 克拉屈滨(cladribine)、虫草素(cordycepin)类似物、2’，3’ -双脱氧腺苷(2’， 3，-dideoxyadenosine)类似物、5，-甲基(talo) _6_ 甲基嘌呤-核糖苷(5，_methyl (talo)-6-methylpurine-riboside) ,5'-甲基(talo)-2，-脱氧-6-甲基嘌呤-核糖苷(5，-methyl ( talo)-2,-deoxy-6-methylpurine-riboside)、5，-甲基(alio)-6-甲基嘌呤-核糖苷(5，_m ethyl (alio)-6-methylpurine-riboside)、2_F_5，-脱氧腺苷(2_F_5，-deoxyadenosine) 或 2-F- α -L-来苏-腺嘌呤(2-F- α -L-lyxo-adenine)。
本发明提供了一种商业试剂盒用于抑制哺乳动物癌细胞，包括Tv-PNP酶、tm-PNP 酶、或含有在癌细胞中可表达的编码Tv-PNP酶、tm-PNP酶或它们的组合的DNA序列的载体； 和为氟达拉滨、克拉屈滨、虫草素类似物、2’，3’_双脱氧腺苷类似物、5’-甲基(talo)-6-甲基嘌呤-核糖苷、5’-甲基(talo)-2’-脱氧-6-甲基嘌呤-核糖苷、5’-甲基(allo)-6-甲基嘌呤-核糖苷、2-F-5’-脱氧腺苷或2-F- α -L-来苏-腺嘌呤，或这些底物的组合中的底物。
本发明还提供了一种靶定细胞裂解液(target cell lysate)、Tv-PNP/tm-PNP和当被Tv-PNP/tm-PNP裂解时产生细胞毒性裂解产物嘌呤类似物的前体药物的组合物。该组合物在指导后续治疗中是特别有用的。
图1描绘了 F-araA与E. coli PNP和Tv-PNP的动力学参数。
图2描绘了 F-araAMP ( 一种前体药物或F_araA)抗仅10%细胞表达Tv-ΡΝΡ的老鼠中的肿瘤移植(tumor xenographs)的有效性。
图3是命名为pCR4bIimt-TvPNP的发明载体克隆的限制性位点酶切图谱。
图4是命名为pACCMV-TvPNP的表达Tv-PNP并包括图3的克隆的发明腺病毒载体的限制性位点酶切图谱。
图5是命名为pWPI (+) -TvPNP的、与EGFP共表达的、表达Tv-PNP并包括图3的克隆的发明载体慢病毒(Ientivirus)的限制性位点酶切图谱。
图6是命名为pHR'CMV-ΤνΡΝΡ的、不与EGFP共表达的、表达Tv-PNP并包括图3的克隆的发明载体慢病毒的限制性位点酶切图谱。
图7是与野生型E. coli相关的腺病毒可表达的tm-PNP的核苷酸序列图谱；和 图8是图7的核苷酸序列编码的显示产生的尾部增加的tm-PNP氨基酸序列。
具体实施例方式本发明的主题是从T. vaginalis分离的嘌呤核苷磷酸化酶。嘌呤核苷磷酸化酶和核苷水解酶(nucleoside hydrolases)存在于多种生物体中，示例性地包括哺乳动物例如人、禾口微生物例如 Leishmania donovani ；Trichomonas vaginalis ；Trypanosoma cruzi ； Schistosoma mansoni ；Leishmania tropica ；Crithidia fasciculata ；Aspergillis 禾口 Penicillium ；Erwinia carotovora ；Helix pomatia ；Ophiodon elongatus ；Salmonella typhimurium ；Bacillus subtilis ；Clostridium ；mycoplasma ；Trypanosoma gambiense ； Trypanosoma brucei ；Sulfolobus solfataricus ；禾口 E. coli。
核苷磷酸化酶催化反应嘌呤核苷+PO4 —核糖-I-PO4 (ribOSe-l-P04，或脱氧核糖-1-磷酸盐(deoxyribose-1-phosphate))+嘌呤碱基(purine base)。本发明提供了编码天然Trichomonas vaginalis嘌呤裂解酶以及tm-PNP序列的核苷酸序列和氨基酸序列， 分别与来自其它生物体的结构相关的野生型PNP酶和产生尾部突变酶的野生型序列相比， 在裂解特定底物中，具有令人吃惊的更高的生物活性。
如在这里所使用的术语“生物活性”指的是通过特定量的嘌呤裂解酶在底物存在下在一段时间内的反应产生的终产物量的测量，由如在实例2中显示的合适的方法测量。
一种化合物，其是用于酶的底物以产生细胞毒性的损害细胞的新陈代谢、功能或复制的嘌呤类似物，在这里指的是可互换的“前体药物”或“底物”。
如在这里所使用的术语“致病病毒感染”指的是导致疾病或病理效果的病毒的感
^fe ο 如在这里所使用的术语“药学上可接受的”指的是不是生物的或要不然非期望的材料，能够施用至个体而不导致重大的非期望的生物效应或以有害的方式与含有其的药物组合物的其它组分的任何一个反应。
根据本发明，由Tv-PNP或tm-PNP对前体药物的裂解产生细胞毒性的嘌呤类似物， 其抑制癌(或病毒感染的)靶定细胞。可理解，细胞毒性的嘌呤类似物不需要在癌细胞中产生，相反存在周边(bystander)效应，其中在癌细胞中产生的细胞毒性的嘌呤类似物能够转移至邻近的肿瘤细胞并使它们毁灭。抑制病毒感染的或癌靶定细胞所需要的细胞毒性的嘌呤类似物的浓度取决于多种因素，包括细胞毒性的嘌呤类似物的特性、细胞间液交换率、 细胞毒性的嘌呤类似物细胞膜转运的速率、结合进DNA或RNA的速率、和作为蛋白合成抑制剂的有效性。
Tv-PNP或tm-PNP是可操作的用于体内或体外和在人体内或非人类对象中抑制哺乳动物癌或病毒感染的靶定细胞。Tv-PNP或tm-PNP通过在美国专利US6，958，318B2中详细描述的方法的任何一种并作为其中描述的E. coliPNP的替换进行体内输送。这些输送方法示例性地包括重组病毒载体；Clostridium，Salmonella和Ε. coli细菌载体；抗体偶联脂质体；重新导入遗传改变以表达Tv-PNP或tm-PNP酶的对象细胞；脂质体转染；病毒例如逆转录酶病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、疱疫病毒(herpes virus)、麻疫病毒(measles virus)、腺相关病毒(adeno-associated virus)、或 vacuvirus ；禾口直接注身寸 Tv-PNP或tm-PNP酶至哺乳动物癌细胞附近。
本发明提供了一种至少抑制并通常杀死复制的或非复制的、转染或转导的哺乳动物细胞和周边细胞的方法，其通过以下步骤(a)用编码Tv-PNP或tm-PNP的核酸转染或转导靶定哺乳动物细胞，或直接提供这种酶临近靶定细胞；和(b)将表达或提供有Tv-PNP 裂解酶的靶定细胞接触用于该酶的底物以产生毒性的嘌呤碱基，量大于由野生型或替换 E. coliPNP和其它PNPs产生的毒性的嘌呤碱基，从而杀死靶定细胞以及不表达或含有裂解酶的周边细胞。因此，在底物存在下，Tv-PNP或tm-PNP裂解酶产生毒性产物。本发明的操作可以体内或体外用人类或非人类哺乳动物或其它细胞进行。
如在这里所使用的术语“抑制”是正常生理活性的改变。更具体地，抑制限定为裂解(Iysing)、减少增殖、减少生长、增加或减少基因、RNA、蛋白、脂质或其它代谢物的降解速率或表达、诱导凋亡或其它细胞死亡机制、或增加、减少或要不然改变蛋白或核酸的功能。
在本发明的一个具体实施例中，Tv-PNP或tm-PNP酶通过靶定该酶至细胞进行提供。更优选地，Tv-PNP或tm-PNP酶通过偶联该酶至抗体从而靶定至细胞。
酶可以由提供至细胞的基因编码。例如，提供至细胞的基因编码Tv-PNP或tm-PNP 并可操作地连接至酪氨酸酶基因启动子。可选择地，基因提供在载体分子例如聚合膜、胶、 微颗粒和脂质体中。
在另一具体实施例中，本发明提供了一种至少抑制并通常通过裂解杀死复制的或非复制的靶定哺乳动物细胞和周边细胞的方法。该方法包括下列步骤；(a)输送Tv-PNP或 tm-PNP至靶定哺乳动物细胞；和(b)将靶定细胞接触用于Tv-PNP或tm-PNP的有效量的核苷底物，其中底物对于哺乳动物细胞是比较没有毒性的，并由Tv-PNP或tm-PNP裂解以产生对靶定哺乳动物细胞和其临近的周边细胞有毒性的嘌呤碱基，量大于由野生型或替换突变的E. coli PNP产生的毒性的嘌呤碱基。嘌呤类似物底物的代表性例子包括氟达拉滨、克拉屈滨、虫草素类似物、2’，3’ -双脱氧腺苷类似物、5’ -甲基(talo)-6-甲基嘌呤-核糖苷、 5’ -甲基(talo)-2’ -脱氧-6-甲基嘌呤-核糖苷、5’ -甲基(alio)-6-甲基嘌呤-核糖苷、2-F-5，-脱氧腺苷或2-F- α -L-来苏-腺嘌呤。
本发明还提供了用于杀死靶定哺乳动物细胞的组合物，包括(a)裂解嘌呤核苷底物的Tv-PNP或tm-PNP酶；和(b)当由该酶裂解时有效杀死靶定细胞的嘌呤核苷底物量。
本发明还涉及含有编码Tv-PNP或tm-PNP蛋白的DNA序列的载体，其中载体能够在宿主中复制并包括可操作连接a)复制起点；b)启动子；和c)编码所述Tv-PNP或 tm-PNP蛋白的DNA序列。优选地，载体是逆转录酶病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、 疱疹病毒载体、vacuvirus、病毒载体、或质粒。
本发明还指用本发明的载体转染的宿主细胞，以便载体表达Tv-PNP或tm-PNP蛋白。优选地，这种宿主细胞选自由细菌细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞组成的组。
可理解，在本发明方法中，宿主细胞可选地用载体在体外或体内转染或转导，随后施用至病人，优选地在肿瘤位点或临近肿瘤位点或病毒感染位置。可选地，细胞通过全身进行输送。
在这里举例说明的某些方法和组合物涉及用Tv-PNP或tm-PNP基因转染细胞和随后用相比较而言无毒的转化至毒性嘌呤类似物的嘌呤核苷前体药物进行治疗。一种特别优选的前体药物是F-araA，但是可理解其它前体药物在本发明中也是可操作的。
Tv-PNP或tm-PNP与人PNP不同，其更有效的接受腺嘌呤和某些含鸟嘌呤的核苷类似物作为底物，与不同细菌和寄生虫来源的结构相似的PWs相比，在这里显示在裂解特定底物时令人吃惊的有效。表达在肿瘤细胞中的PNP裂解核苷，释放毒性嘌呤类似物。与核苷单磷酸盐例如使用HSV Thd激酶产生的通常留在它们形成其中的细胞内的那些相比，嘌呤类似物自由扩散通过细胞膜。由Tv-PNP或tm-PNP转变后形成的毒性腺嘌呤类似物可以由腺嘌呤磷酸核糖基转移酶转变成毒性核苷酸并杀死所有转染的细胞，且扩散出细胞并杀死没有转染的周围细胞(周边细胞)。
本发明组合物用作可操作地产生毁灭例如靶定癌或病毒感染细胞的裂解毁灭的生物功能系统。示例性地，本发明组合物和方法使用Tv-PNP对前体药物的酶促反应以产生能够转运细胞膜并导致细胞裂解的细胞毒性嘌呤类似物。通过例子的方式，这样一种组合物提供关于每单位体积存在的Tv-PNP或tm-PNP酶的拷贝数的信息，而前体药物 源自其的细胞毒性裂解产物的摩尔比表示活性动力学。这些分析结果通过常规HPLC或其它分析方法容易获得。对于肿瘤靶定细胞，当与分化不同时间的肿瘤重量扫描(time differentiated tumor mass scans)偶联时，这些结果提供了关于用 Tv-PNP 或 tm-PNP、辅助化疗(adjunct chemotherapeutic)、外科或放射治疗或它们的组合进行的后续治疗的性质的非常宝贵的资料。
PNP编码序列的转录调控 在优选的具体实施例中，Tv-PNP或tm-PNP是原核基因编码的，以便Tv-PNP或 tm-PNP在哺乳动物细胞中的表达通过与PNP编码序列连接的真核转录调控序列实现。 Tv-PNP或tm-PNP基因可以示例性地在商业质粒(例如SV40早期启动子/增强子(pSVK30 Pharmacia, Piscataway, NJ)，莫洛尼小鼠肉瘤病毒长末端重复序列(pBPV，Pharmacia)，小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(PMSG，Pharmacia)和巨细胞病毒早期启动子/增强子 (pCMVii，Clontech, Palo Alto, CA)中获得的强组成型启动子/增强子元件控制下表达。
也可以通过使用限制Tv-PNP或tm-PNP编码序列的表达至特定细胞类型的基因转录调控序列靶定选择的细胞群用于抑制或破坏，这被称为转录靶定的策略。用于靶定转录的候选调控序列优选地满足通过试验确定的两个重要标准(i)调控序列调控足够的基因表达以导致在靶定细胞中产生治疗量的酶，及(ii)调控序列在非靶定细胞中不调控足量酶产生以损害治疗方法。在这种靶定形式中，调控序列与Tv-PNP序列功能上连接以产生只在那些表达该基因的、调控序列来自的细胞中激活的基因。已经显示满足用于基因治疗中转录靶定的标准的调控序列包括来自分泌的白细胞蛋白酶抑制剂、表面活性蛋白A和 α -胎蛋白基因的调控序列。关于这一策略的变化是利用具有“诱导性”的调控序列以便诱导物的局部施用导致局部基因表达。作为这个策略的一个例子，辐射诱导的序列已被描述并主张用于基因治疗的应用(ffeichselbaum,et al. ,Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. ,24 :565-567 (1992))，并在这里是可操作的。
组织特异性增强子/启动子在调控Tv-PNP或tm-PNP表达，和从而Tv-PNP或 tm-PNP介导的毒性至特定组织中是可操作的。例如，人酪氨酸酶基因调控序列足以调控 Tv-PNP或tm-PNP毒性至恶性黑色素瘤细胞。从基因的5-主要侧翼区(从转录起始位点开始的-769bp)开始的鼠酪氨酸酶序列能够调控报告基因表达至恶性黑色素瘤细胞。虽然鼠和人酪氨酸酶序列在5-主要侧翼区是相似的，Shibata et al.，Journal of Biological Chemistry, 267 :20584-20588(1992)表明由Vile和Hart使用的处于相同区域的人5-主要侧翼序列(从转录起始位点开始的_616bp)没有赋予组织特异性表达。虽然Siibata et al.等提出5-主要侧翼区是不会有用于将基因表达靶定至酪氨酸酶表达细胞(黑色素瘤 (melanomas)或黑素细胞(melanocytes))，事实上，与Shibata et al.使用的稍有不同的上游片段能够特异性调控报告基因或E. coli PNP基因表达至黑色素瘤细胞，如美国专利 US6017896,图3所示，同样地，可操作Tv-PNP或tm-PNP。
因此，人酪氨酸酶序列是有用于调控Tv-PNP或tm-PNP表达至人黑色素瘤细胞。这些相同的序列是有用于调控其它治疗基因表达在黑色素瘤细胞或黑素细胞中。其它组织特异性基因调控序列和元件可以用于调控编码合适的嘌呤类似物核苷裂解酶的基因表达至除了黑素瘤以外的特定细胞类型。
Tv-PNP或tm-PNP基因的输送 提供了合适的重组病毒的构建和用于转移Tv-PNP或tm-PNP进入哺乳动物细胞腺病毒的使用。也可使用非病毒基因输送。例子包括在没有任何载体或稳定剂存在下的DNA 的扩散(“裸DNA (naked DNA) ”)，在药物稳定剂或载体存在下的DNA (“制剂DNA (formulated DNA)，，)，复合至有助于进入细胞的蛋白的DNA ( “分子偶联物(molecular conjugates)，，)， 或复合至脂质的DNA。在这里举例说明使用细菌PNP基因至哺乳动物细胞的脂质介导输送。 更具体地，证明了含有非人PNP基因的质粒的阳离子脂质体介导转移。其它基因转移方法也是普遍适用的，因为转移Tv-PNP基因到细胞的特定的方法并不仅仅决定成功的靶定细胞抑制。因此，也可使用利用病毒来源的转移载体进行的基因转导，下面进一步描述。这些方法是众所周知的，随时适用于在这里描述的基因介导的毒素疗法中使用。
Tv-PNP或tm-PNP基因输送的方法取决于它的形式，合适的方法对本领域技术人员来说将是显而易见。这些方法示例性地包括通过注射、基因枪转化和脂质体转染的施用。 在这里举例说明使用脂质介导输送PNP基因至哺乳动物细胞。更具体地，证明了含有非人 PNP基因的质粒的阳离子脂质体介导转移。然而，其它基因转移方法也是普遍适用的，因为转移Tv-PNP基因到细胞的特定的方法并不仅仅决定成功的肿瘤细胞损害。因此，也可使用利用病毒来源的转移载体进行的基因转导，下面进一步描述。这些方法是众所周知的，随时适用于在这里描述的基因介导的毒素疗法中使用。此外，这些方法可用于通过使用编码合适的嘌呤类似物核苷裂解酶例如Tv-PNP或tm-PNP的基因的特定载体的靶向特征靶定某些疾病和细胞群。
致病厌氧细菌已经用于选择性输送外源基因进入肿瘤细胞。例如，静脉注射入患有肿瘤的小鼠的梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum)孢子只在具有低氧分压区的肿瘤的坏死区域发芽。使用下面描述的用于PNP活性的分析方法，发现产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)显示出能够将MeP_dR转变为MeP的酶活性。这一发现表明一个在肿瘤的坏死、厌氧中心选择性表达PNP活性的机制。因此，肿瘤可以用表达Tv-PNP或 tm-PNP的产气荚膜梭菌感染，然后接触适当的底物，如氟达拉滨。然后在肿瘤组织的厌氧中心生长的梭菌的PNP活性将底物转变为有毒的嘌呤类似物，其然后局部释放以损害肿瘤细胞。此外，可选择地可以使用包括大肠杆菌和沙门氏菌的其它细菌以用于输送Tv-PNP或 tm-PNP基因进入肿瘤。
在本发明中可操作的其它输送系统示例性地包括输送媒介诸如“隐藏性 (stealth) ”和其它抗体偶联脂质体(包括靶向结肠癌的脂质介导的药物)，通过细胞特异性配体实现的受体介导的DNA靶向，淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内小鼠胶质瘤细胞的高度特异性治疗的逆转录病毒靶向。(S.K.Huang et al.，Cancer Research, 52 :6774-6781 (1992) ；R. J. Debs et al. , Am. Rev. Respir. Dis. , 135 :731-737 (1987)； K. Maruyama et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :5744-5748(1990) ；P.Pinnaduwage and L. Huang, Biochemistry,31 :2850-2855(1992) ；A. Gabizon and Papahadjopoulas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :6949-6953 (1988) ；S. Rosenberg et al. , New England J. Med., 323 :570-578(1990) ；K. Culver et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :3155-3159 (1991)； G. Y. Wu and C. H. ffu, J. Biol. Chem. ,263, No. 29 :14621-14624(1988) ；Wagner et al.， Proc.Natl. Acad. Sci. USA,87 :3410-3414 (1990) ；Curiel et al. , Human Gene Ther., 3 :147-154(1992) ；Litzinger, Biochimica et Biophysica Acta, 1104 :179-187 (1992)； Trubetskoy et al. ,Biochimica et Biophysica Acta, 1131 :311-313 (1992))。本方法，在靶向分裂肿瘤细胞或肿瘤新生血管的基因靶向机制方面，提供了一个改良的方法，通过该方法，一小部分的肿瘤细胞可以在生长的肿瘤整体中生长，这将在适当信号如施用用于存在或临近靶定细胞的T. vaginafis嘌呤类似物核苷裂解酶或tm_PNP的底物前体药物后将介导肿瘤迅速退化与坏死。
治疗方法 治疗方法示例性地包括转染或以其它方式施用发明的Tv-PNP或tm-PNP基因至细胞，及将带有Tv-PNP or tm-PNP基因或蛋白的细胞接触合适的底物。底物转变为一种有毒的嘌呤类似物，其抑制或杀死表达Tv-PNP或tm-PNP基因的细胞以及那些临近Tv-PNP或 tm-PNP基因表达细胞的周边细胞，取决于细胞毒性嘌呤类似物的浓度。Tv-PNP或tm-PNP基因示例性地直接施用至靶定细胞或与靶定组合物一起全身施用，如通过选择特定病毒载体或输送制剂。细胞优选进行体内治疗，在接受治疗的病人体内，或体外治疗，然后注射进病人身体内。Tv-PNP或tm-PNP基因导入病人细胞中后，以有效量全身或局部施用前体药物， 由Tv-PNP或tm-PNP转变成相对于目标细胞的细胞毒性嘌呤类似物。可理解，前体药物可选地，在发明的Tv-PNP或tm-PNP的施用之前，同时，或之后进行输送。优选地，前体药物在 Tv-PNP或tm-PNP的施用之后进行施用。
由于转染大量靶定细胞或施用Tv-PNP或tm-PNP酶的困难，用具有临床重要性的底物，例如F araA，这种酶相对于其它PNPs的裂解动力学提供了令人惊讶地的有益的治疗结果。
肿瘤的治疗 Tv-PNP或tm-PNP基因可选的作为策略的一部分去治疗转移性实体肿瘤，如黑色素瘤、胰腺、肝或结肠癌。在此方法中，可选地使用含有处于肿瘤特异性启动子控制下的 Tv-PNP或tm-PNP基因的质粒DNA。例如，酪氨酸酶启动子是高度特异性的用于介导在黑色素瘤细胞中的表达，且不会导致在大多数组织类型中的基因表达。处于该启动子调控下的Tv-PNP或tm-PNP基因主要在黑色素瘤中激活，而不是在病人的其它地方，如在美国专利US6017896中E. coli PNP所证明的。对于其它肿瘤类型特异性的启动子，例如，在存在所有实体肿瘤中的迅速分裂的内皮细胞中活化的启动子用于仅在原发性或转移性肿瘤中特异性激活Tv-PNP或tm-PNP基因。在这个过程中，使用阳离子脂质体将含有处于肿瘤特异性启动子控制下的Tv-PNP或tm-PNP基因的质粒DNA输送至细胞。例如，基于动物研究，100-400mg质粒DNA，其复合至1200-3600微摩尔的脂质DOTMA (1，2- 二油酰氧基丙基_3_三甲基溴化铵(1,2-di oleyloxypropyhl-3-trimethyl ammonium bromide))禾口 DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine))的1 1的混合物，可被用于输送Tv-PNP或tm-PNP基因至病人的肿瘤转移。然后可以使用上面描述量的前体药物。肿瘤的医药治疗可以因财务和治疗利益而进行。
Tv-PNP基因可选的用于激活用于治疗人脑癌的前体药物。在这个过程中，产生包含Tv-PNP或tm-PNP基因的逆转录病毒颗粒的细胞系注射进入病人的中枢神经系统 (central nervous system, CNS)内。核磁共振成像扫描仪(MRI scanner)是可操作的用于适当注射逆转录病毒产生细胞系进入肿瘤内。由于逆转录病毒只在分裂细胞中完全活跃，在癌症病人的头盖骨中的大部分分裂细胞位于肿瘤内，因此，逆转录病毒主要活跃在肿瘤自身内，而不是在大脑内的非恶性细胞内。包括肿瘤的大小和位置的病人的临床特征决定了要注射的生产细胞的量。例如，在用于手术无法接触的肿瘤的立体指南下给出在 30次注射每次100微升范围内的生产细胞的体积(注射的总体积约3毫升，大约IXlO8 产生细胞/毫升)。对于外科手术进行时可接触到的肿瘤，使用Tv-PNP或tm-PNP基因转移，注射100 μ L体积(约1 X IO8个细胞/毫升)，总注射体积达到10毫升，然后施用 F-araAMP(F-araA的前体药物)。这一策略设计用于允许杀死周边非分裂细胞和对周边非分裂细胞有毒性，并设计用于比以前用HSV dThd激酶和更昔洛韦的尝试大得多的肿瘤退化。
选定的细胞群的毁灭是通过靶向Tv-PNP或tm-PNP基因输送实现的。在靶向特定的细胞类型中利用病毒载体的自然取向或生理机能。例如，逆转录病毒证明在复制细胞中表现出增加的活性。选择性的逆转录病毒介导的基因转移到在普通(非恶性)细胞不复制的位置生长的复制的肿瘤细胞是动物和人体临床研究中治疗强大的靶向方法。可选择地， 病毒载体直接施用至特定位置，如实体瘤，从而集中基因转移到肿瘤细胞而非周围组织。这种选择性输送的概念已在基因通过腺病毒载体输送至小鼠肿瘤中得到证明。可以开发分子偶联物，以便受体结合配体将只结合至可选择的细胞类型，如已经证明的肺癌的凝集素介导的靶向。
靶向编码Tv-PNP或tm-PNP的基因或基因的表达至肿瘤中的小部分细胞，然后施用底物，对于介导肿瘤停滞或减少的退化是充分的。
病毒感染的细胞的治疗 除了抑制并经常杀死肿瘤细胞，在这里描述的方法也可用于杀死病毒感染的细胞。在杀死病毒的具体实施例中，选定的基因转移方法因其将裂解酶的表达靶向在病毒感染的细胞中的能力而被选择。例如，病毒感染的细胞利用特定的病毒基因序列去调控和允许基因表达，例如病毒特异性启动子。这样的序列是不存在于未受感染的细胞中的。用这样的病毒启动子将Tv-PNP或tm-PNP基因适当导向以在病毒感染的细胞中产生裂解酶的选择性表达。从而病毒感染的细胞对于施用计划转化为有毒形式的F-araA或其它底物是敏感的。
基因工程细胞的施用 还提供了用本发明的载体转化的宿主细胞。
为了某些应用，选择并施用接收了 Tv-PNP或tm-PNP基因的细胞至病人。此方法最通常涉及体外转移编码Tv-PNP或tm-PNP裂解酶的基因。接收发明的基因的细胞施用至宿主病人中，在那里它们产生治疗蛋白直至施用前体药物例如F-araA以去除工程细胞。此方法在细胞治疗中是有用的，如那些使用在形成用于在大脑内产生酪氨酸羟化酶的非复制的成肌细胞上的细胞治疗(Jiao et al. , Nature, 362 :450 (1993))。
PNP酶至细胞的盲接输送 和或不和前体药物一起的Tv-PNP或tm-PNP蛋白可选地直接输送至靶定细胞而不是Tv-PNP或tm-PNP基因。示例性地，能够裂解嘌呤类似物核苷的Tv-PNP或tm-PNP酶通过可用的重组蛋白技术使用市售可得试剂盒来制备。如用于生产细菌Tv-PNP蛋白的方法的例子，使用标准技术将Tv-PNP编码序列连接至pGEX-4T-l (Pharmacia, Piscataway，NJ) 的多克隆位点，以便与谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase，GST)融合蛋白 “密码框吻合”(注意，该载体的克隆位点允许编码序列在所有三种可能的转录读码框中插入，以便于这个步骤)。由此产生的质粒包含在IPTG诱导的原核tac启动子的转录调控下的 GST-PNP融合编码序列。阴道毛滴虫细胞用重组质粒转化，tac启动子用IPTG诱导。IPTG 诱导的细胞裂解，GST-PNP融合蛋白在谷胱甘肽kpharose 4B柱上通过亲和层析纯化。洗脱GST-PNP融合蛋白，该分子的GST部分通过凝血酶裂解去除。所有这些技术和试剂均是市售可得的(Pharmacia，PiSCataway，NJ)。用于重组蛋白生产的其它方法详细描述在出版的实验室手册中。
由于Tv-PNP或tm-PNP激活前体药物成为可扩散的毒素，在前体药物施用之前输送PNP蛋白至靶定细胞的外表面是可操作的以诱导治疗效果。通过多种技术，Tv-PNP 或tm-PNP蛋白是可输送至靶定细胞的。一个例子是例如通过直接注射在肿瘤块内可达到的位置，和或不和载体一起的蛋白直接应用至靶定组织。另一个例子是Tv-PNP或tm-PNP 蛋白连接至识别在肿瘤位点的抗原的单克隆抗体(Villa et al al. ,"A high-affinity human monoclonal antibody specific to the alternatively spliced EDA domain of fibronectin efficiently targets tumor neo-vasculature in vivo. " Int. J.Cancer. 2008 Jun 1 ；122 (11) :2405-13. Nissim et al. , "Historical development of monoclonal antibody therapeutics. '^Handbook of Exp. Pharmacol. 2008 ； (181) :3_18)。
用于连接功能蛋白至单克隆抗体的方法以前已经描述过。Tv-PNP或tm-PNP偶联的单克隆抗体是全身施用的，例如静脉注射(intravenously，IV)，并特异性结合至靶定组织。随后全身施用前体药物将导致在肿瘤位点附近局部产生可扩散的毒素。大量研究证实了使用这一技术去靶定特异性蛋白至肿瘤组织。除了单克隆抗体外，其它配体由于它们对靶定细胞的特异性可以选择，并根据这里教导的方法验证。
蛋白输送至特定靶点可选地使用脂质体实现。用于生产脂质体的方法已经描述 (如Liposomes :A Practical Approach)。通过在它们的外表面包含特异性配体或抗体， 脂质体可以靶向特定位点。示例性的例子是特异性肝细胞群通过在脂质体表面包含无唾液酸胎球蛋白(asialofetuin) (Van Berkel et al.，TargetedDiagnosis and Therapy, 5:225-249(1991))进行靶向。特异性脂质体剂型也可以实现靶向输送，如通过所谓的优选输送药物至植入的肿瘤的隐蔽性脂质体进行最佳举例证明(Allen，Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer，405-415 (1989))。脂质体注射或植入后， 未结合的脂质体从血液中清除，病人用在靶定位点由Tv-PNP裂解的嘌呤类似物前体药物如F-araA进行治疗。同样的，这个过程只需要合适的靶向载体的可得性。在更广泛的意义上说，靶向策略可以扩展到在PNP蛋白或基因输送后特异性输送前体药物。
可选择的，化合物是施用至对象的Tv-PNP蛋白的生物活性多肽片段。生物活性肽或肽片段可选的是Tv-PNP的突变体。可理解在任何特定位点的保守氨基酸的突变优选突变为甘氨酸或丙氨酸。进一步可理解任何中性电荷的、带电荷的、疏水的、亲水的、合成的、 非天然的、非人类的，或者其它氨基酸的突变也同样是可操作的。更加优选的突变涉及读码框移码突变以去除末端终止子TAA，而表达尾部突变的Tv-PNP (tmTv-PNP)。
可选地在野生型Tv-PNP蛋白的结构(一级，二级，或三级)中进行修饰和变化，它们包括在发明的化合物中，可能会或可能不会导致与在这里披露的示例性的多肽具有相似特征的分子。可理解，在保守氨基酸残基的变化最有可能影响所得到的蛋白的活性。然而， 进一步可理解，在可操作用于配体相互作用、阻碍或促进蛋白降解、细胞内或细胞外运输、 分泌、蛋白-蛋白相互作用、翻译后修饰如糖基化、磷酸化、硫酸化等等的氨基酸的变化可能导致发明的化合物的增加或减少的活性同时保持某种改变或维持生理活性的能力。用于序列中其它氨基酸的某些氨基酸替换已知没有发生明显的活性损失。
在作出这样的变化时，考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)。根据本发明，某些氨基酸可以替换成具有类似亲疏水性指数的氨基酸，并仍然导致具有类似的生物活性的多肽。每种氨基酸都基于其疏水性和电荷特性给予一个亲疏水性指数。这些指数是异亮氨酸(isoleucine) (+4. 5)；缬氨酸(valine) (+4. 2)；亮氨酸(leucine) (+3. 8)； 苯丙氨酸(phenylalanine) (+2.8)；半胱氨酸(cysteine)/ 半胱氨酸(cysteine) (+2.5)； 蛋氨酸(methionine) (+1. 9)；丙氨酸(alanine) (+1. 8)；甘氨酸(glycine) (-0. 4)；苏氨酸(threonine) (-0.7)；丝氨酸(serine) (-0.8)；色氨酸(tryptophan) (-0.9)；酪氨酸(tyrosine) (-1. 3)；脯氨酸(proline) (-1. 6)；组氨酸(histidine) (-3. 2)；谷氨酸 (glutamate) (-3. 5)；谷氨酰胺(glutamine) (-3. 5)；天门冬氨酸(aspartate) (-3. 5)；天冬酰胺(asparagine) (-3. 5)；赖氨酸(lysine) (-3. 9)；和精氨酸(arginine) (-4. 5)。
不打算限制于特定的理论，相信氨基酸的相对的亲疏水性性质决定了由此产生的多肽的二级结构，其反过来限定了多肽和其它分子的相互作用。已知在本领域一种氨基酸可以由另一种具有类似亲疏水性指数的氨基酸替换，并仍然获得功能上等同的多肽。在这样的变化中，亲疏水性指数在士2内的氨基酸的替换是优选的，在士 1内的氨基酸的替换是特别优选的，在士0. 5内的氨基酸的替换是更加特别优选的。
如上所述的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑到上述各种特点的示例性的替换是本领域技术人员众所周知的并包括(原始残基示例性替换)(丙氨酸甘氨酸，丝氨酸)，(精氨酸赖氨酸)，(天冬酰胺谷氨酰胺，组氨酸)，(天门冬氨酸谷氨酸，胱氨酸，丝氨酸)，(谷氨酰胺天冬酰胺)，(谷氨酸天门冬氨酸)，(甘氨酸丙氨酸)，(组氨酸天冬酰胺，谷氨酰胺)，(异亮氨酸亮氨酸，缬氨酸)，(亮氨酸异亮氨酸，缬氨酸)，(赖氨酸精氨酸)，(蛋氨酸亮氨酸，酪氨酸)，(丝氨酸苏氨酸)，(苏氨酸丝氨酸)，(Tip 酪氨酸)，(酪氨酸 色氨酸，苯丙氨酸)，和(缬氨酸异亮氨酸，亮氨酸)。因此，本说明书的具体实施例考虑上面记载的多肽的功能或生物等同物。特别是，多肽的具体实施例可以包括与感兴趣的多肽有大约50%、60%、70%、80%、90%和95%序列一致性的变体。
进一步可理解，在可操作以产生任何上述氨基酸替换或作为沉默突变例如以产生同义密码子的编码Tv-PNP的基因或其片段中的任何核酸替换在这里是同样可操作的。用于它们产生的这种替换和方法是本领域技术人员很容易知晓的。
令人惊讶地发现，对于特定的生物体，相对于相应的野生型PNP，tm-PNP具有更大的裂解活性。根据本发明，tm-PNP优选地涉及在与PNP核苷酸序列相关的末端150个核酸碱基内的移码突变，以便对所有已知的PNP野生型序列常见的终止密码子通过读码框移位去掉，且末端尾巴增加至表达的tm-PNP氨基酸序列，尾巴具有10-50个额外的氨基酸残基。 可理解，在野生型PNP核苷酸序列中的读码框移位是很容易通过插入或缺失一个或更多个核苷酸碱基而产生，条件是碱基插入或缺失是从终止密码子开始上游的非3的倍数。相对于野生型核苷酸序列的终止密码子，由此产生的尾巴对应于从邻近PNP核苷酸序列区域编码的氨基酸序列，或者进行增加。tm-PNP的尾巴的亲疏水性指数和在10至50个氨基酸残基之间的尾巴长度在这种tm-PNP酶施加至临床上重要的前体药物底物F-araA相对于MeP-dR 的优选的裂解中似乎是重要的因素。没有打算结合到特定的理论，相信相对于野生型酶，发明的tm-PNP的尾巴改变了配体对tm-PNP前体药物结合位点的接近。
底物的施用 可选地使用 Freidenreich et al.，Cancer Chemother :R印.,50 :219-244, (1966)的公式去确定用于人体对象的底物的最大耐受剂量。例如，全身施用每公斤每天 25mg(MeP-dR)共9天(共9次剂量)的小鼠产生某些毒性，但没有致命性。从这个结果，根据公式25mg/kg χ 3 = 75mg/m2，确定了人75毫克MeP-dR/m2剂量。期望这一数量或略低在人体中最大化杀死肿瘤细胞，而不杀死对象，从而对安全性造成良好的功效。这种效果的标准在癌症治疗领域是可接受的。更优选地，施加的药物水平从约10%至最大耐受剂量(例如，7.5mg/m2-0.75mg/m2。可理解，允许底物保持位于或临近肿瘤位置的施用方式在比全身施用的底物更低的剂量时将是有效的。
底物可以口服(orally),肠外(parenteralIy)(例如，静脉注射 (intravenously))>通过肌肉注身寸(intramuscular injection)、通过瘤内注身寸 (intratumoral injection)、通过月复月空注身寸(intraperitoneal injection)，或经皮 (transdermalIy)进行施用。所需底物的确切的量将依对象的不同而不同，取决于年龄、 体重、对象的通常健康状况、正在治疗的疾病的严重性、肿瘤的位置和大小、使用的特定的化合物、它的施用方式等等。合适的量可以通过本领域普通技术人员在这里的教导下只使用常规试验进行确定。通常，当考虑例如MeP-dR，或功能等同物时，剂量优选在大约 0. 5-50mg/m2范围内。对于前体药物例如氟达拉滨(fludarbine)，剂量通常在或低于已知在对象中安全的剂量。
取决于打算施用的方式，底物可以在药物组合物中以固体、半固体或液体的剂型进行施用，如，例如，片剂，栓剂，丸剂，胶囊，粉末，液体，或悬浮液，优选是以适于精确剂量的单次施用的单位剂量形式。组合物将包括结合药学上可接受的载体的有效量的选择的底物，此外，还可包括其它医药制剂，药物制剂，载体，或稀释剂。如这里所使用的术语“药学上可接受的”是指一种非生物的或要不然非期望的材料，其可以与选择的底物一起施用至个体，而不导致重大的非期望的生物影响或以有害方式与含有其的药物组合物中的任何其它组分相互作用。
对于固体组合物，传统的无毒固体载体包括，例如，药典级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。液体药学上可施用的组合物可以，例如，通过在赋形剂如水、生理盐水、葡萄糖水、甘油、乙醇等等中用最佳的药物佐剂溶解或分散活性组合物进行制备，从而形成溶液或悬浮液。如果需要，要施用的药物组合物还可以包含少量无毒辅助物质如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂，例如，醋酸钠或三乙醇胺油酸 (triethanolamine oleate)。制备这些剂型的实际的方法对于本领域技术人员来说是已知的，或将是明显的例如，见 Remington’ s Pharmaceutical Sciences。
对于口服施用，精细粉末或颗粒可以含有稀释、分散、和/或表面活性剂，并可以存在于水中或在糖浆中，在处于干燥状态的胶囊或袋装中或在可以包括悬浮剂的非水性溶液或悬浮液中，在可以包括粘合剂和润滑剂的片剂中，或在处于水或糖浆中的悬浮液中。期望或必要时，可以包括调味、防腐、悬浮、增稠、或乳化剂。片剂和颗粒优选口服施用形式，而这些可以覆有包衣。
静脉施用通常通过注射。注射剂可以制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液， 适于溶液或注射前的固体形式，或作为注射前处于液体中的悬浮液或作为乳化液。
含有Tv-PNP编码核酸的载体 本发明提供了含有编码Tv-PNP的DNA序列的载体。该载体可以进一步含有可操作地连接至核苷酸序列的调控元件，以便核苷酸序列在宿主中转录和翻译。优选地，载体是病毒或质粒。合适的病毒载体的示例性例子包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒和嵌合病毒构建体如腺病毒-逆转录病毒载体。其中有用的腺病毒载体是人腺病毒例如类型2或5以及动物源性腺病毒示例性地包括禽、牛、狗、鼠、羊、猪或猴来源的腺病毒。
使用腺相关病毒来源的载体用于体内和体外转移基因已经广泛描述，例如在美国专利US4797368和美国专利US5139941中。在一般情况下，缺失r印和/或cap基因并替换成要转移的基因。重组病毒颗粒通过将两个质粒共转染至用人辅助病毒感染的细胞株中来制备。转染的质粒包括含有编码本发明的PNP的两侧为病毒的两个反向重复区域的核酸序列的第一质粒和携带病毒的衣壳化基因(r印和cap)的第二质粒。然后重组病毒颗粒通过标准技术进行纯化。
PNP 表达 本发明的Tv-PNP酶在体内和体外转录和翻译。为了在体内产生该蛋白，含有编码特定Tv-PNP的核酸的载体在体内或体外导入细胞中。这可以包括通过这里描述的载体重新将细胞导回动物中。在另一具体实施例中，感兴趣的蛋白在体外产生，要么在细胞内要么在无细胞体系中。以这种方式产生的蛋白在体外使用或导入细胞或动物中以产生期望的结果。
Tv-PNP在哺乳动物细胞中的表达可能需要连接到Tv-PNP编码序列的真核转录调控序列。Tv-PNP基因可以在包含在商业质粒中的强组成型启动子/增强子元件(例如，SV40 早期启动子/增强子(pSVK30Wiarmacia，Piscataway, NJ)、莫洛尼小鼠肉瘤病毒长末端重复序列(pBPV，Pharmacia)、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(pMSG，Pharmacia)和巨细胞病毒早期启动子/增强子(pCMVii，Clontech, Palo Alto, CA))控制下表达。
其它组织特异性基因调控序列和元件可以用于调控编码合适的嘌呤类似物核苷裂解酶的基因的表达至除黑素瘤外的特定细胞类型，例如，组织特异性启动子示例性地包括白蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、牛奶乳清、神经丝蛋白、丙酮酸激酶、平滑肌α-肌动蛋白和绒毛蛋白的启动子。
下列非限制性例子说明了根据本发明的具体的反应流程和具体的发明化合物及中间体。涉及常规的生物技术的方法在这里进行了描述。这样的技术通常是本领域已知的，并详细描述在方法学专著，如 Molecular Cloning :A Laboratory Manuaal，2nd ed.， vol. 1-3, ed. Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989 ；禾口 Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York,1992 (with periodic updates) 中。免疫学方法(例如，抗原特异性抗体的制备、免疫沉淀和免疫印迹)描述在，例如， Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley&Sons, New York, 1991 ；禾口Methods of Immunological Analysis,ed. Masseyeff et al. , John Wiley&Sons, New York, 1992 中。
本发明的各个方面都通过下列非限制性例子进行了说明。例子只用于说明目的， 不对本发明的任何实践做任何限制。可理解可以做出变化和修改而不背离本发明的精神和范围。虽然例子通常涉及哺乳动物细胞、组织、体液或对象，本领域普通技术人员知道类似的技术和本领域已知的其它技术容易将例子用于其它哺乳动物例如人类。在这里例举的试剂均通常为哺乳动物物种之间交叉反应的，具有类似性质的替代试剂是市售可得的，本领域普通技术人员容易知晓这些试剂可以从何处获得。
底物选择 合适的底物的特点是与细胞毒性的裂解的嘌呤碱基类似物相比对哺乳动物细胞是相对没有毒性的。下面列出了底物的一些示例性的例子。一些化合物后包括通用缩写， 用分号并列 9-_ ( β -D-阿拉伯呋喃糖基)-2-氟腺嘌呤；F-araA，氟达拉滨(f ludarabine) 9-■ (2-脱氧-β -D-呋喃核糖基]-6-甲基嘌呤；MeP-dR 9-(β-D-呋喃核糖基)-2-氨基-6-氯-1-脱氮鸟嘌呤；ACDP-R 7-(β-D-呋喃核糖基)-3-脱氮鸟嘌呤 2-氟-2'-脱氧腺苷；F-dAdo 9-(5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-6-甲基嘌呤 2-氟-5'-脱氧腺苷 2-氯-2'-脱氧腺苷；Cl-dAdo，克拉屈滨(Cladribine) 5'-氨基-5'-脱氧-2-氟腺苷 9-_ (5-氨基-5-脱氧-β -D-呋喃核糖基)-6-甲基嘌呤 9-(a-D-呋喃核糖基)-2-氟腺苷 9-(2,3-双脱氧-β -D-呋喃核糖基)-6-甲基嘌呤 2'，3'-双脱氧-2-氟腺苷 9-(3-脱氧- β -D-呋喃核糖基]-6-甲基嘌呤 2-氟-3'-脱氧腺苷 9-(a-L-来苏呋喃糖基)-2-氟腺苷 9-α -L-来苏呋喃糖基)-6-甲基嘌呤 9-6-脱氧-β -D-allo呋喃糖基)-6-甲基嘌呤 9-6-脱氧-β -D-allo呋喃糖基)-2-氟腺苷 9-6-脱氧-α -L-talo呋喃糖基)_6_甲基嘌呤 9-6-脱氧-α -L-talo呋喃糖基)_2_氟腺苷 9-2,6-双脱氧-β -D-allo呋喃糖基)-6-甲基嘌呤 9-2,6-双脱氧-β -D-allo呋喃糖基)_2_氟腺苷 9-2,6-双脱氧-α -L-talo呋喃糖基)_6_甲基嘌呤 9-2,6-双脱氧-α -L-talo呋喃糖基)_2_氟腺苷 9-6，7-双脱氧-α -L-庚-6-yno呋喃糖基)_6_甲基嘌呤 9-6，7-双脱氧-α -L-庚-6-yno呋喃糖基)_2_氟腺苷 9-6，7-双脱氧-β -D-庚-6-yno呋喃糖基)-6-甲基嘌呤 9-6，7-双脱氧-β -D-庚-6-yno呋喃糖基)_2_氟腺苷 9-2,6,7-三脱氧-α -L-庚-6-yno呋喃糖基)_6_甲基嘌呤 9-2,6,7-三脱氧-α -L-庚-6-yno呋喃糖基)_2_氟腺苷 9-2,6,7-三脱氧-β -D-庚-6-yno呋喃糖基)_6_甲基嘌呤 9-2,6,7-三脱氧-β -D-庚-6-yno呋喃糖基)_2_氟腺苷 9-2，3-双脱氧-3-羟甲基-α -D-呋喃核糖基)-6-硫代鸟嘌呤 9-5，5- 二 -C-甲基-β -D-呋喃核糖基)-2-氟腺嘌呤 9-5，5- 二 -C-甲基-β -D-呋喃核糖基)-6-甲基嘌呤 9-5-脱氧-5-碘-β -D-呋喃核糖基)-2-氟腺苷 9-5-脱氧-5-碘-β -D-呋喃核糖基)-6-甲基嘌呤 9-5-脱氧-5-甲硫-β -D-呋喃核糖)-2-氟腺苷 9-5-脱氧-5-甲硫-β -D-呋喃核糖)-6-甲基嘌呤 进一步的例子在 Ichikawa E. and Kato K.，Curr. Med. Chem. 2001Mar ；8 (4)385-423中找到。
可理解，一些底物预计比其它底物具有更好的耐受性。例如，与其它已知酶相比，Tv-PNP以更快的速率裂解F-araA，以便提供更多的治疗选择。
实例1 =Tv-PNP表达载体的合成 阴道毛滴虫基因组DNA是由来自甲硝唑耐药株(R:⑶C955)的第一DNA克隆和来自敏感株(S3:CDC520)的第二 DNA克隆获得的。使用来自两个样本的下列引物采用 AccuPrime Pfx supermix (Invitrogen)通过 PCR 扩增 TvPNP 基因。引物基于从 TIGR 毛滴虫属基因组计划的网站下载的TvPNP序列设计。目前该序列在GenBank(XM 001323400)可得。这里使用的Tv-PNP引物，酶切位点包含在括号内，包括正向引物TvPNP-F :5’ -GTT AACGGATCCATGGCAACACCCCATAACTCTGCT-3，(Hpal&BamHI) (SEQ ID NO :1)。Tv-PNP 反向引物 TvPNP-R :5’ -TCTAGAGTTAACGTCCTTATAATTTGATTGCTGCTTC-3’ (Xbal&Hpal)(SEQ ID NO :2) 和 TvPNP-Rl :5，-ATAGTTTAGATCCGAGGACCAATCAT-3，(SEQ ID NO. 3)。野生型 Tv-PNP 的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。野生型Tv-PNP的氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示。
第一轮PCR是使用TvPNP-F和Tv-PNPRl引物进行的。然后，巢式PCR(第二轮)是使用来自第一轮PCR的产物和引物TvPNP-F和TvPNP-R进行的。PCR产物克隆到 pCR4Blunt-Topo 载体(Invitrogen 公司)中并测序(克隆 ID = pCR4 Blunt-TvPNP)，如图 3 所示。S株含有来自TIGR序列的一个碱基变化，但它没有改变密码子Argl02(CGC-> CGT)。 由于R克隆匹配TIGR序列，TvPNP(R)克隆用于进一步克隆。为了产生腺病毒表达TvPNP， 图3的TvPNP (R)用EcoRI和XbaI酶切并克隆入pACCMV. pLpA腺病毒转移载体的EcoRI和 XbaI位点。如图4所示的pACCMV-TvPNP是与pJM17 (Microbix)共转染的以在293细胞中通过同源重组获得重组Ad-TvPNP。由此产生的Ad-TvPNP通过Tv-PNP特异性PCR和Tv-PNP 活性分析鉴定。
使用两种不同载体以产生Lenti-TvPNP病毒。如图3所示的TvPNP (R)克隆进改造的PWPI载体(最初来自Addgene. org ；其改造成含有更多酶切位点用于克隆目的(pWPI-linker(+))。pWPI 载体在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)控制下表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。使用RneI和XbaI将TvPNP(R)从 pCR4Blunt-TvPNP分离，然后克隆进图5的pffPI-1 inker (+)载体的SnaBI和SpeI位点。 PmeI和SnaBI是钝端裂解，XbaI和SpeI产生相同的突出端。
TvPNP (R)在荧光素酶基因的位置单独克隆进pHR，CMV Luc W Sin_18载体 (per J. Bio. Chem.，Published on October l，2004as Manuscript M410370200)，以产生表达TvPNP而没有共表达绿色荧光蛋白的细胞系。使用BamHI和HpaI将TvPNP(R)从 pCR4Blunt-TvPNP分离，然后克隆进图6所示的pHR’ CMV Luc W Sin-18载体的BamHI和 XhoI位点(使用Klenow片段末端钝化)。
实例2 鉴定用于Tv-PNP酶的候选前体药物 下列方法有用于去鉴定用野生型Tv-PNP比野生型E. coli PNP或其它PNPs更加有效地裂解的底物。用这种方法鉴定的前体药物然后可以进一步在用于毒性测定、与各种药物载体施用的适宜性和其它药理特性的动物研究中进行评估。
该方法在体外定量测量底物的裂解。嘌呤类似物核苷(在500 μ 1 IOOmM HEPES, pH 7. 4，50mM磷酸钾中0. ImM)与100 μ g/ml Tv-PNP或野生型Ε. coli PNP相结合。反应混合物在25°C孵育1小时，通过煮沸每个样品2分钟从而停止反应。蛋白浓度和时间分析依赖于酶对特定底物的活性而不同。每个样本用反相高效液相色谱法进行分析以测量底物至产物的转换。核苷和嘌呤类似物用含有50mM磷酸二氢铵(95% )和乙腈(5% )的溶剂从 Spherisorb ODSI (5 μ m)柱(Keystone Scientific，Inc. ,State College,PA)洗脱。产物通过在254nm的吸收进行检测，并通过比较它们与真实对照样品的停留时间和吸收光谱进行鉴定。
表1显示在各种底物存在下，与野生型Tv-PNP相比，野生型E. coli PNP酶的活性。 许多化合物测试作为用于Tv-PNP的底物的有效性，与E. coli PNP平行比较。化合物包括各种腺苷、肌苷、MeP-dR、氟或氯取代的腺苷的类似物。酶与表中列出的100微摩每种化合物一起孵育，酶切效率通过用高效液相色谱法从核苷分离碱基进行测定。如表1所示，Tv-PNP 以速率(每小时每毫克32000纳摩尔)裂解F-araA，大约是E. coli PNP裂解F_araA的速度(每小时每毫克1250纳摩尔)的23倍。结果进一步得到证实，如图1所示，Tv-PNP对F araA的催化效率是E. coli PNP对F-araA的催化效率的25倍(Vmax/Km为944比38)。可理解，当Tv-PNP用于采用F-araA作为前体药物底物治疗病理状态时，Tv-PNP酶的更大的生物活性允许在损害异常细胞生长中具有更大的活性。由于报道F-araA在肿瘤表达野生型 E. coli PNP酶中导致完全应答，使用野生型Tv-PNP和F_araA的组合产生的毒性F-Ade的至少23倍的增长导致改善的抗肿瘤活性。
还注意到，从表1，与E. coli PNP相比，Tv-PNP对2-C1-2，-脱氧腺苷(Cl-dAdo， 克拉屈滨(cladribine))具有更大的活性。Tv-PNP以每小时每毫克320000纳摩尔的特定活性裂解Cl-dAdo，而相同的Cl-dAdo由E. coli以只有每小时每毫克39000纳摩尔的特定活性裂解。
表 1 Tv-PNP和野生型E. coli PNP的底物活性的比较 “ -，，表示没有检测到的裂解
权利要求
1.一种用于抑制哺乳动物癌细胞或病毒感染细胞的方法，包括提供阴道毛滴虫嘌呤核苷磷酸化酶或尾部突变的嘌呤核苷磷酸化酶临近哺乳动物癌细胞或病毒感染细胞；及将酶接触可裂解底物以产生细胞毒性嘌呤类似物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述底物是9-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-2-氟腺嘌呤(氟达拉滨)、克拉屈滨、虫草素类似物、2’，3’_双脱氧腺苷类似物、5’-甲基(talo)-6-甲基嘌呤-核糖苷、5’-甲基(talo)-2’-脱氧-6-甲基嘌呤-核糖苷、5’-甲基(alio)-6-甲基嘌呤-核糖苷、2-F-5’ -脱氧腺苷、或2-F-a-L-来苏-腺嘌呤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中提供所述酶是通过施用编码用于所述酶的在所述细胞中可表达的核苷酸序列的病毒载体。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，其中提供所述酶是通过直接注射、 感染、脂质体转染、或基因枪转化用于所述酶的在所述细胞中可表达的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，其中提供所述酶是通过直接注射所述酶临近所述细胞。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，其中提供所述酶是通过施用至经过改造以表达阴道毛滴虫嘌呤核苷磷酸化酶或尾部突变的嘌呤核苷磷酸化酶的对象或对象细胞。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，其中提供是通过细胞内输送编码所述酶的可表达的核苷酸序列。
8.一种由根据权利要求1所述的方法生产的组合物，其特征在于，包括哺乳动物癌细胞或病毒感染细胞的裂解液；阴道毛滴虫嘌呤核苷磷酸化酶或尾部突变的嘌呤核苷磷酸化酶；及可由所述酶裂解以产生细胞毒性嘌呤类似物的底物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，其中所述的尾部突变的嘌呤核苷磷酸化酶具有在10-50个氨基酸残基之间的尾巴。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，其中所述尾巴在相应的野生型嘌呤核苷磷酸化酶的0-10个氨基酸残基之间截断。
11.根据权利要求8-11任一所述的组合物，其特征在于，其中所述底物选自包括氟达拉滨、克拉屈滨、虫草素类似物、2’，3’ -双脱氧腺苷类似物、5’ -甲基(talo)-6-甲基嘌呤-核糖苷、5’ -甲基(talo)-2’ -脱氧-6-甲基嘌呤-核糖苷、5’ -甲基(alio)-6-甲基嘌呤-核糖苷、2-F-5’ -脱氧腺苷、或2-F- α -L-来苏-腺嘌呤的组。
12.根据权利要求8-12任一所述的组合物，其特征在于，还包括病毒蛋白。
13.一种用于抑制根据权利要求1-7任一所述的哺乳动物癌细胞或病毒感染细胞的试剂盒，包括含有编码阴道毛滴虫嘌呤核苷磷酸化酶或尾部突变的嘌呤核苷磷酸化酶的可表达的核苷酸序列的载体；及用于将所述载体导入细胞以表达所述阴道毛滴虫嘌呤核苷磷酸化酶或所述的尾部突变的嘌呤核苷磷酸化酶，然后施用嘌呤核苷磷酸化酶可裂解底物以产生细胞毒性嘌呤类似物的操作指南。
14.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，其中所述载体是逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、腺相关病毒、或液泡病毒(vaculovirus)。
全文摘要
一种用于抑制哺乳动物癌细胞或病毒感染细胞的方法，包括提供阴道毛滴虫嘌呤核苷磷酸化酶或尾部突变的嘌呤核苷磷酸化酶临近哺乳动物癌细胞或病毒感染细胞和将酶接触嘌呤核苷磷酸化酶可裂解底物以产生细胞毒性嘌呤类似物。该方法包括将含有磷酸化酶或编码相同的磷酸化酶的DNA序列的载体导入细胞中和输送有效量的底物例如9-(β-D-阿拉伯呋喃糖基)-2-氟腺嘌呤(F-araA)至所述细胞。
文档编号A61P35/00GK102186497SQ200980140441
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月17日 优先权日2008年8月15日
发明者威廉·B·帕克, 埃里克·J·索尔舍尔 申请人:Uab研究基金会, 南方研究所