专利名称：通过中和神经毡蛋白-2来诱导p53表达以用于治疗癌症的制作方法
通过中和神经毡蛋白-2来诱导P53表达以用于治疗癌症本发明涉及通过靶向神经毡蛋白-2来过表达P53肿瘤阻抑基因并诱导肿瘤细胞凋亡，从而治疗癌症。癌症的特征在于不受控的细胞增殖，其通常是由于上调(致癌基因)或下调(肿瘤阻抑基因)细胞增殖之基因中的突变所致。由于其不受控的增殖，肿瘤细胞在局部侵入健康组织，并可在发生进一步突变之后获得迁移进血流并从原始肿瘤增殖到远处从而形成转移的能力。但是，通过血管发生机制实现肿瘤新血管形成(neovascularization)对于肿瘤生长来说是必需的，因为任何细胞(特别是具有很高的氧和能量需求的肿瘤细胞)无法在远离血管超过几十毫米以外的地方存活。因此，目前的抗癌治疗一方面将肿瘤细胞本身作为主要的靶标，另一方面将肿瘤血管发生作为主要靶标。关于抗血管发生的策略，已经证明癌症发展和血管发生中涉及生长因子，特别是 EGF或VEGF (血管内皮生长因子)。已开发了一些靶向VEGF作用的分子作为抗血管发生药物贝伐单抗(安维汀 (Avastin ))，其为抗VEGF的人源化单克隆抗体，自2004年以来已用于治疗转移性结肠直肠癌；舒尼替尼(simitinib)和索拉非尼(sorafenib)，其为抑制 VEGF/VEGF-受体通路中信号转导的分子，已用于抗血管发生策略以治疗转移性肾癌。关于靶向肿瘤和肿瘤细胞的策略，手术切除肿瘤组织(在其可行时)、实体瘤放射疗法、目标为增强针对癌细胞的免疫应答的免疫疗法以及化学疗法代表了标准的治疗。在认识癌形成分子机制方面的重大进展使得有可能开发出新的化学疗法，但是其有效性取决于待治疗癌症的类型以及所影响的器官。另外，许多癌症也产生严重的公共卫生问题，并已证明对常规治疗有抗性。例如，胃肠癌症(胰癌、胆管癌、结肠直肠癌)在其自然病程中很快变得对化学疗法有抗性。编码P53蛋白的肿瘤阻抑基因的丧失是解释肿瘤细胞对凋亡的抗性以及对常规抗赘生物治疗(如化学疗法或放射疗法)的抗性的主要机制之一。这是因为P53蛋白的功能是停滞细胞周期或者诱导细胞应答于细胞DNA损伤或致癌基因活化而凋亡。因此，p53蛋白在细胞周期控制以及基因组完整性的维持方面起中心作用，这通过允许细胞周期中断以修复基因异常或者使细胞通过凋亡而破坏来实现。由于P53对于保护生物体对抗异常或非受控细胞分裂的作用来说必不可少，因此，P53的缺少、其低表达或者非功能性P53蛋白的表达导致肿瘤细胞的存活。在体外研究模型和小鼠模型中，已经显示通过基因转移而恢复的p53表达促进了癌症消退，并改善细胞毒治疗的有效性。体外研究还显示，在表达野生型蛋白质和相对于野生型蛋白质具有显性失活作用的突变体P53蛋白的细胞中，用特异性靶向编码突变体p53 蛋白之 mRNA 的 siRNA 进行的干扰重建了 p53 功能(Martinez et al. P. N. Α. S. ,99(23) 14849-54,2002)。另外，还显示了，可以通过使这些蛋白质功能性构象稳定而“重新活化”突变体Ρ53蛋白。CP-31398、PRIMA-I和MIRA-I分子(所开发的第一批具有此能力的分子) 已经在人异种移植模型中成功地用于抑制肿瘤生长(综述参见，例如Levesque & festman， Carcinogenesis.，28(1) 13-20，2007)。因此，功能性p53蛋白表达的恢复以及此蛋白质过表达的诱导代表了抗肿瘤治疗开发中的关键目标。本发明人目前已经证明，神经毡蛋白-2(neur0pilin-2，NRP-2)与p53蛋白表达之间存在负相关，并出人意料地显示，可通过使用siRNA抑制神经毡蛋白-2表达来诱导或提高p53表达。神经毡蛋白-2是一种约130kDa的跨膜糖蛋白，是信号素(semaphorin)(特别是信号素3F)和VEGF家族生长因子的受体。它在人中在神经元、内皮细胞和成骨细胞以及众多赘生物中表达。其由以下构成约40个氨基酸的胞质内结构域，跨膜结构域，以及胞外结构域。该胞外结构域由以下构成由2个亚结构域(ala2)组成的结构域Α、由2个亚结构域(blb2)组成的结构域B，以及结构域C。已显示，B结构域构成VEGF结合位点，而与信息素3F的结合则同时涉及A结构域和B结构域(Geretti et al.，J. Biol. Chem.，282， 25698-707,2007) ；C结构域部分涉及NRP-2的寡聚化。在许多情况下，神经毡蛋白是癌细胞表达的唯一的VEGF受体。(Bielenberg et al. Exp. Cell. Res. ,312(5) :584_593，2006)，一些研究显示，神经毡蛋白的表达(或者甚至过表达)通常与肿瘤生长的提高以及与癌症的侵袭及转移性特征的提高相关联，还与不良的预后相关联。另外，许多观测结果表明，这些受体通过活化血管发生而在肿瘤发展中起关键作用特别地，VEGF与NRP-2 二者的结合负责促血管发生活性，由VEGF受体VEGFRl和NRP-2 的短胞质内结构域之间的协作所介导。已有报道称，NRP-2能够诱导VEGFRl受体以及AKT蛋白的磷酸化，由此利于癌症的发展，并且在异种移植物中通过siRNA对神经毡蛋白-2的阻抑对抗了转移的出现并减小肿瘤大小(Gray et al. J. Natl. Cancer Inst. , 100 :109-120， 2008)。另外，已显示针对NRP-2的B结构域中VEGF结合位点的抗NRP-2抗体(也称为抗 Nrp2B)可减少肿瘤的淋巴血管发生并减少转移的形成；该抗体通过抑制淋巴内皮细胞迁移而起作用，但是对肿瘤细胞的迁移、增殖或凋亡没有作用(Caunt et al. ,Cancer Cell, 13, 331-42,2008)。本发明人已产生了抗NRP-2抗体，并注意到其中一些在p53表达和肿瘤细胞凋亡诱导方面产生与siRNA抑制NRP-2相同的作用，并且这些作用是不依赖于VEGF的。另外， 已注意到，在体外和在小鼠模型中体内，这些抗体增强了抗癌治疗的有效性。这些数据开创了新的治疗思路，特别是在开发针对化学疗法或放射疗法或其他抗癌剂致敏的新策略的可能性方面。因此，本发明的一个主题是抗人神经毡蛋白-2抗体，或者来源于所述抗体的人神经毡蛋白-2的配体，其特征在于其与表达人神经毡蛋白-2之肿瘤细胞的结合诱导所述肿瘤的凋亡。有利地，除了诱导表达人神经毡蛋白-2的肿瘤细胞凋亡的能力之外，本发明的抗人神经毡蛋白-2抗体或配体还具有下列特征-它们诱导P53表达，并且它们诱导凋亡的能力依赖于此p53表达(其被p53抑制剂 pifithrin-α 降低)；-它们与神经毡蛋白结合的特性以及它们诱导凋亡的能力不依赖于VEGF(VEGF的存在不改变它们与表达人神经毡蛋白-2的肿瘤细胞表面结合及其诱导所述细胞凋亡的能力)。
由此，可根据诱导表达人神经毡蛋白-2之肿瘤细胞凋亡的能力和/或根据上述一个或多个其他特征，从抗人神经毡蛋白-2抗体或其衍生配体中选择本发明的抗体。本发明的抗体可以是天然的多克隆或单克隆抗体，或是重组抗体，特别是嵌合或人源化抗体。术语“嵌合抗体”旨在表示这样的抗体，即具有其来源单克隆抗体的可变结构域，该可变结构域与另一种抗体(优选人抗体)的恒定结构域相偶联。术语“人源化抗体”表示最初由非人动物(优选小鼠)产生的抗体，其保留神经毡蛋白-2结合特异性，但是其中为减少其在人中的免疫原性，将尽可能多的小鼠序列替换为相应的人序列。对于可变结构域，所替换的序列一般为FR(构架)区，即位于高变环(CDR) 之间的序列。 本发明的嵌合或人源化抗体优选是IgG类免疫球蛋白，特别是IgGl、2、3或4同种型。“来源于抗神经毡蛋白-2抗体的人神经毡蛋白-2配体”的表述旨在表示包含所述抗体的至少重链⑶R3和轻链⑶R3的任何神经毡蛋白-2配体，优选还包含所述抗体重链和轻链的⑶R2和/或⑶R1。具体地，根据本发明的神经毡蛋白-2配体可以是-本发明的抗神经毡蛋白-2抗体的任何片段，其包含所述抗体中至少重链和轻链的⑶R3 (优选还包含⑶R2和/或⑶Rl)；-任何重组蛋白，包括重组免疫球蛋白分子，其包含如上所定义的本发明抗神经毡蛋白-2抗体片段。特别地，本发明的抗神经毡蛋白-2抗体片段是Fv、dsFv、Fab、Fab' 2或scFv片段。Fv片段由抗体重链和轻链的可变结构域VH和VL构成，其彼此通过疏水相互作用结合。 dsFv片段由通过二硫桥连接的VH: VL 二聚体构成。scFv片段由抗体重链和轻链的可变部分构成，其彼此通过柔性接头相连(Clackson et al. ,Nature, 352 :624_628，1991)，从而形成单链蛋白质。Fab片段由木瓜蛋白酶对免疫球蛋白分子的作用产生，每个片段含有轻链以及重链的前半部分，彼此通过二硫桥相连。可通过用胃蛋白酶处理抗体而获得F (ab' )2 片段该片段包含两个Fab片段以及铰链区的一部分。可通过切割铰链区中的二硫桥而从 F(ab' ) 2片段获得Fab'片段。也可组合这些抗原结合片段以获得多价衍生物，例如“双抗体(diabody) ”或“三抗体(triabody) ”，其产生自2个或3个这些抗原结合片段的结合。特别地，包含本发明抗神经毡蛋白-2抗体片段的重组蛋白可以是-将至少一个本发明抗神经毡蛋白-2抗体片段与至少一个其它抗体片段相连的蛋白质；例如，双特异性免疫球蛋白，抗神经毡蛋白-2抗体的Fv或Fab片段与具有不同特异性之抗体的Fv或Fab片段的缀合物，由抗神经毡蛋白-2片段的scFv片段与具有不同特异性之抗体的Fv或Fab片段相连而产生的“双特异性双抗体”；-将至少一个本发明抗神经毡蛋白-2片段与延长其体内施用时的血浆半衰期的分子相连的蛋白质，所述分子特别是分子量足以使得由此获得的融合多肽的分子量大于肾过滤阈值的水溶性多肽。嵌合或重组抗体、scFv片段及其衍生物等可通过常规遗传工程技术获得，例如 Sambrook et al.所描述的(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N· Y·，1989)。编码本发明抗神经毡蛋白-2抗体可变区的多核苷酸可通过从产生所述抗体的杂交瘤cDNA文库中克隆所述区域而获得。也可基于所述可变区的核苷酸序列而完全或部分地通过核酸合成来制备它们。获得人源化抗体的多种方法本身也是公知的(综述参见例如，Almagro & Fransson, Frontiers in Bioscience,13,1619-1633,2008)。可以提及的是基于CDR接枝的方法，其将非人抗体的CDR转移到人来源抗体的构架区(FR)中(参见例如，Routledge et al. , ‘‘ Reshaping antibodies for therapy", JAL Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylatic and Therapeutic Applications in Man, 13-44, Academic Titles, Nottingham, England, 1993,或 Roguska et al. ,Protein Engineering, 9 (10) :895-904,1996)。CDR 接枝通常通过优化构架区来完成，其修饰构架区的一些残基，以增加人源化抗体的抗原结合亲和力。组合文库的使用使得有可能简化此优化步骤(Rosok et al. J. Biol. Chem. 271 :22611-22618,1996 ；Baca et al. J. Biol. Chem. 272 10678-10684，1997)。抗体人源化的另一种策略由以下组成仅仅保留原始抗体重链和轻链的CDR3，以及从人V基因的天然文库中选择剩余的序列(Rader et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 :8910-8915,1998)。本发明抗人神经毡蛋白-2单克隆抗体的两个实例是如下所述的抗体ITAC-Bl和 ITAC-B2。这些单克隆抗体是本发明人根据其诱导表达NRP-2之肿瘤细胞发生凋亡的能力来选择的。测定了 ITAC-Bl和ITAC-B2重链和轻链的序列。这些序列以及推出的多肽序列显示于下表KITAC-Bl的轻链和重链)和下表2(ITAC-B2的轻链和重链)中。核苷酸序列还显示于附带的序列表中，分别为编号SEQ ID No. 1、3、5和7，多肽序列也分别显示于编号SEQ ID No. 2、4、6 和 8。另外，根据布达佩斯条约，产生ITAC-Bl抗体的CNCM 1-4054杂交瘤于2008年7月 30日以保藏号CNCM I-40M保藏于法国国家微生物培养物保藏中心(Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15, France)。表 权利要求
1.抗人神经毡蛋白-2抗体，其特征在于其与表达人神经毡蛋白-2的肿瘤细胞的结合诱导所述肿瘤细胞发生凋亡。
2.根据权利要求1的抗人神经毡蛋白-2抗体，其选自i)包含ITAC-Bl抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的抗体，所述结构域分别由序列 SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 4 定义； )包含ITAC-B2抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的抗体，所述结构域分别由序列 SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 8 定义。
3.人神经毡蛋白-2的配体，其特征在于其至少包含权利要求1和2中任一项所述抗体的重链⑶R3和轻链⑶R3。
4.根据权利要求3的人神经毡蛋白-2的配体，其特征在于其还包含ITAC-Bl或 ITAC-B2抗体的重链和轻链的⑶R2和/或⑶R1。
5.权利要求1或2所述抗体或者权利要求3或4所述配体用于制备抗肿瘤药物的用途。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于所述药物通过在表达人神经毡蛋白-2的肿瘤细胞中提高P53的表达来诱导所述细胞发生凋亡。
全文摘要
本发明涉及抗人神经毡蛋白-2抗体或来源于这些抗体的配体用于获得在抗癌治疗中旨在增加p53表达和诱导肿瘤细胞凋亡的药物的用途。
文档编号A61K39/395GK102498130SQ200980142192
公开日2012年6月13日 申请日期2009年8月26日 优先权日2008年8月27日
发明者克里斯托夫·博尔格, 卡米耶·格伦德克莱门特, 约翰·维德内斯 申请人:Efs勃艮第弗郎什孔泰, 弗郎什孔泰大学, 艮-普鲁勃迪亚克隆公司