专利名称：针对组织因子途径抑制剂的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性地结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗体。
背景技术：
在具有凝血病的受试者中，诸如在具有A型和B型血友病的人类中，凝固级联的不同步骤出现功能障碍，这是由于例如凝血因子不存在或存在不足。凝固级联的一部分的这种功能障碍导致不充分的血液凝固和可能威胁生命的出血或对内部器官(诸如关节)的损伤。诸如具有A型和B型血友病的人类等受试者可以接受凝血因子补偿疗法，分别诸如外源性FVIIIa或FIXa。但是，这样的患者处于形成对这样的外源性因子的“抑制剂”(抗体) 的危险中，使得以前有效的治疗失效。此外，外源性凝血因子仅可以静脉内施用，这对于患者而言相当不便和不适。例如，婴儿和幼儿可能必须具有手术地插入胸静脉内的静脉内导管，以便保证静脉使用(venous access).这使他们处于形成细菌感染的高危中。具有凝血病的受试者只有在已经开始出血以后才能接受治疗，而不是作为预防性措施，这经常影响他们的一般生活质量。因而，一般而言，在血友病群体中，具体地在具有凝血病的受试者中，仍然存在许多未获得满足的医学需要。当血管壁受损伤时，组织因子(TF)会被暴露于循环血液的内容物，TF在携带TF 的细胞的表面上与因子VII/活化的因子VII (FVII/FVIIa)形成复合物。这导致因子X (FX)向ha的活化，所述Fxa与Fva —起产生有限量的凝血酶(FIIa)。小量凝血酶会活化血小板，这导致磷脂的表面暴露，所述表面暴露会支持由FVIIIa/FIfe组成的tenase复合物的结合。所述tenase复合物产生大量的ha，所述Fxa随后促进全凝血酶爆发(burst)。机械上强的纤维蛋白结构的形成和止血塞的稳定化，需要全凝血酶爆发。FVIII或FIX在血友病患者中缺失或以低水平存在，且由于tenase活性的缺失，产生Fxa的能力较低，且不足以支持凝固的传播期(propagation phase)。相反，TF-介导的开始期(initiation phase) 不依赖于tenase复合物的形成。但是，在最初的Ffe产生后不久，TF-途径被血浆抑制剂阻断。通过中和ha的催化活性，并通过在Fxa存在下抑制TF-FVIIa复合物，组织因子途径抑制剂(TFPI)会下调节正在进行的凝固。TFPI抑制在细胞表面上的TF/FVIIa/F)(a复合物，或者抑制释放的ha (继之为FVIIa/TF抑制)。
发明内容
发明人已经鉴别出特异性地结合组织因子途径抑制剂(“TFPI”，有时称作 “TFPI1”)并从而调节它的活性的单克隆抗体。本发明涉及这些抗体和从这些抗体衍生出的或具有与这些抗体类似的结合性质的其它有关的抗体。因此，本发明涉及这样的抗体，其特异性地结合组织因子途径抑制剂(TFPI)，并减少在例如(a)人FVIII-缺乏的血浆和/或(b)人全血中的凝固时间。一种抗体包含SEQ ID NO: 4的轻链可变区和SEQ ID NO: 8的重链可变区。另一种抗体包含SEQ ID NO: 15的轻链可变区和SEQ ID NO: 18的重链可变区。本发明也提供了编码本发明抗体的多核苷酸，诸如编码本发明的抗体轻链和/或抗体重链的多核苷酸。本发明也提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或多核苷酸和药学上可接受的载体或稀释剂。还提供本发明的抗体、多核苷酸和组合物用于(a)治疗或预防凝血病(出血障碍)，或(b)刺激血液凝固。也就是说，本发明提供了(a)治疗或预防凝血病(出血障碍) 的方法，或(b)刺激血液凝固的方法，所述方法包括，给有此需要的患者施用治疗或预防有效量的本发明的抗体、多核苷酸或组合物。此外，本发明提供了本发明的所述单克隆抗体的给药方案。
图1显示了小鼠抗-TFPI4F36A1B2 (在本文中也称作MuTFPI4F36或4F36)的VH (A)和VL (B)结构域的序列，其与人源化的TFPI4F36的人种系和最初的CDR移植形式的序列相比对。在序列的上面指出了 Kabat编号方案。图2显示了鼠抗体TFPI4F36A1B2 (MuTFP14F36)的VH和VL序列的核苷酸序列和翻译的多肽序列。图3显示了鼠4F36抗体MuTFPI4F36的Fab片段的轻(A)和重(B)链的氨基酸序列。在序列上面显示了根据Kabat的编号。在Kabat编号中，用粗体带有下划线的文字突出与CDR环对应的位置。用粗体带有下划线的文字突出构成互补位的氨基酸残基。从 MuTFPI4F36 Fab和TFPI K2结构域之间的复合物的X-射线结构，确定互补位，并定义为这样的Fab残基，其具有离K2中的重原子在小于4 A距离内的重原子。图4显示了 TFPI的序列(省略信号肽序列)。用粗体显示Kunitz结构域TFPI Kunitz结构域1 =氨基酸沈-76 ；TFPI Kunitz结构域2=氨基酸97-147 ；TFPI Kunitz结构域3 =氨基酸188-238。用斜体显示TFPI的C-端部分氨基酸M0-276。图5显示了 TFPI中的残基的相对可及性。具有大于40%可及性的残基是氨基酸 94-95、98、100-110、118-121、123-124、131、134、138-142 和 144-145。图 6 显示了 TFPI Kunitz 结构域 2 (K2)禾Π MuTFPI4F36 Fab 片段(i^ab)之间的复合物的SEC HPLC分析。在观0 nm紫外线检测到游离K2 (实线，rt 13.1 min，显示在 13. 134处的峰)、游离Fab (破折线，rt 11. 7 min,显示在11. 676处的峰)和复合物(点线，rt 11.5 min,显示在11. 496处的峰)的SEC-HPLC色谱图。复合物样品含有 20%过量的K2。图7显示了 MuTFPI4F36 Fab:K2复合物的总结构。用淡灰色显示轻链，用深灰色显示重链。根据Kabat方案定义的⑶R环被标记为L1-L3和H1-H3。图8显示了当与MuTFPI4F36 Fab络合时，TFPI的K2结构域的结构(Fab分子未显示)。标记了 N-和C-末端和二级结构元件。图9显示了 K2结构的主链重叠。显示了 K2溶液、与MuTFPI4F36 Fab络合的K2和与猪胰蛋白酶络合的K2之间的结构差异。图10显示了在K2上的MuTFPI4F36结合表位。(A) TFPI的K2结构域的图像表示，用球和棒代表在结合表位中包含的残基的侧链。(B)与A—样，但是添加了表面。(C) 映射到基本序列上的结合表位。大写的粗体、斜体和带有下划线的字母分别对应着接触 MuTFP14F36 Fab 的仅重链(位置 10、11、13、28、31、33 和；35)、仅轻链(位置 21、23 和 50) 和重链和轻链二者(17、19、34和36)的K2-结合表位中的残基。指示了二级结构元件(h = 螺旋，s =折叠)(在位置5-8和50-56处的螺旋，和在位置20- 和31-37处的折叠)。 用灰色突出的残基(位置1-2和59-66)存在于表达的蛋白中，但是在晶体结构中没有观察到(因为N-和C-末端是柔性的)。图11显示了 K2:MuTFPI4F36 Fab和K2:HzTFPI4F36 Fab复合物的主链痕迹的对比，证实了鼠MuTFPI4F36和人源化的HzTFPI4F36 Fab片段的相同结合模式。用灰色显示 K2:MuTFPI4F36 Fab，用黑色显示K2:HzTFPI4F36 Fab。使结构重叠，以优化Fab片段的可变区之间的匹配。图12显示了抗-TFPI单克隆抗体(mAb)对在用TNF α /ILl β刺激的HUVEC的表面上的TF/FVIIa-诱导的FX活化的影响。在有在缓冲液中的0-20 nM mAB (mAbTFPI 2021 或mAb 2974) ,50 pM FVIIa (NovoSeven )和50 nM FX存在下，测量FX的活化，所述缓冲液含有25 mM HEPESU37 mM NaCl,3. 5 mM KCl,5 mM CaCl2U mg/ml BSA (0. 1%) pH 7.4， 其覆盖在HUVEC单层上。在酰胺分解(amidolytic)试验中，测定产生的FXa活性，通过在 405 nM的吸光度增加测量S-2765。图13显示了抗-TFPI mAb对在MDA-MB 231细胞的表面上的TF/FVIIa-诱导的 FX活化的TFPI抑制的影响。在有在缓冲液中的0-20 nM mAb (Hz mAbTFPI 2021或mAb 2974),2. 5 nM f I-TFPIUOO pM FVIIa和50 nM FX存在下，测量FX的活化，所述缓冲液含有 25 mM HEPESU37 mM NaCl,3. 5 mM KCl,5 mM CaClU mg/ml BSA (0. 1%) pH 7. 4，其覆盖在MDA-MB 231细胞单层上。在酰胺分解试验中，测定产生的FXa活性，通过在405 nM的吸光度增加测量S-2765。图14显示了在TFPI Kunitz 2结构域内的选择的残基的单个氨基酸丙氨酸置换对与mAbTFPI 2021 (“mAb4F36”)和mAl^974 (n=2)的结合的影响。选择的残基是mABTFPI 2021结合表位的一部分。在图IOC中指出了氨基酸残基的编号。图15显示了在用对照IgG (血友病)或用鼠抗-TFPI抗体TFPI-4F36A1B2 (“4F36”，MuTFPI4F36)治疗后，在暂时患血友病的兔中测得的表皮出血时间和失血。图 16 显示了在诱导出血后 5 分钟用 HzTFPI4F36 ( “抗-TFPI”，mAbTFPI 2021) (2 mg/kg)或Novc^even (9mg/kg)治疗的具有抗体-诱导的血友病的兔的“根据需要”治疗中的表皮出血时间(单一观测；平均值士 SEM)和失血(平均值+SEM)。观察出血1 小时(3600秒)。图17显示了当在诱导出血之前35分钟用HzTFPI4F36 ( “抗-TFPI”，mAbTFPI 2021)(剂量0.5、1、2 mg/kg)或同种型对照抗体预治疗时，在具有抗体-诱导的血友病的兔中的表皮出血时间(单一观测；平均值士 SEM)和失血(平均值+SEM)。观察出血 1小时(3600秒)。图18显示了在用抗-FVIII抗体刺激、施用抗-TFPI-抗体(“抗-TFPI ab”、MuTFPI4F36)、随后使其出血单个动物中测量的血小板数目。这在对照血友病模型中和在有本文所述的鼠抗-TFPI抗体4F36 (MuTFPI4F36)存在下进行。图19显示了在第0小时施用20 mg/kg HzTFPI4F36的兔中的游离HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的血浆浓度。在96小时0天)、168小时(7天)和240小时(10天)， 进行表皮出血实验。点线指示在剂量响应研究中发现的HzTFPI4F36的‘有效浓度’范围 (参见图17)。图 20: 左图 血浆 HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)(左轴 O)和表皮出血时间(平均值士 SEM;·)。右图血浆HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)(左轴O)和失血(平均值+SEM ;■)，当在诱导出血之前4、7或10天用20 mg/kg HzTFPI4F36 (n=8)或同种型对照抗体(n=12)预处理时，在具有抗体-诱导的血友病的兔中。观察出血 1小时(3600秒)。图21显示了在静脉内和皮下给猴施用HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)以后的血浆浓度水平。在下面的3个图中，给2只猴施用3剂量的HzTFPI4F36，间隔2周。在左下图中，施用3个剂量2、20和80 mg/kg，在中下图中，施用3个剂量20、80和160 mg/kg ；在右下图中，施用3个剂量80、160和200 mg/kg。在左上图中，给3只猴施用单次剂量的20 mg/ kg;在右上图中，给3只猴施用单次静脉内剂量。在图中，点代表单个观察结果，而线代表模型拟合。图22显示了每天皮下施用的1 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。水平实线代表模拟的血浆浓度水平，水平点线代表从效果数据推导出的有效浓度上限。图23显示了每3周静脉内施用的15 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。 水平实线代表模拟的血浆浓度水平，水平点线代表从效果数据推导出的有效浓度上限。图M显示了每2周静脉内施用的20 mg/kg HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的模拟。水平实线代表模拟的血浆浓度水平，水平点线代表从效果研究推导出的预期的靶物饱和度。序列表简述
SEQ ID NO: 1给出了人TFPI的氨基酸序列(信号肽序列被省略)。SEQ ID NO: 2给出了用于测定抗体的结合表位的构建体的氨基酸序列。所述构建体包含来自人TFPI的氨基酸91-150和C-端Hk6标签。SEQ ID NO: 3、5 和 4 给出了 MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的轻链可变结构域(VL)的多核苷酸(有义和反义)和多肽序列。SEQ ID NO: 6给出了 MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的轻链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。SEQ ID NO: 7、9 和 8 给出了 MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的重链可变结构域(VH)的多核苷酸(有义和反义)和多肽序列。SEQ ID NO: 10给出了 MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2)单克隆抗体的重链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。SEQ ID NO: 11给出了用于重链可变结构域扩增的反向引物的序列，SEQ ID N0: 12给出了用于轻链扩增的反向引物的序列。SEQ ID N0: 13-15 分别提供了人源化的单克隆抗体 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 的轻链可变结构域(VL)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。信号肽序列被省略。SEQ ID N0: 16-18 分别提供了人源化的单克隆抗体 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021)的重链可变结构域(VH)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。SEQ ID NO: 19-21 分别提供了人源化的单克隆抗体 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 的轻链(LC)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。SEQ ID NO: 22- 分别提供了人源化的单克隆抗体 HzTFPI4F36 (mAbTFPI2021) 的重链(HC)的有义多核苷酸、反义多核苷酸和多肽序列。信号肽序列被省略。SEQ ID NO: 2546分别提供了 CDR-移植的HzTFPI4F36的轻链可变结构域的核酸和氨基酸序列。信号肽序列被省略。SEQ ID NO: 27- 分别提供了 CDR-移植的HzTFPI4F36的重链可变结构域的核酸和氨基酸序列。信号肽序列被省略。SEQ ID NO:四提供了 CDR-移植的HzTFPI4F36 (人κ链)的轻链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。SEQ ID Ν0: 30 提供了 CDR-移植的 HzTFPI4F36 (它是人 IgG4 (S241P))的重链的氨基酸序列。信号肽序列被省略。SEQ ID N0: 31提供了种系序列VKII_A18/JK4，其用于MuTFPI4F36的轻链的人源化。信号肽序列被省略。SEQ ID N0: 32提供了种系序列VH3_21/JH6，其用于MuTFPI4F36的重链的人源化。信号肽序列被省略。SEQ ID N0: 33提供了 MuTFPI4F36AlB2重链Fab的氨基酸序列。信号肽被省略。SEQ ID N0: 34提供了 HzTFPI4F36重链Fab的氨基酸序列。信号肽被省略。
具体实施例方式本发明涉及结合TFPI的抗体。所述抗体优选地特异性地结合TFPI，即它们结合 TFPI，但是它们不结合或以较低的亲和力结合其它分子。具体地，本发明涉及结合TFPI并调节它的活性的抗体。本发明的抗体因而可以具有缩短凝固时间的能力。例如，本发明的抗体可以具有缩短在人FVIII-缺乏的血浆中的凝固时间或减少凝固所需时间(通过人全血的凝血弹性描记术(TEG)分析来测量)的能力。本发明也涉及这种抗体的应用，诸如治疗和药物用途。本文使用的术语TFPI包括TFPI的任意天然存在形式，其可以源自任意合适的生物体。例如，用于本文所述用途的TFPI可以是哺乳动物TFPI，诸如人、小鼠、大鼠、灵长类动物、牛、羊或猪TFPI。优选地，所述TFPI是人TFPI。所述TFPI可以是TFPI的成熟形式， 诸如已经在合适的细胞内经历翻译后加工的TFPI蛋白。这样的成熟的TFPI蛋白可以例如被糖基化。所述TFPI可以是全长TFPI蛋白。术语TFPI也包括这样的TFPI分子的变体、 同种型和其它同系物。变体TFPI分子通常特征在于具有与天然存在的TFPI相同类型的活性，诸如中和FXa的催化活性的能力，或抑制TF-FVIIa/FXa的复合物的能力。本发明抗体具有结合TFPI的能力。优选地，本发明抗体会特异性地结合TFPI。也就是说，与它结合另一种分子的亲和力相比，本发明抗体优选地以更大的结合亲和力结合 TFPI。本发明的抗体可以具有结合或特异性地结合本文所述的TFPI分子的能力，诸如本文所述的任意靶分子。术语“结合亲和力”在本文中用作2个分子(例如抗体或其片段和抗原)之间的非共价相互作用的强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。通过测定解离常数(Kd)，可以定量2个分子(例如抗体或其片段和抗原)之间通过单价相互作用的结合亲和力。通过测量复合物形成和解离的动力学，例如通过SPR方法 (Biacore)，又可以测定KD。与单价复合物的结合和解离相对应的速率常数分别称作结合速率常数ka (或和解离速率常数kd (或k#)。通过方程Kd = kd / ka，将Kd与
相关联。按照上面的定义，通过对比单个抗体/抗原复合物的Kd值，可以对比与不同的分子相互作用有关的结合亲合力，例如对比不同抗体对给定的抗原的结合亲和力。类似地，通过测定和对比目标相互作用(例如抗体和抗原的特异性相互作用)的Kd 值和非目标相互作用的Kd值，可以评估相互作用的特异性。通常，抗体相对于靶物的Kd为相对于其它非靶分子(诸如无关物质或在环境中的伴随物质)的Kd的1/2、优选的1/5、更优选的1/10。更优选地，所述Kd为相对于其它非靶分子(诸如无关物质或在环境中的伴随物质)的Kd的1/50，诸如1/100或1/200 ；甚至更优选地 1/500，诸如 1/1000 或 1/10，000。通过众所周知的方法，可以直接地测定该解离常数的值，且可以通过下述方法，甚至计算复合混合物的该解离常数的值诸如在例如Caceci等人(Byte 9:340-362, 1984) 中所述的方法。例如，使用双滤器硝酸纤维素滤器结合试验，诸如Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)所公开的试验，可以建立KD。用于评价诸如抗体等配体与靶物的结合能力的其它标准试验是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准试验，诸如表面等离子体共振(SPR)， 例如通过使用Biacore 系统，也可以评估抗体的结合动力学和结合亲和力。可以进行竞争结合试验，其中将所述抗体对靶物的结合和该靶物的另一种配体 (诸如另一种抗体)对该靶物的结合相对比。发生50%抑制时的浓度称作Ki。在理想条件下，Ki等同于KD。Ki值绝不会小于KD，所以可以方便地用Ki的测量替代，以提供Kd的上限。本发明的抗体对于它的靶物可以具有1 χ 1(ΓΜ或更小、1 χ 10_%或更小或1 χ 1(Γ9Μ或更小或1 χ ΙΟ,Μ或更小、1 χ 10_"Μ或更小或1 χ 10—Μ或更小的KD。特异性地结合它的靶物的抗体可以以高亲和力结合它的靶物，也就是说，表现出上面讨论的低KD，且可以以更低的亲和力结合其它的非靶分子。例如，所述抗体可以以ι X IO-fiM或更大、更优选1 χ 10_5 M或更大、更优选1 χ 10_4 M或更大、更优选1 χ 10_3 M或更大、甚至更优选1 χ ΙΟ"2 M或更大Kd结合非靶分子。与其结合其它非靶分子的亲和力相比，本发明抗体优选地能以至少2-倍、10-倍、50-倍、100-倍200-倍、500-倍、1，000-倍或10，000-倍或更大的亲和力结合它的靶物。所述靶分子可以是本文所述的任意TFPI分子，诸如天然存在的TFPI分子、完全成熟的TFPI分子或全长TFPI分子。优选的TFPI分子是完全成熟的、天然存在的、全长哺乳动物TFPI分子。例如，所述TFPI分子可以包含本文所述的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其片段或其它变体，或由其组成。所述靶分子可以是TFPI分子的变体，诸如TFPI分子的片段。例如，所述靶分子可以是TFPI的片段或其它变体，其维持适合抗体结合的表位。例如，所述靶分子可以是TFPI 的片段或其它变体，其保留本文所述的表位。所述靶分子可以包含这样的表位。
在一个实施方案中，所述靶分子是全长TFPI分子。所述全长TFPI分子可以包含本文所述的第一、第二和第三Kimitz结构域。所述全长TFPI分子可以包含本文所述的第一、第二和第三Kimitz结构域以及本文所述的羧基端区域。所述全长TFPI分子可以是天然存在的TFPI分子，诸如从TFPI基因表达的或由表达TFPI的细胞分泌的全长TFPI多肽。 所述全长TFPI分子可以是天然存在的TFPI分子，发现其以游离形式在血浆中循环，或结合在诸如内皮细胞等细胞上。所述全长TFPI分子不是截短的TFPI分子，诸如本文所述的天然存在的截短的TFPI分子。在一个实施方案中，所述靶分子是截短的TFPI分子。例如，所述截短的TFPI分子可以包含羧基端截短。例如，TFPI的许多天然存在的截短形式是已知的。这些可以包括 TFPI的羧基端部分的一部分或全部的截短。它们可以进一步包括Kimitz结构域中的一个或多个的一部分或全部的截短。例如，TFPI的截短形式可以包括羧基端部分和第三Kimitz 结构域的一部分或全部的删除。例如，一种天然存在的TFPI截短形式仅包含全长TFPI分子的氨基酸1_161 (在本文中称作TFPI (1-161))。TFPI (1_161)是TFPI的一种活性形式，其具有与全长分子相比降低的活性。TFPI (1-161)在结构上不同于全长TFPI，针对TFPI (1_161)作为靶分子产生的抗体因此可以不同于针对全长TFPI产生的抗体。在需要针对在TFPI中存在的全长TFPI区域(1-161)的靶抗体的情况下，TFPI的截短形式可以是适当的靶分子。但是，当希望抗体针对TFPI的特定截短形式(诸如天然存在的截短的TFPI)时，截短的TFPI优选地用作靶分子。在一个实施方案中，所述靶分子是TFPI的天然存在形式。这可以以其中它存在于体内的形式使用。例如，所述靶分子可以是上面讨论的全长天然存在的TFPI。所述靶分子可以是上面讨论的截短的天然存在的TFPI。所述靶分子可以是以它在体内存在于血浆中的形式的TFPI。所述靶分子可以是这样的TFPI，其以在体内存在于血浆中相同的方式结合脂蛋白。所述靶分子可以是这样的TFPI，其以与在体内发生的相同方式结合细胞，诸如结合内皮细胞的TFPI。本发明的抗体可以结合这些TFPI天然存在形式中的任意一种或多种。本发明的抗体可以能结合所有这些TFPI天然存在形式，或可以能辨别这些不同形式，结合某些形式，但是不结合其它形式。在一个实施方案中，所述靶分子是或包含TFPI的第二 Kunitz结构域。这样的靶分子可以包含SEQ ID NO: 1的氨基酸97-147或SEQ ID NO: 1的氨基酸91-150或来自另一种TFPI多肽的等效Kunitz结构域2区域。这样的靶分子可以包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的氨基酸3-58或10-50。所述靶分子可以是或可以包含TFPI的第二 Kunitz结构域的片段。例如，所述靶分子可以包含5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个来自第二 Kimitz结构域的氨基酸。所述靶分子可以包含TFPI或TFPI的特定区域(诸如特定Kunitz结构域或TFPI 的C端部分)的5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个表面可及的残基(surface accessible residue)。表面可接近的残基是具有超过40%相对可及性(relative accessibility)的残基。例如，对于 TFPI (SEQ ID NO: 1)的 Kunitz 2结构域，下述氨基酸具有超过40%相对可及性94-95、98、100-110、118-121、123-124、 131、134、138-142和144-145 (参见图5)。所述靶分子可以包含这些残基中的5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个，诸如包含这些残基中的5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、或15个或更多个的TFPI片段。所述靶分子可以包含来自TFPI的已知表位。在“结合抗原的多肽”(Ab)和它的对应“抗原”(Ag)之间的分子相互作用的背景下定义本文使用的术语“表位”。本文使用的术语Ab包含特异性地结合对应的Ag的抗体或其片段。抗原结合片段包括Fab、Fab’、F (ab) 2、F (ab’)2、F (ab) S、Fv (通常抗体的单臂的 VL和VH结构域)、单链Fv (scFv;参见例如Bird 等人，Science 1988; 242:42S_426 ；和 Huston 等人 PNAS 1988; 85:5879-5883) ,dsFv.Fd (通常 VH 和 CHI 结构域)和 dAb (通常VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单个VH和单个VL链的单价分子；微体、双体、三体、四体和κ体(参见，例如，111等人.Protein Eng 1997;10:949-57)；骆驼IgG;IgNAR ；以及一种或多种分离的CDR或功能互补位，其中分离的CDR或结合抗原的残基或多肽可以结合或连接到一起，从而形成功能抗体片段。不同类型的抗体片段已经描述或综述在例如，HolIiger和Hudson, Nat Biotechnol 2005 ； 2S: 1126-1136 ；W02005040219, 和公开的美国专利申请20050238646和20020161201中。使用常规的重组或蛋白工程技术，可以得到抗体片段，且可以以与完整抗体相同的方式，筛选所述片段的抗原结合功能或其它功能。术语抗原(Ag)表示用于免疫免疫感受态脊椎动物以生产识别该Ag的抗体(Ab) 的分子实体。在本文中，Ag是更宽泛的术语，通常意在包括被Ab特异性地识别的靶分子， 因而包括在制备Ab的免疫过程中使用的分子的片段或模拟物。因而，对于Ab与TFPI的第二 kimitz结构域(K2)的结合，分离的K2、全长TFPI (包括TFPI的截短变体和其它变体) 都称作Ag。通常，术语“表位”表示Ag上的Ab所特异性地结合的范围或区域，即与Ab物理接触的范围或区域。蛋白表位可以包含Ag的直接参与结合Ab的氨基酸残基(也称作表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸如Ag的被Ab有效阻断的氨基酸残基(换而言之，所述氨基酸残基是在Ab的“溶剂排斥表面”和/或“足迹”内)。术语表位在本文中包括在K2的任意特定区域中的两类结合部位，所述K2是在特异性地结合抗-TFPI 抗体的TFPI中，或在根据本发明的另一种K2-特异性试剂中，除非另有说明、例如’械鱼上下文中，本发明涉及直接结合特定氨基酸残基的抗体)。K2可以包含许多不同的表位，所述表位可以包括、但不限于，(1)线性肽抗原决定簇，(2)构象抗原决定簇，其由一个或多个在成熟K2构象中位置彼此靠近的不连续氨基酸组成；和(3)翻译后抗原决定簇，其全部或部分地由共价地连接到K2上的分子结构(诸如碳水化合物基团)组成。使用多种实验和计算表位作图方法，可以在不同的详细水平定义和表征给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位。所述实验方法包括诱变、X-射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学、氢化的氘交换质谱法(HX-MQ和不同的竞争结合方法。由于每种方法依赖于独特的原理，表位的描述与已经用于测定它的方法紧密关联。因而，根据采用的表位作图方法，不同地定义给定的AbAg对的表位。在它的最详细的水平，通过定义在Ag-Ab相互作用中存在的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息，可以定义Ag和Ab之间的相互作用的表位。在详细度更低的水平，通过定义Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标，可以表征表位。 在详细度进一步更低的水平，通过由特定轨范(例如在Ab和Ag中的原子之间的距离)定义的氨基酸残基，可以表征表位。在详细度进一步更低的水平，通过功能(例如通过与其它Ab 的竞争结合)，可以表征表位。也可以更属类地把表位定义为包含这样的氨基酸残基，另一种氨基酸对所述残基的置换会改变Ab和Ag之间的相互作用特征。在由Ab (例如Fab片段)和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X-射线衍生晶体结构的背景下，除非另外指出或上下文冲突，术语表位在本文中具体地定义为这样的 K2残基，其特征在于，具有离Ab中的重原子在4 A距离内的重原子(即非氢原子)。在以不同详细水平得到表位的描述和定义(依赖于使用的表位作图方法)的事实以后，可以类似地在不同详细水平对比在相同Ag上对不同Ab的表位。如果它们含有相同的氨基酸残基集合，则在氨基酸水平描述的(例如从X-射线结构测定的)表位被认为是相同的。如果表位共有至少一个氨基酸，则表位被认为是重叠的。 如果表位不共有氨基酸残基，则表位被认为是单独的(独特的)。如果对应的Ab的结合相互排斥(即一种Ab的结合排斥其它Ab的同时结合)，则通过竞争结合表征的表位被认为是重叠的。如果Ag能够适应两种对应Ab的同时结合，则表位被认为是单独的(独特的)。通过反转视角，从上面的“表位”的定义衍生出术语“互补位”的定义。因而，术语 “互补位”表示在Ab上的Ag所特异性地结合(即与Ag物理接触)的范围或区域。在由Ab (例如Fab片段)和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X-射线衍生晶体结构的背景下，除非另外指出或上下文冲突，术语互补位在本文中具体地定义为这样的Ag残基，其特征在于，具有离K2中的重原子在4 A距离内的重原子(即非氢原子)。通过常规方法，可以鉴别给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和互补位。例如， 通过评估抗体的结合不同片段或变体TFPI多肽的能力，可以确定表位的一般位置。使用常规方法，诸如在实施例中所述的方法，也可以确定在TFPI内与抗体(表位)接触的具体氨基酸和在抗体内与TFPI (互补位)接触的具体氨基酸。例如，可以组合抗体和靶分子，且可以使AbAg复合物结晶。可以确定复合物的晶体结构，并用于鉴别抗体和它的靶物之间的相互作用的特异位点。发明人已经对本文所述的鼠MuTFPI4F36抗体以及人源化的HzTFPI4F36抗体和 TFPI的Kimitz 2结构域(K2)之间的相互作用进行了这样的分析。在实施例中，更详细地描述了该分析。根据本发明的抗体的互补位可以定义如下所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15 的残基E31、S32、D33、 7、A96、T97和F99，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO 18的残基 N31、S52、R53、S54、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103 和 D106。根据本发明的抗体的轻链因而可以包含氨基酸残基
E，其在与SEQ ID NO 15的位置31相对应的位置，
S，其在与SEQ ID NO 15的位置32相对应的位置，
D，其在与SEQ ID NO 15的位置33相对应的位置，
Y，其在与SEQ ID NO 15的位置37相对应的位置，
A，其在与SEQ ID NO 15的位置96相对应的位置， T，其在与SEQ ID NO 15的位置97相对应的位置，和
F，其在与SEQ ID NO 15的位置99相对应的位置； 且所述抗体的重链可以包含氨基酸残基
N，其在与SEQIDNO18的位置31相对应的位置，R，其在与SEQIDNO18的位置53相对应的位置，S，其在与SEQIDNO18的位置M相对应的位置，Y，其在与SEQIDNO18的位置57相对应的位置，Y，其在与SEQIDNO18的位置59相对应的位置，F，其在与SEQIDNO18的位置60相对应的位置，P，其在与SEQIDNO18的位置61相对应的位置，D，其在与SEQIDNO18的位置62相对应的位置，Q，其在与SEQIDNO18的位置65相对应的位置，Y，其在与SEQIDNO18的位置102相对应的位置，D，其在与SEQIDNO18的位置103相对应的位置，和D，其在与SEQIDNO18的位置106相对应的位置。所述重链可以另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置52相对应的位置。根据本发明的抗体的轻链可以另外包含H，其在与SEQ ID NO: 15的位置98相对应的位置，且所述重链可以另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置56相对应的位置。对于MuTFPI4F36 (实施例4)，发现表位由SEQ ID NO: 1的氨基酸E100、E101、 P103、R107、Y109、Till、Y113、Q118、Q121、E123、R124、F125、K126 和 L140 组成，它们对应着 SEQ ID NO: 2的氨基酸E10、E11、P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36 和L50。发现互补位由SEQ ID N0: 4的轻链氨基酸残基E31、S32、D33、TO7、A96、T97、H98 和 F99 和 SEQ ID NO 8 的重链氨基酸残基 N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、 Y102、D103 和 D106 组成。对于HzTFPI4F36 (实施例5)，发现表位由SEQ ID NO: 1的氨基酸E100、E101、 D102、P103、R107、Y109、T111、Y113、F114、N116、Q118、Q121、C122、E123、R124、F125、K126 和 L140 组成，它们对应着 SEQ ID N0: 2 的氨基酸 E10、Ell、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、 F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36*L50。发现互补位由 SEQ ID N0: 15 的轻链氨基酸残基E31、S32、D33、Y37、A96、T97和F99和SEQ ID NO 18 的重链氨基酸残基 N31、S52、 R53、S54、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103 和 D106 组成。根据本发明的抗体可以结合与本文具体公开的本发明抗体相同的TFPI表位或结构域。可以如下鉴别其它尚未鉴别的本发明抗体例如，通过对比它们对TFPI的结合和单克隆抗体MuTFPI4F36和/或HzTFPI4F36的结合；或通过对比尚未鉴别的抗体的功能和 MuTFPI4F36和/或HzTFPI4F36的功能。可以用于这样的鉴别目的的分析和试验包括TFPI 中和试验，诸如在实施例6中所述的Ffci抑制试验和在实施例7中所述的FVIIa/TF/Ffci抑制试验；结合相互作用分析，诸如在实施例8中所述的表面等离子体共振分析；细胞试验， 诸如在实施例9中所述的TFPI对人脐血管内皮细胞(HUVEC)的中和，和在实施例10中所述的TF/FVIIa活性的TFPI抑制对MDA-MB 231人乳腺癌细胞的中和。在一个实施方案中，本发明的抗体可以结合与本文所述的MUTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体相同的表位或区域。在本文中更详细地描述了 MuTFPI4F36和HzTFPI4F36 对TFPI的结合。本发明的抗体可以是结合与MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体相同的TFPI 表位的抗体。这可以包括，它在接触上述的TFPI的特定氨基酸。例如，本发明的抗体可以以下述方式结合TFPI 它接触SEQ ID NO: 2的氨基酸E10、ElU P13、R17、Y19、T21、Y23、 Q28、Q31、E33、R34、F35、K36和L50，或它接触SEQ ID NO: 2 的氨基酸 E10、Ell、D12、P13、 R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36 和 L50。
本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含一个或多个选自下述的残基SEQ ID NO: 2 的 E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、 K36 和 L50。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基E10。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基E11。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基D12。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基P13。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基R17。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基Y19。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基T21。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基Y23。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基F24。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基N26。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基Q28。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基Q31。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基C32。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基E33。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基R34。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基F35。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基K36。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2的残基L50。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQIDNO2 的残基 E10、E11、
D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、K36 和 L50。本发明的抗体可以能够结合表位，所述表位包含SEQ ID NO: 2的残基E10、E11、 P13、R17、Y19、T21、Y23、Q28、Q31、E33、R34、F35、K36 和 L50。本发明的抗体可以具有与本发明的另一种抗体竞争结合TFPI或本文所述的另一种适当靶物的能力。例如，本发明的抗体可以与本文所述的MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体交叉竞争结合TFPI或被MuTFPI4F36或HzTFPI4F36抗体结合的TFPI的适当片段或变体。 基于它们在标准结合试验中与本发明的已知抗体交叉竞争的能力，可以鉴别这样的交叉竞争抗体。例如，SI3R (诸如通过使用Biacore 系统)、ELISA试验或流式细胞术可以用于证实交叉竞争。这样的交叉竞争可以提示两种抗体结合相同的、重叠的或类似的表位。因而，本发明的抗体可以能够以比任意一种或多种下述可商业得到的单克隆抗体更高的亲和力结合TFPI的K2结构域mAb0281 (Ab systems)和/或mAb4904 (AmericanDiagnostica)禾口 / 或 mAb2974 (R&D systems)禾口 / 或 mAb29741 (R&D systems)。因此，通过下述方法，可以鉴别本发明的抗体，所述方法包括这样的结合试验，该试验评估实验抗体是否能与本发明的已知抗体竞争靶分子上的结合部位。进行竞争结合试验的方法是本领域众所周知的。例如，它们可以包括，在抗体可以结合靶分子的条件下，使本发明的已知抗体结合靶分子。然后可以使抗体/靶物复合物暴露于实验抗体，并可以评估实验抗体能够从抗体/靶物复合物中置换出本发明抗体的程度。一种替代方法可以包括，在允许抗体结合的条件下，使实验抗体接触靶分子，然后加入能结合该靶分子的本发明抗体，并评估本发明的抗体能够从抗体/靶物复合物中置换出实验抗体的程度。实验抗体的抑制本发明抗体结合靶物的能力证实实验化合物可以与本发明抗体竞争结合靶物，因而实验抗体结合与本发明的已知抗体相同的在TFPI蛋白上的表位或区域。在这样的方法中被鉴别为与本发明的已知抗体竞争的实验抗体也是根据本发明的潜在抗体。实验抗体可以在与本发明的已知抗体相同的区域结合TFPI并与本发明的已知抗体竞争的事实提示，实验抗体可以在与已知抗体相同的结合部位作为配体，且实验抗体因此可以模仿已知抗体的行为。这可以通过在有本文所述的实验化合物存在下评估TFPI的活性来确认。本发明的已知抗体可以是本文所述的抗体，诸如鼠TFPI- 4F36A1B2 (也称作 4F36和MuTFPI4F36)抗体，或保留结合TFPI的能力的本文所述的其任意变体或片段，诸如人源化的TFPI-4F36A1B2抗体，其中之一在本文中称作HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)。本发明的抗体可以结合与本文所述的MuTFPI4F36抗体相同的表位，或保留结合TFPI的能力的本文所述的其任意变体或片段，诸如HzTFPI4F36。本发明的抗体可以结合与MUTFPI4F36表位(其在实施例中进一步描述)相同、 重叠或类似的表位。本发明的抗体可以结合与HzTFPI4F36表位(其在实施例中进一步描述)相同、重叠或类似的表位。本发明的抗体可以结合、优选特异性地结合一个或多个属于 MuTFP14F36和/或HzTFPI4F36表位的氨基酸残基。例如，本发明的抗体可以结合5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个或10个或更多个上面关于MuTFPI4F36 或HzTFPI4F36的结合所述的氨基酸残基。例如，当接触SEQ ID NO: 2的多肽时，本发明的抗体可以结合该多肽，并接触氨基酸E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、Y23、F24、N26、Q28、 Q31、C32、E33、R34、F35、K36和L50、或那些氨基酸的子集，诸如那些氨基酸中的至少2个、 至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少 11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个。参照抗体对非靶物的分子的结合，可以评估特异性结合。通过对比抗体结合靶物的能力和结合另一种分子的能力，可以进行该对比。可以如上所述，在Kd或Ki的评估中， 进行该对比。在这样的对比中使用的其它分子可以是非靶分子的任意分子。优选地，其它分子不同于靶分子。优选地，所述靶分子不是靶分子的片段。本发明的抗体的Kd可以小于0.8 nM，诸如小于0.7 nM、诸如小于0. 6 nM、诸如小于0. 5 nM、诸如小于0. 4 nM、诸如小于0. 3 nM、诸如小于0. 2 nM、诸如小于0. 1 nM、诸如小于0.05 nM、诸如小于0.025 nM、诸如小于0. 015 nM、诸如在0. 015 nM至0 nM之间。用于测定特异性结合的其它分子可以在结构或功能上与靶物无关。例如，其它分子可以是无关物质或在环境中的伴随物质。
用于测定特异性结合的其它分子可以是参与与靶分子相同的体内途径的另一种分子。例如，在所述靶物是TFPI或其片段或变体的情况下，用于对比的其它分子可以是形成血液凝固级联的一部分的蛋白。通过确保本发明的抗体具有对TFPI的特异性(胜过另一种这样的分子)，可以避免不希望的体内交叉反应性。用于对比的其它分子可以与靶分子有关。例如，在希望鉴别仅结合特定表位的抗体的情况下，用于对比的其它分子可以是其中该表位缺失或被破坏的TFPI分子。用于对比的其它分子因而可以是另一种靶分子，其不同于被目标抗体(the antibody in question) 结合的靶分子。本发明的抗体可以保留结合与靶分子有关的某些分子的能力。例如，全长成熟人 TFPI可以用作靶物，但是所述抗体也可以能够结合例如人TFPI的未成熟形式、人TFPI的片段或截短形式、结合到脂蛋白或细胞上的TFPI或来自其它物种的TFPI (诸如其它哺乳动物 TFPDo或者，本发明的抗体可以具有对特定靶分子的特异性。例如，它可以结合本文所述的一种靶分子，但是不结合或以明显降低的亲和力结合本文所述的不同靶分子。例如，全长成熟人TFPI可以用作靶物，但是结合该靶物的抗体不能结合或以更低亲和力结合例如人 TFPI的未成熟形式、人TFPI的片段或截短形式、结合到脂蛋白或细胞上的TFPI或来自其它物种的TFPI (诸如其它哺乳动物TFPI)。本发明的抗体可以结合TFPI，且在如此进行时，可以抑制TFPI的活性。如上面解释的，TFPI会下调节血液凝固。它通过抑制Fxa的活性和通过在Fxa存在下抑制TF-FVIIa复合物来进行。被本发明的抗体抑制的TFPI的活性可以是这些活性中的任一种或其任意下游效应。例如，本发明的抗体可以导致血液凝固增加、Fxa的存在或水平增加、或TF-FVIIa的活性增加。优选地，当接触(a)人FVIII缺乏的血浆或(b)人全血时，本发明的抗体会减少凝固时间。TFPI活性的测量可以包括评估TFPI在血液样品中抑制凝固或减少凝固时间的活性。例如，这样的方法可以包括在会发生凝固的条件下，使TFPI接触包含凝血因子的血液样品或血液产品样品(诸如血浆或血清)，并测定TFPI的存在是否抑制血液的凝固或减少凝固时间。然后可以将这样的样品中的血液凝固水平或凝固时间与其中也存在实验抗体的等效样品相对比。如果在抗体样品中的凝固水平增加或凝固时间减少，这表明所述抗体正抑制该样品中的TFPI活性。通过寻找血液本身的凝固、血浆的凝固或位于TFPI作用点下游的一种或多种凝固级联特征，可以检测血液凝固。例如，所述方法可以评估样品中Fxa的水平或TF-FVIIa 的活化。用于评估血液凝固和凝固时间的各种其它方法是本领域众所周知的。例如，使用在实施例中所述的稀释凝血酶原时间分析(dPT分析)，可以评估抗体对血液凝固时间的任何作用。简而言之，使人血浆接触人促凝血酶原激酶。在有和没有实验抗体存在下，测量血浆到凝块所需的时间。可以在这样的分析中使用阳性对照，诸如添加预期会减少凝固时间的FVIIa (Novokven )。本发明的抗体应当能够在这样的方法中减少凝固时间。优选地，本发明的抗体应当能够以剂量依赖性的方式减少凝固时间。本发明的抗体可以能够在基于血浆的凝固试验(诸如dPT分析)中抑制TFPI，显著优于任意一种或多种下述可商业得到的单克隆抗体mAb0281 (Ab systems)和/或 mAb4904 (American Diagnostica)禾口 / 或 mAb2974 (R&D systems)禾口 / 或 mAb29741 (R&D systems)。凝血弹性描记术可以用于评估全血样品中的血块形成和纤维蛋白溶解的动力学。 因而，通过对比在有和没有抗体存在下血块形成所需的时间，可以在全血样品中类似地评估抗体的减少凝固时间或刺激血液凝固的能力。因而可以在体外进行评估本发明抗体的功能作用的方法。这样的方法优选地在人血液或血浆样品上进行。这样的样品可以是正常的人血液或血浆，或可以缺少或添加了一种或多种参与血液凝固的因子。例如，使用正常的人全血、正常的人血浆或FVIII-缺乏的血浆或全血，可以进行这些方法。通过使合适的血液或血浆样品接触中和抗-FVIII抗体， 可以产生FVIII-缺乏的血液或血浆。这样的体外方法可以是结合相互作用分析或TFPI中和分析，诸如在实施例6-11中所述的那些。本发明的抗体可以能够抑制血小板-相关的TFPI。本发明的抗体可以能够抑制可溶的TFPI。本发明的抗体可以能够抑制脂蛋白-结合的TFPI。本发明的抗体可以能够抑制细胞-结合的TFPI，诸如结合到内皮细胞上的TFPI。本发明的抗体可以能够结合TFPI，使得FXa保留它的活性至少91%、诸如至少92%、 诸如至少93%、诸如至少94%、诸如至少95%、诸如至少96%、诸如至少97%、诸如至少98%、诸如至少99%、诸如99-100%，如在F)(a抑制试验中所测得的。当TFPI被所述抗体饱和时，本发明的抗体可以能够中和膜-结合的FVIIa/TF/FXa 的TFPI抑制至少55%、诸如至少60%、诸如至少65%、诸如至少70%、诸如至少75%、诸如至少 80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少95%、诸如多达100%、诸如100%，如在FVIIa/TF/ Ffe抑制剂试验中所测得的。优选地，本发明抗体能在下述样品中减少凝固时间和/或刺激血液凝固(a)人全血、(b)人血浆、(c) FVIII-缺乏的人全血、(d) FVIII-缺乏的人血浆、(e) FIX-缺乏的人全血或(f) FIX-缺乏的人血浆。也可以在体内进行测定抗体的刺激血液凝固或减少凝固时间的能力的方法。 例如，可以在实施例中所述的暂时患血友病的兔中进行体内研究。简而言之，通过施用抗-FVIII抗体，使兔暂时患血友病。然后可以施用实验抗体，并评估表皮出血时间和/或血小板数目。在有实验抗体存在下表皮出血时间的减少指示，该抗体能减少凝固时间和刺激血液凝固。具有这样的效应的抗体因此可以是本发明的抗体。本发明的抗体可以能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者中的游离TFPI的百分比减少至小于30%、诸如小于29%、诸如小于28%、诸如小于27%、诸如小于26%、诸如小于25%、诸如小于、诸如小于23%、诸如小于22%、诸如小于21%、诸如小于20%、诸如小于19%、诸如小于18%、诸如小于17%、诸如小于16%、诸如小于15%、诸如小于14%、诸如小于 13%、诸如小于12%、诸如小于11%、诸如小于10%、诸如小于9%、诸如小于8%、诸如小于7%、诸如小于6%、诸如小于5%、诸如小于4%、诸如小于3%、诸如小于2%、诸如小于1%、诸如0%。此外，本发明的抗体可以能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者中的游离TFPI 的量在将所述单克隆抗体施用给所述受试者以后的前观天中、诸如在前27天中、诸如在前26天中、诸如在前25天中、诸如在前M天中、诸如在前23天中、诸如在前22天中、诸如在前21天中、诸如在前20天中、诸如在前19天中、诸如在前18天中、诸如在前17天中、诸如在前16天中、诸如在前15天中、诸如在前14天中、诸如在前13天中、诸如在前12天中、诸如在前11天中、诸如在前10天中、诸如在前9天中、诸如在前8天中、诸如在前7天中、诸如在前6天中、诸如在前5天中、诸如在前4天中、诸如在前3天中、诸如在前2天中、诸如在前1天中减少。本发明的抗体也可以不导致血小板数目的显著减少。具体地，本发明的抗体可以能在下述样品中或在动物体内减少凝固时间和/或刺激血液凝固而不导致血小板数目的任何显著减少(a)人全血、(b)人血浆、(c) FVIII-缺乏的人全血、(d) FVIII-缺乏的人血浆、(e) FIX-缺乏的人全血或(f) FIX-缺乏的人血浆。可以在与上面讨论的其它效应相同的样品或动物中，评估血小板数目，或可以单独评估。例如，可以在血液样品(诸如从患者或实验动物得到的血液样品)中，评估血小板数目。可以在将抗体施用给如上所述的暂时患血友病的兔以后，评估血小板数目。本发明的抗体可以能够减少暂时患血友病的兔的表皮出血时间，而不导致血小板数目的并行减少，如通过体内研究所例证的。通过对比施用抗体之前和之后的血小板数目，或通过对比用目标抗体处理的样品或动物和没有用该抗体处理的对照样品或动物之间的血小板数目，可以评估血小板数目的变化。本发明的抗体可以能够结合TFPI的K2结构域，使得受试者的体内凝固时间减少，且所述受试者的血小板数没有显著减少。例如，所述受试者的血小板数可以没有下降至起始血小板数的大约80%、诸如大约75%、诸如大约70%、诸如大约65%、诸如大约60%、诸如大约55%、诸如大约50%、诸如大约45%、诸如大约40%、诸如大约35%、诸如大约30%、诸如大约25%。优选地，当进行这样的对比时，血小板数目没有差异或没有统计上显著的差异。也就是说，本发明的抗体不会造成血小板数目的任何减少。本文提及的术语“抗体”包括完整抗体及其任意抗原结合片段(皮/7，“抗原结合部分”)或单链。抗体表示包含通过二硫键相连的至少2个重链(HC)和2个轻链(LC)的糖蛋白或其抗原结合部分。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区 (CH)。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区(CL)。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区域可以进一步分成高变异性区域(称作互补性决定区(CDR))，所述区域内夹杂着更保守的区域(称作框架区(FR))。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的不同细胞(资/i/7，效应细胞) 和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。当在本文中使用时，术语“互补性决定区”或“高变区”表示抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。互补性决定区或“CDR”通常包含在轻链可变结构域中的氨基酸残基 24-34 (Li) ,50-56 (L2)和 89-97 (L3)以及在重链可变结构域中的 31-35 (Hl) ,50-65 (H2)禾口 95-102 (H3) ； (Kabat ^A (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，美国健康和人类服务部，NIH公开号91-3M2)和/或来自“高变环” 的那些残基(在轻链可变结构域中的残基沈-32 (Li),50-52 (L2)和91-96 (L3)以及在重链可变结构域中的 26-32 (Hl) ,53-55 (H2)禾口 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917)。通常，通过上面的Kabat 所述的方法，进行该区域中的氨基酸残基的编号。诸如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“根据Kabat”等短语在本文中表示重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际的线性氨基酸序列可以含有更少的或额外的氨基酸，它们对应着可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以包括在⑶R H2的残基52之后的氨基酸插入(根据Kabat， 残基52a、52b和52c)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、 82b和82c等)。通过在抗体序列的同源性区域与“标准的"Kabat编号的序列比对，可以确定给定的抗体的残基的Kabat编号。术语“框架区”或“FR”残基表示不在本文定义的CDR内的那些VH或VL氨基酸残基。本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。本发明的抗体可以是嵌合抗体、CDR-移植的抗体、人或人源化的抗体或其任一种的抗原结合部分。关于单克隆和多克隆抗体的生产，实验动物是合适的哺乳动物， 例如，但不限于，山羊、兔、大鼠或小鼠。多克隆抗体是源自不同B细胞系的抗体。多克隆抗体可以包含针对特定抗原的不同免疫球蛋白分子的混合物。多克隆抗体可以包含结合抗原分子内的一种或多种不同表位的不同免疫球蛋白分子的混合物。通过常规方法，诸如用目标抗原免疫适当的动物，可以生产多克隆抗体。随后，可以从该动物取出血液，并纯化免疫球蛋白级分(fraction)。单克隆抗体是彼此相同且对特定表位具有单一结合特异性和亲和力的免疫球蛋白分子。通过多种技术，包括常规单克隆抗体方法，资/i/7，Kohler和Milstein (1975) Nature^'. 495的标准体细胞杂交技术，或B淋巴细胞的病毒或致癌性转化，可以生产本发明的单克隆抗体(mAb)。优选的制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤生产是非常确定的步骤。免疫方法和用于融合的免疫化的脾细胞的分离技术是本领域已知的。融合配偶体k例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。为了制备生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫的小鼠分离脾细胞和/ 或淋巴结细胞，并与适当的永生化的细胞系(诸如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。可以针对抗原特异性的抗体的生产来筛选得到的杂交瘤。可以将分泌抗体的杂交瘤重新涂布平板，再次筛选，且如果仍然是合适的IgG阳性的，则通过有限稀释，将该单克隆抗体亚克隆至少2次。 然后可以在体外培养该稳定的亚克隆，以在组织培养基中制备小量抗体用于表征。术语抗体的“抗原结合部分”表示保留特异性地结合抗原(诸如TFPI或本文所述的另一种靶蛋白)的能力的一种或多种抗体片段。已经证实抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。被包括术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab 片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分离的互补性决定区(CDR)。 单链抗体(诸如scFv)和重链抗体(诸如VHH)和骆驼抗体也意图被包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术，可以得到这些抗体片段，且可以以与完整抗体相同的方式，筛选所述片段的效用。通过重组方法，可以制备、表达、建立或分离本发明的抗体，例如(a)从对于目标免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的动物U列如，个％)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化成表达目标抗体的宿主细胞(资/貪，从转染瘤)分离的抗体，(C)从重组的、组合抗体文库分离的抗体，和(d)通过包含剪接免疫球蛋白基因序列至其它DNA序列的任意其它方法制备、表达、建立或分离的抗体。
本发明的抗体可以是人抗体或人源化的抗体。本文使用的术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区都源自人种系(germline)免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而导入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”无意包括这样的抗体，其中源自另一哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上。这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可以由杂交瘤生产，所述杂交瘤包括从转基因的非人动物(例如转基因小鼠)得到的B细胞，其具有包含与永生化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。人抗体可以分离自这样的序列文库，其建立在人种系序列的选择上，并用天然的和合成的序列多样性进一步多样化。通过体外免疫人淋巴细胞，并随后用EB病毒转化淋巴细胞，可以制备人抗体。术语“人抗体衍生物”表示人抗体的任意修饰形式，例如，抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。术语“人源化的抗体”意在表示含有源自非人免疫球蛋白的最小序列(CDR区)的人/非人嵌合抗体。人源化的抗体因而是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区残基被替换为来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的具有希望的特异性、亲和力和能力的高变区残基(供体抗体)。在有些情况下，人免疫球蛋白的FR 残基被替换为对应的非人残基。这样的修饰的实例是导入一个或多个所谓的回复突变，诸如在实施例2中所述。此外，人源化的抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。做出这些修饰，以进一步优化抗体性能。一般而言，人源化的抗体包含基本上所有的至少1个和通常2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的高变环对应着非人免疫球蛋白的那些， 且所有的或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些。人源化的抗体还可以任选地至少包含免疫球蛋白恒定区(Fe)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。可以测试本发明的抗体对靶蛋白的结合，例如，通过标准的ELISA或蛋白印迹法来进行。ELISA试验也可以用于筛选表现出与靶蛋白具有正反应性的杂交瘤。通过监测抗体对表达靶蛋白的细胞的结合，例如通过流式细胞术，也可以测定抗体的结合特异性。通过测定抗体是否结合其它蛋白，可以进一步研究本发明抗体对靶蛋白的特异性。例如，在希望生产特异性地结合TFPI或TFPI的特定部分(例如表位)的抗体的情况下， 通过测定抗体是否也结合缺少目标部分的其它分子或TFPI的修饰形式，可以评估抗体的特异性。如上面解释的，本发明的抗体可以改变TFPI的活性。因而可以进一步测试具有需要的结合性质的抗体，以确定它们对TFPI活性的影响。因而，可以使用方法来鉴别合适的抗体，所述抗体能够结合TFPI，且能够改变、尤其是降低它的活性。一旦已经鉴别和选择出合适的抗体，通过本领域已知的方法，可以鉴别抗体的氨基酸序列。使用特异性的和/或简并的引物，可以克隆编码抗体的基因。通过常规方法，可以重组地生产抗体。
“多肽”在本文中以它的最广泛的含义使用，表示2个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其它肽拟似物的化合物。术语“多肽”因而包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白。 本文使用的术语“氨基酸”可以表示天然的和/或非天然的或合成的氨基酸、D和/或L光学异构体和氨基酸类似物和肽拟似物。本发明人已经鉴别出在实施例中描述的鼠抗体。该抗体在本文中称作 TFPI-4F36A1B2 (或者，4F36或MuTFPI4F36)。本发明包括该抗体、其变体和片段(包括嵌合抗体和人源化的抗体)，它们保留鼠抗体的一种或多种活性，且也描述在实施例中。该抗体的活性包括结合TFPI的能力、结合TFPI分子中的特定位置的能力和抑制TFPI活性的能力。该抗体的合适的片段或变体会保留结合TFPI的能力。优选地保留特异性地结合 TFPI的能力。优选地保留特异性地结合与它的来源抗体(MuTFPI4F36)结合的相同或类似的TFPI分子表位或区域的能力。优选地保留它的来源抗体的一种或多种另外功能，诸如抑制TFPI活性的能力或减少凝固时间的能力，任选地不会导致血小板数目的下降。可以如下制备根据本发明的多肽或抗体“片段”通过截短，例如通过从多肽的N和 /或C-端末端去除一个或多个氨基酸。以此方式，可以从N和/或C端去除多达10、多达 20、多达30、多达40或更多个氨基酸。通过一个或多个内部缺失，也可以产生片段。本发明抗体可以是或可以包含MUTFPI4F36抗体的片段或其变体。本发明的抗体可以是或可以包含如上面进一步讨论的该抗体的抗原结合部分或其变体。例如，本发明的抗体可以是该抗体的Fab片段或其变体，或可以是源自该抗体的单链抗体或其变体。MuTFP14F36抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 6和10中给出。 MuTFPI4F36抗体的VL和VH链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 4和8给出中。一种人源化的抗体HzTFPI4F36的轻链和重链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 21和M中给出。 HzTFPI4F36的VL和VH链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 15和18中给出。本发明的抗体可以包含在SEQ ID NO: 6中所示的MuTFPI4F36轻链氨基酸序列或其片段或变体。抗体可以额外地或替换地包含本文所述的在SEQ ID NO: 10中所示的 MuTFPI4F36重链氨基酸序列或其片段或变体。本发明的抗体可以包含SEQ ID No: 4的VL氨基酸序列或其片段或变体。本发明的抗体可以包含SEQ ID No: 8的VH氨基酸序列或其片段或变体。本发明的抗体可以包含 (a) SEQ ID No: 4的VL氨基酸序列或其片段或变体和(b) SEQ ID No: 8的VH氨基酸序列或其片段或变体。本发明的抗体可以包含在图2中所示的VL或VH氨基酸序列之一的片段。例如， 本发明的抗体可以包含来自SEQ ID No: 4或8的至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、 至少15、至少18、至少20或至少25个连续氨基酸的片段。这样的片段优选地保留一种或多种上面讨论的功能，诸如结合TFPI的能力。任一个这样的VH或VL序列的合适的片段或变体会保留结合TFPI的能力。优选地保留特异性地结合TFPI的能力。优选地保留特异性地结合与它的来源抗体(MuTFPI4F36) 结合的相同或类似的TFPI分子表位或区域的能力。优选地保留它的来源抗体的一种或多种另外功能，诸如抑制TFPI活性的能力或减少凝固时间的能力，任选地不会导致血小板数目的下降。
合适的片段或变体VL序列优选地保留在SEQ ID NO: 4中的位置E31、S32、D33、 Y37, A96、T97、H98和F99处的氨基酸。合适的片段或变体VH序列优选地保留在SEQ ID NO: 8 中的位置 N31、R53、S54、S56、Y57、Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103 和 D106 处的氨基酸。合适的片段或变体抗体优选地保留在SEQ ID NO: 4中的位置E31、S32、D33、 Y37、A96、T97、H98 和 F99 处的氨基酸和在 SEQ ID NO: 8 中的位置 N31、R53、S54、S56、Y57、 Y59、F60、P61、D62、Q65、Y102、D103和D106处的氨基酸。如在图3中所鉴别出的，这些是在MuTFPI4F36轻链和重链序列中的残基，当MuTFPI4F36结合TFPI的K2结构域时，所述残基具有离重原子在4 A距离内的重原子。本发明的抗体可以包含来自本文鉴别出的具体抗体的⑶R区，诸如来自SEQ ID NO: 4或8的⑶R区。这样的抗体优选地保留本文所述的结合TFPI的能力。例如，如图3 所示，使用Kabat定义，在SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6的氨基酸对_39、55-61和94-102 处，可以鉴别出在MuTFPI4F36的轻链内的CDR序列。在SEQ IS NO: 8或SEQ ID NO: 10 的氨基酸31-35、50-66和99-110处，可以鉴别出在MuTFPI4F36的重链内的CDR序列。本发明的抗体可以包含一个或多个在图3中所示的CDR序列。例如，本发明的抗体可以包含 1、2或所有3个在SEQ ID N0: 6的残基M_39、55_61和94-102处所示的氨基酸序列。本发明的抗体可以可替换地或附加地包含1、2或所有3个在SEQ ID NO: 10的残基31-35、 50-66和99-110处所示的氨基酸序列。本发明的抗体可以包含所有6个在SEQ ID N0: 6 的残基 24-39、55-61 和 94-102 处和在 SEQ ID NO: 10 的 31_35、50_66 和 99-110 处所示的氨基酸序列。本发明的抗体可以是人源化的抗体，诸如在本文中称作HzTFPI4F36 (mAbTFPI 2021)的抗体。这样的抗体可以包含一个或多个来自SEQ ID N0: 15或18的⑶R区。根据本发明的抗体的重链可以包含SEQ ID N0: 18的氨基酸31_35 (NYAMS)的 CDRl序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换。根据本发明的抗体的重链可以包含SEQ ID N0: 18的氨基酸50_66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的⑶R2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨
基酸置换。根据本发明的抗体的重链可以包含SEQ ID N0: 18的氨基酸99-110 (LGGYDEGDAMDS)的⑶R3序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。根据本发明的抗体的轻链可以包含SEQ ID N0: 15的氨基酸24_39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的⑶Rl序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨
基酸置换。根据本发明的抗体的轻链可以包含SEQ ID N0: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的 CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。根据本发明的抗体的轻链可以包含SEQ ID N0: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT) 的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换。更具体地，本发明的抗体可以具有这样的重链，其包含
CDRl序列，其又包含SEQ ID N0:18的氨基酸31-35 (NYAMS)；禾口
CDR2 序列，其又包含 SEQ ID N0:18 的氨基酸 50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)；禾口 CDR3 序列，其又包含 SEQ ID NO: 18 的氨基酸 99-110 (LGGYDE⑶AMDS)。
本发明的抗体可以具有这样的轻链，其包含
CDRl序列，其又包含SEQ ID NO CDR2序列，其又包含SEQ ID NO CDR3序列，其又包含SEQ ID NO
15 的氨基酸 24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)；和 15 的氨基酸 55-61 (LVSILDS)；和 15 的氨基酸 94-102 (LQATHFPQT)。 本发明的抗体可以包含上述⑶R区的任意组合。 更具体地，本发明的抗体的重链的框架区2 (FR2)可以包含氨基酸 T，其在与SEQ ID NO 18的位置40相对应的位置， E，其在与SEQ ID NO 18的位置42相对应的位置， R，其在与SEQ ID NO 18的位置44相对应的位置，和 A，其在与SEQ ID NO 18的位置49相对应的位置。
或者，重链的所述FR2可以包含SEQ ID NO: 18的氨基酸36-49。 本发明的抗体可以包含下述的任-
SEQ ID NO: 15的VL氨基酸序列，
SEQ ID NO: 18的VH氨基酸序列，
SEQ ID NO: 15 和 18，
SEQ ID N0: 21的轻链氨基酸序列，
SEQ ID NO: M的重链氨基酸序列，
SEQ ID N0: 21 禾口 24。或者，本发明的抗体可以是或可以包含这些具体序列之一的变体，诸如 MuTFPI4F36抗体的变体或HzTFPI4F36的变体。例如，变体可以是任一个上述氨基酸序列的置换、缺失或添加变体。根据本发明的变体可以是这样的抗体，其不包含
N，其在与SEQIDNO18的CDRl区的位置31相对应的位置R，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置53相对应的位置S，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置54相对应的位置S，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置56相对应的位置Y，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置57相对应的位置Y，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置59相对应的位置F，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置60相对应的位置P，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置61相对应的位置D，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置62相对应的位置禾口Q，其在与SEQIDNO18的CDR2区的位置65相对应的位置Y，其在与SEQIDNO18的CDR3区的位置102相对应的位置；D，其在与SEQIDNO18的CDR3区的位置103相对应的位置；和D，其在与SEQIDNO18的CDR3区的位置106相对应的位置；E，其在与SEQIDNO15的CDRl区的位置31相对应的位置S，其在与SEQIDNO15的CDRl区的位置32相对应的位置D，其在与SEQIDNO15的CDRl区的位置33相对应的位置禾口 Y，其在与SEQ ID NO 15的⑶Rl区的位置37相对应的位置；
A，其在与SEQ ID NO 15的⑶R3区的位置96相对应的位置；
T，其在与SEQ ID NO 15的⑶R3区的位置97相对应的位置；
H，其在与SEQ ID NO 15的⑶R3区的位置98相对应的位置；和
F，其在与SEQ ID NO 15的⑶R3区的位置99相对应的位置。 变体抗体可以包含来自上面讨论的具体序列和片段的1、2、3、4、5、多达10、多达 20、多达30或更多个氨基酸置换和/或缺失和/或插入。“缺失”变体可以包含单个氨基酸的缺失、小氨基酸组(诸如2、3、4或5个氨基酸)的缺失或更大的氨基酸区域的缺失，诸如特定氨基酸结构域或其它特征的缺失。“插入”变体可以包含单个氨基酸的插入、小氨基酸集合(诸如2、3、4或5个氨基酸)的插入或更大氨基酸区域的插入，诸如特定氨基酸结构域或其它特征的插入。“置换”变体优选地包含用相同数目的氨基酸替换一个或多个氨基酸，和进行保守氨基酸置换。例如，可以将一个氨基酸置换为一个具有类似性质的替代氨基酸，例如，另一个碱性氨基酸、另一个酸性氨基酸、另一个中性氨基酸、另一个带电荷的氨基酸、另一个亲水氨基酸、另一个疏水氨基酸、另一个极性氨基酸、另一个芳族氨基酸或另一个脂族氨基酸。可以用于选择合适的取代基的20种主要氨基酸的某些性质如下
权利要求
1.一种单克隆抗体，其能够特异性地结合TFPI的K2结构域，其中所述抗体能够特异性地结合包含SEQ ID NO: 2的残基R17的表位。
2.一种单克隆抗体，其能够特异性地结合TFPI的K2结构域，其中所述抗体能够结合包含一个或多个选自下述的残基的表位SEQ ID NO: 2的E10、E11、D12、P13、R17、Y19、T21、 Y23、F24、N26、Q28、Q31、C32、E33、R34、F35、K36 和 L50。
3.一种单克隆抗体，其能够结合TFPI的K2结构域，其中所述抗体的轻链包含氨基酸残基、15的位置31相对应的位置， 15的位置32相对应的位置， 15的位置33相对应的位置， 15的位置37相对应的位置， 15的位置96相对应的位置， 15的位置97相对应的位置，和 15的位置99相对应的位置； 且其中所述抗体的重链包含氨基酸残基E，其在与SEQIDNOS，其在与SEQIDNOD，其在与SEQIDNOY，其在与SEQIDNOA，其在与SEQIDNOT，其在与SEQIDNOF，其在与SEQIDNON，其在与SEQIDNO18的位置31相对应的位置，R，其在与SEQIDNO18的位置53相对应的位置，S，其在与SEQIDNO18的位置M相对应的位置，Y，其在与SEQIDNO18的位置57相对应的位置，Y，其在与SEQIDNO18的位置59相对应的位置，F，其在与SEQIDNO18的位置60相对应的位置，P，其在与SEQIDNO18的位置61相对应的位置，D，其在与SEQIDNO18的位置62相对应的位置，Q，其在与SEQIDNO18的位置65相对应的位置，Y，其在与SEQIDNO18的位置102相对应的位置，D，其在与SEQIDNO18的位置103相对应的位置，和D，其在与SEQIDNO18的位置106相对应的位置。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其中所述重链另外包含S，其在与SEQID NO: 18的位置52相对应的位置，和/或其中所述轻链另外包含H，其在与SEQ ID NO: 15的位置98相对应的位置，且所述重链另外包含S，其在与SEQ ID NO: 18的位置56相对应的位置。
5.一种单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kimitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的重链包含 SEQ ID NO: 18的氨基酸31-35 (NYAMS)的⑶Rl序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID NO: 18的氨基酸50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的CDR2序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID NO: 18的氨基酸99-110 (LGGYDE⑶AMDQ的CDR3序列，其中这些氨基酸中的 1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换。
6.一种单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kimitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的轻链包含 SEQ ID NO: 15的氨基酸对-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的CDRl序列，其中这些氨基酸中的1个、2个或3个可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID NO: 15的氨基酸55-61 (LVSILDS)的⑶R2序列，其中这些氨基酸中的1个或2个可以被不同的氨基酸置换；和/或 SEQ ID NO: 15的氨基酸94-102 (LQATHFPQT)的CDR3序列，其中这些氨基酸中的1 个或2个可以被不同的氨基酸置换。
7.一种单克隆抗体，其能够结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kimitz 2 (K2)结构域，其中所述抗体的重链包含 SEQ ID NO: 18 的氨基酸 31-35 (NYAMS)的 CDRl 序列，和 SEQ ID NO: 18 的氨基酸 50-66 (TISRSGSYSYFPDSVQG)的 CDR2 序列，和 SEQ ID NO: 18 的氨基酸 99-110 (LGGYDE⑶AMDQ 的 CDR3 序列且其中所述抗体的轻链包含 SEQ ID NO: 15 的氨基酸 24-39 (KSSQSLLESDGKTYLN)的 CDRl 序列；和 SEQ ID NO: 15 的氨基酸 55-61 (LVSILDS)的 CDR2 序列；和 SEQ ID NO: 15 的氨基酸 94-102 (LQATHFPQT)的 CDR3 序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID N0: 15，且所述抗体的重链包含SEQ ID N0: 18。
9.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID N0: 21，且所述抗体的重链包含SEQ ID N0: 24。
10.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，其能够以比mAl^974更高的亲和力结合TFPI的K2结构域。
11.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体，当TFPI被所述抗体饱和时，所述抗体能够将膜-结合的FVIIa/TF/FXa的TFPI抑制中和至少55%、诸如至少60%、诸如至少65%、诸如至少70%、诸如至少75%、诸如至少80%、诸如至少85%、诸如至少90%、诸如至少 95%、诸如多达100%、诸如100%，这在FVIIa/TF/F)(a抑制剂试验中测定。
12.—种真核细胞，其表达根据权利要求1-10中任一项的单克隆抗体或其片段。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项的抗体或根据权利要求11所述的多核苷酸和药学上可接受的载体或稀释剂。
14.根据权利要求1-10中任一项的单克隆抗体用于治疗具有凝血病的受试者的用途。
15.一种治疗具有凝血病的受试者的方法，所述方法包括，给所述受试者施用根据权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及特异性地结合组织因子途径抑制剂(TFPI)并减少血液凝固时间的抗体。这种抗体可以用于治疗具有凝血病的受试者。
文档编号A61K39/395GK102325795SQ200980157157
公开日2012年1月18日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月22日
发明者B.B.索伦森, B.O.克罗, B.劳里特曾, I.希尔登, J.T.克劳森, J.布雷因霍尔特, O.H.奥尔森 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司