^99mTc标记肼基烟酰胺基-叶酸配合物的制备方法及应用的制作方法

专利名称：^99mTc标记肼基烟酰胺基-叶酸配合物的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及"mTc标记的放射性药物化学和临床核医学技术领域，具体说是涉及到 一种99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物的制备方法及应用。
背景技术：
在医学放射性药物化学技术领域中，叶酸(NHHN-Folate)受体是一种通过聚糖磷 酯酰肌醇连接在细胞膜上的糖蛋白。叶酸受体在正常健康细胞中的表达高度保守，但是在 许多源于上皮组织的恶性肿瘤，如卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、鼻咽癌等肿瘤中却有 高度表达。叶酸受体对叶酸、甲氨蝶呤、5_甲基四氢叶酸等叶酸类似物具有很高的亲和性和 特异性，可介导这些物质内吞进入细胞。利用这一颇具特点的转运过程，可以将放射性核素 或其它治疗药物与叶酸或叶酸类似物偶联，通过叶酸受体介导进入靶细胞。因而，叶酸受体 可以作为放射性药物的"耙目标"，实现对叶酸受体高度表达的肿瘤的放射性核素显像和治 疗。 与单克隆抗体等其它靶向转运体系相比，叶酸及其类似物具有亲和性高、穿透能 力强、价格低廉、易于结构修饰、稳定性高等特点。因此，与叶酸及其类似物偶联的复合药物 成为目前靶向药物设计研究的一个热点。 当前用于标记叶酸受体靶向放射性药物的核素主要有^8Ga，min，"mTc严Cu，及 ，，"C等。其中min-DTPA-folate(Y)是第一个进入并完成II期临床的叶酸受体靶向肿 瘤显像剂(Siegel BA， Dehdashti F， Mutch DG， et al. Evaluationof mIn_DTPA_folate as a receptor—targeted diagnostic agent for ovarian cancer :initialclinical results. J Nucl Med 2003 ;44 :700-707)，但是由于mIn核素来源不方便，并且价格昂 贵，阻碍了其在临床上的进一步应用。"mTc理想的核性质使其成为核医学中应用最广泛 的核素，其中"mTc-EC20已经成功用于卵巢癌、宫颈癌、肾癌等临床I期诊断试验，II期 临床试验正在进行(Reddy JA， Xu LC， Parker N， Vetzel M， Leamon CP. Preclinical evaluation of 99mTc_EC20 for imaging folaterec印tor-postive tumors. J Nucl Med 2004;45:857-866)。 HYNIC(肼基烟酰胺基)作为一种双功能连接剂，由于它所形成的配 合物有很高的稳定性和标记率，广泛应用于"mTc标记。文献报道99mTC-HYNIC-f0late有 好的肿瘤/血、肿瘤/肉等靶与非靶比值，但是在荷KB肿瘤小鼠模型中的肿瘤绝对摄取 值较低，并且肝脏、脾等的本底较高(W.Guo， G.H.Hinkle， R. J. Lee，99mTc-HYNIC-folate : a novelrec印tor—based targeted radiopharmaceutical for tumor imaging. J Nucl Medl999 ;40 :1563-1569 ;刘丽琴，王世真等.叶酸受体肿瘤显像剂99mTc-肼基烟酰胺基酰 肼_叶酸的合成与动物显像.中国医学科学院学报.2006 ;28 :786-789中国医学科学院学 报)。因此，研制出新型的99mTc标记肼基烟酰胺基_叶酸配合物用于肿瘤显像剂，具有重要 的意义。

发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高肿瘤摄取、放射化学纯度高、稳定性好，应用在
肿瘤显像领域的"mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物，同时也提供其制备方法。 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案， 一种"mTc标记的肼基烟酰胺
基-叶酸配合物，表达式为"mTc-HYNIC-NHHN-Folate，其结构式为<formula>formula see original document page 4</formula> 该结构式中配体HYNIC-NHHN-Folate (肼基烟酰胺基 一 叶酸)分子中肼基 的氮原子、共配体Tricine和TPPTS分子中的氧原子与磷原子与99mTc进行配位得到 99mTc-HYNIC-NHHN-Folate配合物。 99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物的制备方法如下
a.配体肼基烟酰胺基 一 叶酸(HYNIC-NHHN-Folate)的合成
将化合物叶酸(NHHN-Folate)和琥珀酰亚胺_6_叔丁基氧羰基肼基吡啶_3_甲酸 (NHS-HYNIC-Boc)溶解在10_50mL的二甲基亚砜中，加入5_25mL吡啶，室温反应10_24h ;将 反应后的溶液缓慢滴入乙醚中，离心收集生成橙红色沉淀物，分别用乙醚和二氯甲烷洗涤， 真空干燥得橙红色固体；将橙红色固体加入l-5mL的三氟乙酸中，在氮气保护下，冰水浴反 应2h后，旋蒸除去三氟乙酸，将剩余油状液体用0. l-2mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后 滴入100-500mL吡啶中，离心收集产生的沉淀并用乙醚洗涤，真空干燥得到棕黄色粉末。具
体合成路线如图l所示
<formula>formula see original document page 5</formula>
b. 99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物(99mTC-HYNIC-NHHN-F0late)的制备
在青霉素小瓶中依次加入10-100mg三羟甲基-甲基甘氨酸(Tricine) ， 20-100 ii g 氯化亚锡(SnCl2 2H20) ， 20-200 y g配体肼基烟酰胺基_叶酸和0. l-lmL、 pH = 3. 6的醋 酸盐缓冲溶液(NaAc-HAc，O. 2mol/L)，摇匀后向其中注入37 370MBq的Tc-99m淋洗液 0. 1-0. 5mL，沸水浴加热15min ;在标记好的溶液中加入l_5mg三苯甲基膦三磺酸钠溶液 (TPPTS)，摇匀后沸水浴加热5-30min，得到本发明所述99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配 合物。 通过上述方法制备的99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物室温下体外稳定性 好，其纯化后放射化学纯度大于90%。荷瘤小鼠体内生物分布实验结果表明"，c标记的 肼基烟酰胺基_叶酸配合物在肿瘤中有很高的摄取和好的滞留，有很好的肿瘤/血，肿瘤 /肌肉比值，肝脏等非靶器官摄取低，适用于临床显像的要求。99mTC-HYNIC-NHHN-F0late、 99mTc-EC20和99mTC-HYNIC-F0late在荷瘤小鼠体内生物分布数据对比如下表1.配合物注射4h后在荷瘤小鼠体内的生物分布
99m'
Tc陽HYNIC-NHHN-Folate
99mTc-EC20
99m
Tc-HYNIC-Folate
0.98±0.20 0.86±0.10 0.64±0.19 0.29±0.06 114.88±8.12 0.36±0.14 0.81±0.23 0.30±0.07 9.79±1.66 12.09 40.3
2.20±0.06 4.22±0.04 1.58±0.19 0.44±0.07 109.90±12.78 3.04±2.04 1.99±0.39 0.26±0.07 17.24±4.22 8.66 66.31
0.68±0.09 4.03±0.41 1.66±0.86 2.55±0.39 42.0±6.76 0.48±0.12 0.67士0.10 0.48±0.04 5.62±0.75
8.39
11.7
BALB/c (KB细胞)
BALB/c (M109细胞)BALB/c (KB细胞) 以上结果表明，与99mTc-HYNIC-Folate相比，99mTc-HYNIC-NHHN-Folate有更高的肿 瘤摄取和更好的瘤/肉、瘤/血比值；与99mTc-EC20相比，99mTc-HYNIC-NHHN-Folate虽然肿 瘤绝对摄取稍低，但是有更好的瘤/肉比值以及更低的心、肝、肺摄取，所以其作为新型^Tc 标记的叶酸受体肿瘤显像剂具有更优良的生物分布性能，适宜推广应用。
具体实施例方式下面通过实施例详述本发明一种"mTc标记的肼基烟酰胺基 其结构式为
H2N
叶酸配合物
-TPPTS 99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物的制备方法如下 a.配体肼基烟酰胺基 一 叶酸(HYNIC-NHHN-Folate)的合成将520mg Folate-NHHN和532mg NHS-HYNIC-Boc溶解在25mL 二甲基亚砜中，加入
10mL吡啶，室温反应16h。将反应后的溶液缓慢滴入500mL乙醚中，离心收集生成的橙红色
沉淀，分别用乙醚(3X5mL)和二氯甲烷(3X5mL)洗涤，真空干燥得363mg橙红色固体，产
率48. 8%。 其核磁氢谱CHNMR， DMS0-d6)为 S :8. 94 (s， 1H) ，8. 65 (s， 1H) ，8. 53 (s， 1H) ，8. 19(m，2H) ，7. 85(m，2H)6. 98 (m. 1H)，
心肝肺脾肾肠肉血瘤細麵體l
66.61(d， J = 8. 3Hz，2H) ，4. 48(d， J = 5. 4Hz， 2H) ， 4. 32 (m， 2H) ， 3. 1—1. 8 (m， 16H) ， 1. 42 (s， 9H); 核磁碳谱(13CNMR， DMS0-d6)为:S :174. 0， 171. 5， 166. 2， 158. 6， 155. 0， 153. 8， 150. 7， 148. 5， 147. 6， 136. 5， 130. 3， 129. 0， 128. 8， 121. 3， 115. 6， 111. 1，79. 1，54. 8， 45. 7， 30. 7， 30. 5， 28. 7， 25. 7. 其质谱数据(ESI-MS)为m/z [M+H]+计算值为775. 4，产物测得775. 1.
将72mg上述橙红色固体加入lmL的三氟乙酸中，在氮气保护下，冰水浴反应2h 后，旋蒸除去三氟乙酸，将剩余油状液体用0. 5mLN， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后滴入 200mL吡啶中，离心收集产生的沉淀并用乙醚洗涤(3 X 5mL)，真空干燥得到37mg棕黄色粉 末，产率59. 7% ; 其核磁氢谱CHNMR， DMS0-d6)为 S :8. 62 (s， 1H) ， 7. 96 (br， 1H) ， 7. 78 (m， 1H) ， 7. 63 (m， 2H) ， 6. 90 (m， 1H) ， 6. 62 (d， J =7. 32， 2H) ， 4. 46 (m， 1H) ， 4. 31 (m， 2H) ， 2. 01-3. 01 (m， 10H) ， 1. 02-1. 70 (m， 8H) 核磁碳谱(13CNMR， DMS0-d6)为 S :174. 0， 171. 5， 166. 2， 158. 3， 153. 8， 150. 7， 148. 5， 147. 4， 138. 5， 130. 3， 129. 0， 128. 8， 121. 4， 115. 6， 111. 1，54. 8，45. 9，30. 7，30. 5，25. 7.其质谱数据(ESI-MS)为m/z [M+H]+计算值为675. 3，产物测得675. 2.
b. 99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物的制备 本配合物采用两步法进行标记，在青霉素小瓶中依次加入O. 5mL Tricine溶 液(80mg/mL)，0. 02mL SnCl2溶液(2mg/mL)，0. 05mL HYNIC-NHHN-Folate溶液(lmg/mL) 和0. 5mLNaAc-HAc缓冲溶液(0. 2mol/L， pH = 3. 6)，摇匀后向其中注入Tc_99m淋洗液 0. 2mL(约lmCi)，沸水浴加热15min。冷却至室温后，在标记好的溶液中加入0. 2mLTPPTS溶 液(5mg/mL)，摇匀后沸水浴加热15min，即可得到本发明所述99mTc-HYNIC-NHHN-Folate。
经采用高效液相色谱法(HPLC)对99mTC-HYNIC-NHHN-F0late的标记物进行鉴 定及纯化，ALLTECH高效液相色谱仪，Kromasi C-18反相柱(5mm， 250mmX4. 6mm) 。 HPLC 条件为A :90 % NH4HC03(0. 05mol/LpH = 7. 0)/10 % CH30H， B :100 % CH30H ;0 30min， 20 50% B ;流速lmL/min。各组分保留时间为99mTc04— :2. 8min，99mTc-Tricine :3. 5min， 99mTc-HYNIC-NHHN-Folate :8. 7min。 HPLC测定标记率为78% ，分离纯化后放射化学纯度大 于90%。 对99mTc-HYNIC-NHHN-Folate的性能及参数测定如下 [OO38] 1.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate脂水分配系数测定 取0. lmL纯化后的标记配合物溶液加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)-正辛醇混合液中 (0. 6mL PBS和0. 7mL正辛醇)，充分振荡3 5min后，再置于离心机中离心5min。分别取 0. lmL有机相和水相测量放射性计数，计算脂水分配系数平均值及其LogP。 (P =有机相的 放射性活度/水相的放射性活度)，测得logP = -3. 26，说明99mTC-HYNIC-NHHN-F0late是 亲水性物质。 2.99mTc-HYNIC-MlHN-Folate体外稳定性测定 将纯化后的标记配合物于室温下分别放置4h，期间采用HPLC法测定标记物的放 射化学纯度，观察标记配合物的体外稳定性。实验表明该配合物在放置4h后，放射化学纯
7度仍然大于90%，表明99mTC-HYNIC-NHHN-F0late在室温下体外稳定性好，适于临床应用的 需要。 3.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate电荷性质测定 利用纸电泳法测定标记配合物的电荷性质。采用新华一号层析纸为支持体，电泳 液为0. 025mol/L的PBS(pH = 7. 4)。将纯化后的标记配合物点样于已备好的层析纸正中， 调节电压至150V。电泳进行120min后关闭电源，取出层析纸条，晾干后测量标记配合物在 层析纸上的放射性分布。分别计算移向正极、负极及滞留原点组份的相对百分比值。结果 表明90%以上的放射性计数集中在正极，表明99mTC-HYNIC-NHHN-F0late为电负性物质。
4.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate的体外细胞结合性测定 在孔板中培养叶酸受体高表达的KB细胞(人口腔上皮癌细胞)，调整细胞浓度使 每孔细胞数为2X 105 4X 105。待12h细胞贴壁后，将细胞分为A、 B、 C三组，分别为总吸 收、内化和抑制组，每组三孔。A， B组加入配制好的乏叶酸培养基975 ii L， C组加入475 y L 培养基和500 ii L叶酸溶液(100 ii M) ， 37t:孵育40min后，A、B、 C组分别加入分离纯化后的 标记配合物25iiL(lMBq/mL)，37t:孵育lh。将孔板从培养箱中取出后吸出培养基，A， C组 用冰冻的PBS(pH = 7. 4)冲洗三次，B组用stripping buffer (0. 15M NaCl和0. 1M HAc，pH =3)冲洗三次，收集吸出的培养基和冲洗的溶液作为水相。每孔用lmL胰蛋白酶消化细胞 并用PBS冲洗孔板，收集后转入离心管作为固相，分别测定水相和固相放射性计数。结果表 明，此配合物与叶酸受体有很好的结合能力，细胞总结合占所加总放射性的24% ，抑制组加 入过量叶酸后，摄取受到显著抑制，说明叶酸受体对此配合物的结合是特异性结合。
5.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在正常小鼠体内的生物分布测定
选18 20g雌性正常昆明小鼠12只，随机分成4组，每组3只小鼠。用乏叶酸的 食物喂养小鼠一周后，从小鼠尾静脉分别注射O. lmL纯化后的标记配合物溶液(约185kBq， 放射化学纯度大于90% )，于注射后不同时间将小鼠断颈处死，取其血，心，肝，脾，肺等器 官，擦净后称重，并置于阱型Y探头中测量其放射性计数，计算每克组织的放射性计数占 总注射剂量的百分数(％ ID/g)。抑制组同时注入0. lmL叶酸溶液(lmg/mL)。实验结果见 表2。
表2.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在正常小鼠体内分布 脏器 lh 2h 2h (block) 4h 结果显示该标记配合物在肾脏中有较高的摄取和很好的滞留，在其他组织和器官 中的摄取都较低，这是因为在正常组织中，肾小管的叶酸受体表达较高，而其他组织和器官
1.80±0.71 1.45±0.12 2.58±0.37 1.29±0.19 125.10±16.81 2.05±0.28 1.00±0.57 5.79±1.60 1.17±0.06 2.73±0.64
1.46±0.22 0.92±0.23 1.47±0.20 0.51±0.03 124.05±20.74 1.18±0.49 1.02±0.44 0.99±0.51 1.35±0.46 1,21±0.13
0.67±0.09 0.53±0.03 0.97±0.18 0.51±0.04 9.73±4.52 1.10±0.26 1.42±0.78 1.13±0.39 0.79±0.66 1.30±0.29
2.32±0.17 0.84±0.08 1.74±0.35 1.22±0.81 153.80±20.10 2.64±0.51 1.33±0.69 2.45±0.90 1.13±0.67 0.52±0.02
、七肝肺脾肾骨肠肉胃血
8的叶酸受体表达相对保守。当注入过量叶酸时，标记配合物在肾脏中的摄取被明显抑制，表
明该标记配合物对叶酸受体具有较高的亲和性及有较高选择性。 6.99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在荷瘤小鼠模型中的生物分布测定取体质量约18 20g的裸鼠，于左上肢皮下接种KB肿瘤细胞株0. lmL(6Xl(f)，接
种后用乏叶酸的食物喂养10 14天，待瘤径长到0.8 l.Ocm时可用于实验。取荷KB肿
瘤小鼠10只，分为2组，尾静脉注射0. lmL (约185KBq，放射化学纯度大于90 % )的标记物
溶液，在注射后4h将小鼠断头处死，取出心、肝、脾、肺、肾、脑、骨、肿瘤、肌肉及血等组织，
称重并在锝分析仪内测其放射性计数，计算每克组织的放射性计数占总注射剂量的百分数
(% ID/g)，抑制组同时注入0. lmL叶酸溶液(lmg/mL)。实验结果如表3所示
表3. 99mTc-HYNIC-NHHN-Folate在荷瘤小鼠体内分布 4h 4h (block) 通过以上实施例的检测数据说明，"mTc-HYNIC-NHHN-Folate可以作为一种新型 39mTc标记叶酸受体肿瘤显像剂推广应用。
0.98±0.200.21±0.03
0.86±0.100.60±0.13
0.64±0.190.37±0.08
0.29±0.060.21±0.05
114.88±8.1217.25±1.22
0.36±0.140.20±0.10
0.81±0.230.24±0.08
0.57±0.371.83±2.73
0.30±0.070.35±0.08
9.79±1.660.60±0.09
、L肝肺脾肾肠肉胃血瘤
9
权利要求
一种99mTc标记的肼基烟酰胺基-叶酸配合物，其特征在于表达式为99mTc-HYNIC-NHHN-Folate，其结构式为该结构式中配体HYNIC-NHHN-Folate分子中肼基中的氮原子、共配体Tricine和TPPTS分子中的氧原子与磷原子与99mTc进行配位得到99mTc-HYNIC-NHHN-Folate配合物。FSA00000008760000011.tif
2.制备99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物的制备方法，其步骤如下 a.配体肼基烟酰胺基 一 叶酸的合成将化合物叶酸和琥珀酰亚胺-6-叔丁基氧羰基肼基吡啶_3-甲酸溶解在10-50mL的二 甲基亚砜中，加入5-25mL吡啶，室温反应10-24h ;将反应后的溶液缓慢滴入乙醚中，离心收 集生成橙红色沉淀物，分别用乙醚和二氯甲烷洗涤，真空干燥得橙红色固体；将橙红色固体 加入l-5mL的三氟乙酸中，在氮气保护下，冰水浴反应2h后，旋蒸除去三氟乙酸，将剩余油 状液体用0. l-2mL N，N-二甲基甲酰胺溶液后滴入100-500mL吡啶中，离心收集产生的沉淀 并用乙醚洗涤，真空干燥得到棕黄色粉末；合成路线为<formula>formula see original document page 2</formula>b. 99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物的制备在青霉素小瓶中依次加入lO-lOOmg三羟甲基-甲基甘氨酸，20-100 iig氯化亚锡， 20-200 g配体肼基烟酰胺基 一 叶酸和0. l-lmL、 pH = 3. 6的醋酸盐缓冲溶液，摇匀后向 其中注入37 370MBq的Tc-99m淋洗液0. 1_0. 5mL，沸水浴加热15min ;在标记好的溶液中 加入l-5mg三苯甲基膦三磺酸钠溶液，摇匀后沸水浴加热5-30min，得到本发明所述99mTc标 记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物。
3.如权利要求1所述的99mTc标记的肼基烟酰胺基_叶酸配合物，其特征在于所述配 合物可作为叶酸受体用于制备肿瘤显像剂。
全文摘要
本发明公开了一种99mTc标记的肼基烟酰胺基-叶酸配合物及制备方法和应用，通过a.配体肼基烟酰胺基-叶酸的合成和b.99mTc标记的肼基烟酰胺基-叶酸配合物两个步骤的制备，得到本目标配合物。本配合物具有放射化学纯度高、稳定性好、价格低廉，肿瘤摄取高并且滞留好，肿瘤/血、肿瘤/肌肉等靶/非靶比值好的优点，可作为一种新型99mTc标记叶酸受体制备肿瘤显像剂。
文档编号A61K103/10GK101775039SQ20101010111
公开日2010年7月14日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者唐志刚, 庞燕, 张俊波, 张现忠, 王学斌, 郭红娟, 陆洁 申请人:北京师范大学;北京师宏药物研制中心