专利名称：：用于抑制环加氧酶和/或5-脂氧化酶的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于预防或治疗由环加氧酶(以下简称'COX，')和/或5-脂氧化酶(以下简称'5-L0，')介导的生理性或病理性病症的组合物，所述组合物包含钩藤属(Unicariage皿s)植物或其提取物，特别是单独的钩藤属植物和另外还包含黄芩(Scutellariabaicalensis)禾口/或茶树(Camelliasinensis)提取物。背景领域由于社会经济的发展导致的生活水平的提高和生活方式的改变，以及平均寿命的增加，随着老龄化人口的增加，已给疾病的方面带来巨大的变化，慢性疾病在死亡的病因中的份量已超过流行病。现在，慢性病在医疗花费上的增加、所需的医疗标准的增加、寻找降低其的方法等方面吸引了更多的社会经济关注。最具代表性的慢性病包括关节炎、认知功能的降低、皮炎、胃炎、高血压、糖尿病、牙周炎等。关节炎是限制人类的日常生活活动的最重要的病因，且在女性和老人中发病频率特别高。可将关节炎分成骨关节炎(退行性关节炎)和类风湿性关节炎。由于身体关节的退化导致产生骨关节炎，其伴随着源于骨之间的连接区域(臀部、膝盖、颈、腰、手指、足趾指节等)的关节软骨的磨损或破坏的疼痛和炎症。一般地，关节软骨被破坏并可再生，但如果被破坏的量超过再生软骨的量，那么关节软骨吸收碰撞的量将减少或被磨破。从而，关节之间的骨相互之间会撞在一起，然后产生巨痛。这样的关节软骨的破坏是骨关节炎的开始，如果不进行治疗将导致巨痛。类风湿性关节炎是以多种方式在许多关节中发生的炎性自身免疫疾病。在关节炎患者的情况下，在关节的滑膜组织开始超常增生的同时，巨噬细胞、树突状细胞和激活的T淋巴细胞和B淋巴细胞迁移入滑膜组织，且多形核细胞在滑膜液中和软骨的表面上积累以诱导炎症。推断滑膜组织的这种炎症是由T淋巴细胞和不再被识别的自身抗原的反应诱导的。在该反应中，浸润入大部分组织的T淋巴细胞不在细胞表面显示激活标记，且细胞因子也几乎不表达。然而，在具有类风湿性关节炎症状的滑膜组织和滑液中观察到大量来源于巨噬细胞的细胞因子。代表性的细胞因子包括已知剌激滑膜成纤维细胞生长的白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子_a(TNF-a)。这些实验结果支持这样的理论，即T细胞在诱导滑膜组织的炎症中起着非常重要的作用，此后由源于激活的滑膜细胞的细胞因子保持炎症症状[CarsonD.A.等人，J.Clin.Invest.，87，pp379-383，1991:TigheH.等人，J.Exp.Med.，177，ppl0-118，1993:BurmesterG.R.等人，ArthritisRhe咖，40，pp5_18，1997:PanayiG.S.，Curr.Opin.Rheumatol.，9，pp236_240，1997]。为了减轻疼痛(包括关节炎)通常使用止痛药或抗炎药，代表性的药物是具有COX抑制性效应的NSAID(非类固醇类抗炎药)[UK-1，RBraham，BDawson，CGoodman,Theeffectofglucosaminesupplementationonpeopleexperiencingregularkneepain，Br.J.Sports.Med.2003;37:45-49]。NSAID例如阿斯匹林是最好出售的处方药物，且用于治疗退行性关节炎、类风湿性关节炎、头痛，因为其对消炎、减轻发烧和缓和疼痛是有效的。在这些NASID用于关节炎的情况下，其轻微地改善了症状，但不能阻止关节区域的软骨损失也不能阻止疾病的进展。此外，其具有严重的副作用如引起胃肠疾病，从而大约一半采用NASID的患者在一年内停止使用它们。因此，存在对新的治疗剂的需要。已开发了选择性抑制C0X-2的药物或同时抑制C0X-2和5-L0的治疗剂。当来自细胞膜的花生四烯酸的分离和代谢在许多途径中产生促炎症反应代谢产物时，引起炎症反应。导致炎症的两个重要途径，C0X-2和5-L0，是在花生四烯酸(AA)级联反应中起着重要作用的酶，且这些途径和产生分别在引发和促进炎症反应中起着重要作用的白细胞三烯和前列腺素E的途径同时发生。COX是在细胞膜的磷脂转变成花生四烯酸后在花生四烯酸转变成前列腺素(以下简称'PGs')的过程中起着催化剂作用的酶。依赖于其种类，该产生的PG可剌激平滑肌收縮，和根据动物的不同而减少或增加血压或血液粘聚力。此外，其起着加速膜中的离子运输、剌激炎症和阻止脂质组织中的脂质降解的作用。因此，作为产生这些炎症介质的原因的酶已成为针对炎症治疗的许多新药的靶，所述炎症是类风湿性关节炎、骨关节炎、皮炎、认知功能相关性疾病和癌症或退行性疾病的病因。在本领域内已知两类C0X，C0X-1和C0X-2。C0X-1如终如一地在大多数组织中表达，且起着"管家基因"的作用。S卩，其参与PG的产生和扩张血管以维持肾功能和血小板血栓烷的产生，所述PG存在于胃粘膜中。C0X-2不在大多数正常的组织中表达，且在疾病或生理性病症下由以前表达的生长因子诱导。特别地，已知其由导致促炎症的细胞因子广泛诱导。已沿用至今的用于治疗炎症的NSAID甚至抑制在正常组织中一贯表达的C0X-1，从而导致副作用例如胃粘膜侵蚀、溃疡等。最近，已发展了作为改善该状况的新药物的C0X-2选择性抑制剂。塞来考昔是现在在临床上用作抗炎剂和抗癌剂的代表性C0X-2选择性抑制剂。其对于骨关节炎和类风湿性关节炎的治疗和存在于具有家族性腺瘤性息肉病(FAP)的患者的结肠中的息肉的数目的减少是有效的。参与在炎症反应中将花生四烯酸代谢成化学递质的代谢过程的另一种酶是脂氧化酶。存在三种脂氧化酶，5-、12-和15-脂氧化酶，其中5-脂氧化酶参与通过5-HPETE从花生四烯酸合成白细胞三烯A4、B4、C4、D4、E4(LTA4、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)等的合成过程。Samuelsson等人公开了在这些白细胞三烯中，LTB4是在炎症反应的第二阶段中起作用的白细胞中的一种产物，且主要在多形核白细胞(P丽U中生物合成，且已知显示功能例如白细胞凝集、浸润、趋化性和溶酶体酶的分离等。且，许多科学家已进行了5-L0激活相关性因子和用于抑制这些激活作用的药物开发的研究，但收效甚微，只有ETYA和BW755C已被发展为药物[Kyung_rakMIN等人，Activationof5-lipoxygenaseandleukotrieneB4biosynthesisinhibitingmaterial,Pharmacology,第33(6)巻，319-323(1989)]。COX抑制剂的反应机制和大多数常规的NSAID相同，因此将COX用于治疗许多病症例如由短暂病症和慢性病症(其中炎症起着重要作用)中的炎症产生的疼痛和肿胀。短暂病症是指轻微擦伤、晒伤、接触传染性皮炎、头痛、月经痛等。慢性疾病是指认识机能的疾病、类风湿性关节炎、骨关节炎等。COX抑制剂也用于皮肤病症如皮肤硬结(skinscleroma)和系统性红斑狼疮4(SLE)[Goebel等人，Chem.Res.Tox.，12:488-500，1999，Patrono等人，J.Clin.Invest.，76:1011-1018，1985]。此外，COX抑制剂也用于减轻炎症性但非风湿样皮肤病症例如牛皮癣，其中其通过减少因前列腺素的过度产生而导致的炎症来显示直接的效应[Fogh等人，ActaDermVenerologica，73:191-193，1993]。除了其用作抗炎药的用途外，COX抑制剂在癌症治疗中起着潜在的作用。在许多人类恶性肿瘤中已观察到COX的过度表达，且COX抑制剂显示对于遭受皮肤癌、乳腺癌和膀胱癌的动物的治疗是有效的。尽管未完全鉴定反应机制，但已显示COX的过度表达抑制细胞死亡和增加致瘤细胞类型的侵袭性[D卿ke等人，J.Can.Res.Clin.Oncol.，127:411-417，2001，Moore禾口Simmons,CurrentMed.Chem.，7:1131-44，2000]。此外，由于近年来科技术进步的原因，已确定了C0X表达、全身性炎症和老年痴呆症的发病机理之间的相互关系[Ho等人，Arch.Neurol.，58:487_92，2001]。在动物模型中，过度表达COX酶的转基因小鼠具有更易受伤害的神经元。NIA(美国国家老人学研究院NationalInstituteonAging)开始了验证NSAID是否可延迟老年痴呆症的进展的临床试验，且许多报导显示炎症反应中产生的COX的抑制有助于认知功能的改善[CernakI.，ExpBrainRes.，147(2):193-9,2002，CasoliniP.，JNeurosciRes.，68(3):337-43，2002，AndreassonKI.，JNeurosci.，21(20):8198-209，2001]。此外，证明了COX抑制剂对于精神病是有效的[MullerN.，Expert0pinI読stigDrugs,13(8):1033-44，2004]。此外，有报导显示抑制C0X-2和5-L0两者的抑制剂在小鼠模型中抑制年老心脏的动脉管收縮[Gok等人，Pharmacology,60:4146,2000].黑儿茶(Uncariagambir)是属于茜草家族的植物。其自然地生长于整个东印度群岛，且在马来西亚、中国、印度、苏门答腊岛和文莱被栽培。白色的花开于叶腋处。当花凋落时，花柄弯曲成钩状以缠绕其他植物。在播种黑儿茶种子一年后，每隔4至8个月，可通过切割和提取叶茎的末端获得所谓的水提取物。主要可从6年生的树获得该水提取物。当树长至大约15年时，应当耕犁土壤以分离根部。该水提取物包含d-和dl-儿茶素(儿茶酚)、鞣酸、槲皮素、和生物碱黑儿茶碱。黑儿茶的提取物用于药用目的，也主要用于棕色染料或皮革制革。特别地，东南亚的一些人通过将和水混合的黑儿茶涂抹在Bin-ran-za上来食用该混合物。作为收敛剂的水提取物广泛地用于生产嚼服药物例如In-dan。按照Dong-Eui治疗法，将所述水提取物作为用于伤口、口中的疮、血便、血尿、咯血、白带和其他皮肤病的收敛剂或凝血剂[韩国食品与药品管理局(KoreaFoodandDrugAdministration)]。此夕卜，Dong-Eui-Bo-Gam教导可将黑儿茶作为"s3engbomy皿gdMi、yMigm3echMig、ch皿pochMig、whMichMig禾口gy皿gb皿dok.，，用于因肿胀的腱和骨引起的疼痛的治疗。黄吝(ScutellariaeRadix)是指属于唇形科属的黄吝(Scutellariabaicalensis)(多年生草本植物)的根。该植物是多年生的且在2年后的7月至9月开花。茎生长得直且粗，但在肥沃的土壤中，其生长歪斜或甚至倒伏。茎的高度在40至60cm范围内，叶是对称的且呈避雷针形状，无叶柄。花是总状花序，且在枝的末端聚集和开花，花的形状是唇形的和开放的。在种植3至4年后的秋季或春季采集根，然后在除去周皮后，将其风干并用于药物目的。此时，根的颜色是黄色。一般地，该药草的木质部和薄壁组织都很大，从而髓大部分是空的，因此一般称为腐朽髓。然而，在日本，其具有充实的髓的鲜根被称为Cha-geum，具有空髓的根称为Sook-ge咖、粉碎的根称为Pyun-geum等。在韩国，其也被称为Ko-Geum、Won-geum、Ky皿g-geum，、Kong-jang等。黄芩，中国药用植物，包含大量的无B环类黄酮，所述无B环类黄酮包括黄芩黄素(baicalein)、黄吝苷(baicalin)、汉黄吝黄素(wogonin)禾口baicalenoside。常规地，黄吝用于病症的治疗，所述治疗包括排除、清泻火气、湿温、夏季发热综合症、烦渴、痈、猩红热、痢疾、呕血和鼻衄。此外，其还用于预防流产。现在黄芩在临床上用于治疗病症，包括儿科细菌性腹泻、高血压、支气管哮喘和上呼吸道感染。报导显示黄芩根的治疗支气管哮喘的药理作用和无B环类黄酮的存在以及嗜酸性粒细胞浸润相关性嗜酸性粒细胞活化趋化因子的抑制相关联[Nakajima等人，(2001)PlantaMed.67(2):132-135]。近年来作为健康食物吸引关注的茶树(Camelliasinensis)包含许多有用的组分。在所述组分中，儿茶素化合物具有相对高的抗氧化作用，且很多关于其的研究在进行中。茶树中的儿茶素化合物包括表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)等。除了优秀的抗氧化作用外，儿茶素化合物具有这样的作用如抗癌作用、免疫系统增强、皮肤癌预防、抗血栓作用、心脏病预防、胆固醇预防等作用。因此，一直在饮料和制药领域内对茶树中的该儿茶素化合物进行研究。所述研究一直在中国活跃地进行着，且在中国，茶树的许多产品已被商品化。SimingshannaturalbiologicalproductCo.，Ltd.，Chinatianbaobiochemicalplant禾卩HealthLandSuppliesLtd.，等是已进行茶树提取物的销售和研究的龙头公司。在日本，作为对儿茶素化合物研究的结果，由DaedongpharmaceuticalsCo.，Ltd生产的'P_儿茶素'和由SamjungagricultureandforestryCo.，Ltd生产的'儿茶素化合物粉剂'已被商品化，且已倾注持续的研究和投资以发展具有更高产量和经济的方法。茶树的另一种有效成分，多酚黄酮，抑制由于一定量的C0X-2、NFkB(核因子kB)和bcl-X(L)基因的mRNA而变成癌性的结肠细胞的生长。如可从下面举例说明的基本结构中所看到的，无B环黄酮和无B环黄酮醇是芳香化合物中取代基不存在于B环结构中的类黄酮化合物的特定种类[KoreanPatentLaid-openPublicationNo.10-2004-0025884].已有报导显示钩藤属植物(包括黑儿茶)可用作抗炎药物。特别地，还不清楚黑儿茶和黄芩和/或茶树的组合是否可用作抗炎药，特别是预防或治疗由COX途径和/或5-L0途径介导的疾病和病症包括骨关节炎或类风湿性关节炎的抗炎药。本发明的公开内容和西方先进国家中的发展策略截然不同，本发明者已持续地研究天然产品以发展新的C0X和/或5-L0抑制性药物。作为结果，其发现钩藤属植物(包括黑儿茶)具有C0X和/或5-L0抑制作用。此外，为发现和所述提取物一起显示协同效应的天然药物，其已使用体外试验(C0X-1和2，5-L0)和体内试验[肿胀，CIA(CollagenaseInducedArthritis)模型]以及GAG分析进行了许多实验，以确定关节保护效应。作为结果，其还发现组合黄芩提取物和/或茶树提取物的混合物显示对COX和/或5-LO抑制活性的极大提高的协同效应，且使用CCOY公式(CCOYS.R.，Calculatingsynergisticandantagonisticresponseofherbicidecombinations，Weeds15，20-22，1967)测量协同效应以完成本发明。因此，本发明的目的是提供组合物，所述组合物用于预防或治疗由C0X和/或5-L0介导的生理性和病理性病症，其包含显示COX和/或5-L0抑制作用的新的植物(即，钩藤属植物)提取物或另外还包含黄芩提取物和/或茶树提取物。本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的组合物，所述组合物包含黄芩提取物和/或茶树提取物。本发明的另一个目的是提供预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的上述组合物的用途。本发明的另一个目的是提供通过给哺乳动物施用治疗有效量的上述组合物来预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的方法。本发明的另一个目的是提供制备用于预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的试剂的方法，通过将钩藤属植物和黄芩提取物和/或茶树提取物混合，或将黄芩提取物和茶树提取物混合来制备所述试剂。附图概述图1是显示实施例1和2的消炎活性的图。图2是显示实施例5至8的消炎活性的图。图3是显示实施例5和实施例1和3的消炎活性的图。图4是显示实施例6和实施例1和4的消炎活性的图。图5是显示实施例7的消炎活性的图。图6是显示实施例8和实施例3和4的消炎活性的图。图7是显示在施用实施例5后显示小鼠的爪的肿胀随时间变化的图。图8是显示在施用实施例5后显示关节炎指数随时间变化的图。图9是显示在施用实施例5后显示CIA小鼠关节的软骨组织的图。图10是显示实验例1至4的关节保护效应的图。图11是实验例5至8的关节保护效应的图。进行本发明的最佳模型为实现上述目的，本发明提供了用于预防或治疗由C0X和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的、包含钩藤属植物或其提取物的组合物。本发明也提供了用于预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的、包含所述钩藤属植物和额外地黄芩提取物和/或茶树提取物的组合物。本发明也提供了用于预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的、包含黄芩提取物和/或茶树提取物的组合物。本发明也提供了使用包含钩藤属和其提取物的组合物、包含黄芩提取物和茶树提取物的组合物和包含钩藤属植物或其提取物和黄芩提取物和/或茶树提取物的组合物预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的用途。本发明也提供了通过给哺乳动物施用治疗有效量的包含钩藤属植物或其提取物的组合物、或包含黄芩提取物和茶树提取物的组合物来预防或治疗由COX和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的方法。本发明也提供了通过以0.110:0.110的重量比将钩藤属植物或其提取物和黄芩提取物和/或茶树提取物混合或以o.iio:o.iio的重量比将黄芩提取物和茶树提取物混合来制备用于预防或治疗由COX和/或5-LO介导的生理性和病理性病症的试剂的方法。优选地选择一种或多种钩藤属植物，所述植物选自黑儿茶、U.atte皿ataKorth.、U.borneensisHavil.、U.callophyllaKorth.、U.ellipticaR.Br.、U.guianensis(Aubl.)Gmel.、U.homomallaMiq.、U.lanosavar.glabrata(Bl.)Ridsd.、U.macrophyllaWall.、U.rhynchophyllaMiq.、U.sinensis(Oliv.)Havil.、U.tomentosa(Wi1Id.)DC.、U.yu皿anensisHsiaK.C.、U.hirsutaHavil.禾口U.lanosavar.appendiculataf.setiloba(Benth.)Ridsd.，特别优选地使用黑儿茶。在本发明组合物中，可以可商购获得的常规药草材料的形式使用钩藤属植物、黄芩和茶树，且也可通过药草、枝、壳、叶、芽、根、内皮等形式，优选地以粉末或提取物的形式使用黄芩和茶树。可通过用水、有机溶剂或其混合溶剂提取钩藤属植物、黄芩和茶树来使用本发明的钩藤属植物、黄芩和茶树提取物。所有常规溶剂可用作上述有机溶剂，优选地极性溶剂例如水、C卜4醇等，或非极性溶剂例如正_己烷、二氯甲烷等或其混合溶剂。本发明的非极性溶剂提取物包括用选自正-己烷、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯的非极性溶剂，优选地正-己烷、二氯甲烷、或乙酸乙酯萃取的提取物。此外，本发明的极性溶剂提取物包括用选自丙酮、水、4醇例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等或异丙醇的极性溶剂萃取的提取物。可通过常规的方法例如热水提取、超声降解法等进行上述提取，且可将提取物的冻干制品用于本发明组合物。此外，可通过常规的分级分离法或层析进一步纯化所述提取物，且这些分级分离的材料或纯化的材料也在本发明的范围之内。本发明的组合物显示优良的C0X和/或5-L0抑制效应，且通过使用天然的草药可用于预防或治疗由不同的C0X途径和/或5-L0途径介导的疾病和病症(特别地包括骨关节炎和类风湿性关节炎)而无任何副作用。在本说明书中，术语，"由C0X和/或5-L0途径介导的生理性和病理性病症"包括，例如，选自炎性疾病、月经痛、动脉硬化、心脏病发作、肥胖症、糖尿病、X综合征、认知功能下降的疾病、老年痴呆症、呼吸系统变应性反应、慢性静脉功能不全、痔疮、系统性红斑狼疮、牛皮癣、慢性紧张性头痛、偏头痛、炎性肠病、由病毒、细菌和孢子引起的局部感染、晒伤、烧伤、接触传染性皮炎、黑色素瘤和癌症的疾病和病症。在本发明的组合物中，可单独地使用钩藤属植物，特别是黑儿茶，但优选地使用组合的组合物，即将钩藤属植物或其提取物额外地和黄芩提取物、茶树提取物、或黄芩和茶树的提取物混合以显示协同效应。特别地，如下列实验性实施例中所显示的，单独的黄吝不显示C0X和/或5-L0抑制效应。然而，令人惊奇的是，当将钩藤属植物，特别是黑儿茶提取物和黄芩和/或茶树提取物一起施用时，和当施用黄芩和茶树提取物的组合物时，观察到协同效应。在本发明的组合物中，使用COLBY公式(COLBYS.R.，Calculatingsynergisticandantagonisticresponseofherbicidecombinations,Weeds15，20-22，1967)测量和确认在施用所述组合物时，和提取物的单独施用相比的协同效应。如上所述，当将钩藤属植物，特别是黑儿茶和黄芩和/或茶树提取物一起使用时，其黑儿茶黄芩茶树的重量比可为o.iio:o.i10:o.iio，优选地iio:iio:110，优选地i7:i7:i7。且，当将黄吝和茶树组合时，其可以o.iio:o.i10、优选地iio:i10、更优选地i7:i7的重量比混合。可按照制药领域内的方法，通过将本发明的组合物和药物可接受的媒介物、赋形剂等混合来将其配制成常规的药剂，例如，溶液例如饮料、糖浆剂、胶囊剂、颗粒、片剂、粉剂、丸剂、软膏剂和乳剂、皮肤外用制剂例如凝胶剂等；且所述组合物可通过口服或胃肠外施用。优选地，可在饮食之前或之后以胶囊剂、片剂和饮料的形式施用本发明的组合物以获得快速效应。包含本发明的组合物的胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、溶液、丸剂等优选地用作药物或保健品。在本发明中，"保健品"是指通过使用具有对人体有用的功能的物质或成分，以片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液、丸剂等形式制备和加工的食物产品。依赖于活性成分至身体的吸收程度、排泄率、年龄、体重、性别和患者的身体状况、治疗疾病的严重度等适当地施用本发明的组合物。然而，一般地，优选地以每天0.01500mg/kg，优选地0.1200mg/kg，每天1至3次给成人施用溶液形式的本发明组合物。在其他制剂中，可口服施用基于上述的溶液剂量的合适的量。在下文中，将参考下列实施例更详细地描述本发明，但本发明的范围不应当被解释为以任何方式受其限制。实施例1)黑儿茶、黄芩和茶树提取物的制备实施例l.黑儿茶热水提取物的制备用热蒸气蒸黑儿茶的嫩叶(50g)。然后，通过加入纯化水并挤出汁液来提取它们，缓慢地冷却和重结晶收集的汁液溶液以产生7.87g黑儿茶提取物粉剂(产率15.74%)。实施例2.黑儿茶乙醇提取物的制备通过加入乙醇并挤出汁液来提取黑儿茶的嫩叶(50g)，缓慢地冷却和再结晶收集的汁液溶液以产生7.65g黑儿茶提取物粉剂(产率15.3%)。实施例3.黄芩提取物的制备将黄芩(50g)置于1L圆底烧瓶中，然后加入纯化水(350ml)，在8(TC于回流条件下提取2小时。冷却、过滤和浓縮提取物，产生16.5g黄芩提取物粉剂(产率32.95%).实施例4.茶树提取物的制备将茶树(50g)置于1L圆底烧瓶中，然后加入含水乙醇(500ml)，在85t:于回流条件下提取3小时。冷却、过滤和浓縮提取物，产生13.5g茶树提取物粉剂(产率27%)。实施例9.其他钩藤属植物的提取将Uncariasinensis(Olv.)Havil.(50g)置于1L圆底烧瓶中，然后加入纯化水(500ml)，在回流条件下提取5小时。冷却、过滤和浓縮提取物，产生7gUncariasinensi提取物粉剂(产率14%)。2)混合物的制备輔你l5.lUI茶禾瞎緣混，白儘ll如下制备黑儿茶和黄芩的混合物。组分加入量(g)加入比例(％)实施例12.610.20实施例318.472.16糊精_麦芽糖复合剂4.517.65合计25.5跳0輔艇IUI茶織扭鍾始麵燃如下制备黑儿茶和茶树的混合物。组分加入量(g)加入比例(％)实施例12.6010.20实施例415.3060.0糊精_麦芽糖复合剂7.6029.8合计25.50100.00实施例7.黑；l,茶、昔芩和茶树的混合物的制备如下制备黑儿茶、黄芩和茶树的混合物。组分加入量(g)加入比例(％)实施例12.6010.20实施例318.4072.16<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>輔數群織扭鍾始麵燃如下制备黄芩和茶树的混合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实验件实施例1)COX和/或5-LO抑制活性的检测(l)COX抑制活性的检测①试验材料-材料C0X分析试剂盒(Cayman,Cat#760111)、喷哚美辛(Cayman,Cat#70270)、AA-861(Biomol，Cat能I—216)、H202(Aldrich，Cat#216763)-样品实施例1至8-f农度10、50、500、1000iig/ml②检测方法将分析缓冲液(160ill)和血红素(10Pi)置于背景小孔(BackgroundWells)中。将分析缓冲液(150ii1)、血红素(10ii1)和酶(C0X-1或C0X-2，lOiil)置于100%的起始活性小孔(InitialActivityWell)中。将分析缓冲液(150iU)、血红素(lOiil)和酶(C0X-1或C0X-2，lOiil)置于抑制剂小孔(InhibitorWell)中。将溶解在匿S0中的样品(lOiU)置于抑制剂小孔中。将用于溶解样品的溶剂匿S0(10iil)，而非样品，置于100%的起始活性小孔和背景小孔中。在缓慢地摇动后，将其在25t:下反应5分钟。将20iU比色底物加入每个小孔。然后，将20iU花生四烯酸加入每个小孔(终浓度100iiM)。在缓慢摇动后，让其在25t:下反应5分钟。停止反应，测量590nm(590611nm)处的吸光率，然后通过下列计算公式以百分比计算试验组和对照组比较的相对活性。-计算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>③试验结果单一提取物和混合物的对C0X-1、2的50%抵制活性(单位iig/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结论在单一提取物中，根据实施例1=实施例2口实施例3的结果，黑儿茶提取物显示优良的COX抑制活性。且，其中所述单一提取物以适当的比例混合的混合组合物显示以实施例6>实施例7>实施例8>实施例5的顺序排列的C0X抑制活性。如从上述试验所知的，黑儿茶粗提取物(实施例1和实施例2)显示优良的C0X抑制活性，而黄芩的5-L0抑制活性不显著。然而，令人惊奇的是，所述提取物的混合物显示协同作用的COX抑制活性。(2)5-L0(LTB4产品抑制)①试验材料RPMI1640培养基sigmaCet#R8758T75瓶Corning(430641)抗生素Gibco(15240-062)FBS:biowhittaker(14-471QM)微量管sarstedt(72.690)PBS:biowhittaker(17-512F)离心机Hanil(micro-12)-样品实施例1至8-浓度:0.025、0.05、l、20iig/ml(实施例1至3)0.005、0.05、0.5、5iig/ml(实施例4至7)②试验方法在5XC02和37t:的条件下，将HT-29细胞系(韩国细胞系文库KoreaCellLineBank)在T15培养瓶中培养于20mLRPMI1640培养基(10X的FBS)中，且将所述细胞系每周传代2-3次。将HT-29细胞系以1.5-2.0X105/小孔/2ml播种于6孔培养板中，然后在5%C02和37°C的条件下培养直至其显示大约60-70%的融合。在除去培养基后，用PBS(biowhittaker，17-512F)洗涤细胞2-3次，然后向其中加入2mL新培养基(5%FBS，biowhittaker，14-471QM)。处理样品使其终浓度为0、0.005、0.05、0.5和5iig/ml。此夕卜，处理LPS以达到1iig/ml的终浓度。以用于溶解样品的溶剂(低于O.1%匿S0)，而非样品，处理未处理的N-对照。P-对照只用LPS处理。将每个样品在5%C02和37°C的条件下反应24小时。在反应停止后，用PBS洗涤细胞两次，用刮器刮取细胞，将其置于微量管中，然后在超过10，000rpm下离心5分钟，之后收集细胞。在弃去上清液后，向其中只保留沉淀的管中加入裂解缓冲液并在冰中处理5分钟，然后细胞被破坏。将其在超过10，000rpm下离心5分钟后，留下细胞碎片且只将上清液收集入新的管中。将该样品在-701:下贮存直至用于LTB4ELISA分析。用试剂盒中的EIA缓冲液以1/20稀释细胞裂解物。将LTB4标准制备为0、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0和4.Oiig/ml。通过用EA缓冲液以1/50将其稀释来制备白细胞三烯C4酶缀合物。将50标准或样品和501稀释的酶缀合物置于包被有抗体的96孔板中。在缓慢摇动后，让其在室温下加盖反应l小时。在反应停止后，用3001洗涤缓冲液洗涤板3次。向板中加入1501底物，然后在缓慢摇动下反应30分钟。测量650nm处的吸光率，通过下列计算公式以百分比计算和对照组相比的试验组的相对活性。按照Bradford蛋白的量对各值进行标准化。-计算公式抑制的％=[(NC-PC)-(NC-S)/(NC-PC)]xlOO③试验结果单一提取物和混合物的对5-LO的50%抑制活性(单位g/ml)5-LO实施例10.044实施例20.040实施例30.846实施例50.039实施例60.007实施例70.024实施例80.027结论单一提取物的5-LO抑制活性的顺序是实施例1=实施例2口实施例3。且，其中以适当比例混合所述单一提取物的混合物以实施例6>实施例7^实施例8>实施例5的顺序显示5-LO抑制活性。和上述关于C0X-1、2的试验相似，在本试验中，黑儿茶粗提取物也显示优良的5-L0抑制，而黄芩提取物的5-LO抑制活性不显著。然而，令人惊奇的是，所述提取物的混合物显示协同作用的5-LO抑制活性。(3)耳肿胀抑制试验(肿胀抑制试验)①试验材料-试验动物ICR小鼠(DaehanBioLink)-炎症诱导花生四烯酸(2mg/20y1)-样品实施例1至8-阳性对照吲哚美辛(25，50mg/kg)-浓度50、75、100mg/kg②试验方法在炎症产生之前24小时和1小时时，给试验动物(ICR小鼠，DaehanBioLink)施用试验材料。然后，以2mg/20iU的浓度给试验动物的右耳施用花生四烯酸，给左耳施用作为对照溶剂的丙酮，然后用测径器测量用于溶剂比较的耳的厚度。作为对照材料，在施用花生四烯酸之前24小时和1小时，口服施用吲哚美辛，其是NSAID的代表性消炎和消炎止痛药。在第1、2和3小时时测量对其施用花生四烯酸和丙酮的试验动物的耳的厚度。③结论实施例1和2的消炎活性显示于图1;实施例5和实施例1、3的消炎活性显示于图3;实施例6和实施例1、4的消炎活性显示于图4;实施例7和实施例1、3、4的消炎活性显示于图5;和实施例8和实施例1、4的消炎活性显示于图6^P<0.05，**P<0.01).如从上面图1至图6所知的，黑儿茶单一提取物和其混合物显示消炎作用。特别地，实施例1显示比实施例3更强的消炎作用，且其实施例5的混合物(100mg/kg)显示来自单一提取物的混合的协同效应。且，为实施例1和3的混合物的实施例5显示消炎活性的浓度依赖性增加的趋势。如上所示，当将实施例1和实施例3或实施例4混合时，或将实施例3和实施例4混合时，和单独的实施例1相比，组合物(实施例5至8)显示改善的耳肿胀抑制作用。(4)通过CIA模型进行的消炎活性的验证①试验材料_试验动物DBA/1小鼠(OrientalCo.，Ltd.)-阳性对照吲哚美辛(50mg/kg)-对照材料葡糖胺(250mg/kg)-样品实施例5-浓度100、200mg/kg②试验方法使用8周的DBA/1小鼠(OrientalCo.，Ltd)诱导关节炎。为免疫小鼠，给小鼠的尾部施用lOOyg悬浮CFA(完全弗氏佐剂)的胶原。21天后，100yg悬浮CFA(完全弗氏佐剂)的胶原诱导了关节炎。从第21天，将小鼠分为5组，每组5只小鼠，且给小鼠施用制备的提取物直至第56天。每周一次，测量小鼠的重量、具有肿胀的爪的厚度和分数(0:正常，l:轻微发红，2:足指肿胀，3:全面严重的肿胀，4:整个足趾和关节的最严重肿胀)。在第56天，收集其血液；对小鼠进行尸检；在固定和脱钙的过程后用HE(苏木精和曙红)对其肿胀的爪染色；然后通过显微镜观察关节组织。③结论在施用胶原后，小鼠爪的肿胀随时间流逝的改变和关节炎指数随时间流逝的改变分别显示于图7和图8(*P<0.05)。且，施用实施例5后的CIA小鼠关节的软骨组织显示于图9。如从上面图7至图9中所知的，和对照组相比，实施例5施用组为大约20%的有效性。观察到和对照组与葡糖胺施用组相比，关节组织的破坏和免疫细胞的浸润显著减少。(Corning3516)、Dulbecco，s改良Eagle，s培养基(DMEM，Biowhittaker)、加热灭活的胎牛血清白蛋白(FBS)、青霉素-链霉素(Gibco)、IL_1a(R&D200LA-002)和BlyscanGlycosaminoglycan分析试剂盒(BiocolorB1000)-样品实施例1至8-对照材料葡糖胺-浓度5、50、500iig/ml-试验动物获自Samtako(Ky皿ggi-provence，0san-si)的新西兰白兔(2.0kg，9周)②试验方法-软骨外植块培养从9周的兔子收集膝关节软骨。然后，将收集的软骨置于DMEM(5XFBS、青霉素100U/ml、链霉素lOOiig/ml)中并在37。C下的C02培养基中稳定24小时。在处理样品前，将每一个软骨切成一定大小的薄片并置于24孔中。处理制备的样品和IL-1a(5ng/ml)。在37°C、5%C02培养基中将经处理的样品反应60小时后，收集上清液并在-2(rC下贮存，且在下一次试验中使用。-GAG分析为测量上清液的GAG分泌程度，使用Blyscan分析试剂盒。测量656nm处的吸光率，通过下列公式以百分比计算和对照组相比的试验组的相对活性。-计算公式计算公式=[(PC-样品)-(PC-NC)]x100NC:阴性对照，PC:阳性对照，S:样品③试验结果实施例1至4和5至8的关节保护作用分别显示于图10和图11中。结论特别地，实施例1至4禾P5至8在《50iig/ml的浓度上显示关节保护作用。配制的实施例1:溶液的制备:0167]实施例6的提取物20g:0168]糖10g:0169]异构化糖10g:0170]柠檬的味道适当的量:0171]加入纯化水后的总量100ml:0172]按照溶液的常规制备方法混合上述组分，并将其灭菌以产生溶液。:0173]配制的实施例2:溶液的制备:0174]实施例的提取物130mg:0175]糖10mg:0176]异构化糖10mg15对羟基苯甲酸丙酯lg按照软膏剂的常规制备方法混合上述组分以产生软膏剂。工业适用性包含黑儿茶提取物的本发明组合物显示优良的COX和/或5-LO抑制活性，另外还包含黄芩提取物和/或茶树提取物的本发明组合物显示协同效应，且黄芩和茶树提取物的联合组合物也显示协同效应。从天然的材料获得本发明的组合物，因而其显示优良的COX和/或5-L0抑制活性而无副作用的危险，从而可用于预防或治疗疾病，所述疾病包括炎性疾病、月经痛、动脉硬化、心脏病发作、肥胖症、糖尿病、X综合征、认知功能的疾病、老年痴呆症、呼吸系统变应性反应、慢性静脉功能不全、痔疮、系统性红斑狼疮、牛皮癣、慢性紧张性头痛、偏头痛、炎性肠病、由病毒、细菌和孢子引起的局部感染、晒伤、烧伤、接触传染性皮炎、黑色素瘤和癌症。此外，本发明组合物可用于预防或治疗不同的炎性疾病，包括，特别是骨关节炎、类风湿性关节炎等。权利要求用于预防或治疗由环加氧酶即COX和/或5-脂氧化合酶即5-LO介导的生理性和病理性病症的、包含黄芩和茶树提取物的组合物，其中黄芩和茶树的重量比为0.1～10∶0.1～10。2.权利要求1的组合物，其中由COX和/或5-LO介导的生理性和病理性病症选自炎性疾病、月经痛、动脉硬化、心脏病发作、肥胖症、糖尿病、X综合征、认知功能的疾病、老年痴呆症、呼吸系统变应性反应、慢性静脉功能不全、痔疮、系统性红斑狼疮、牛皮癣、慢性紧张性头痛、偏头痛、炎性肠病、由病毒、细菌和孢子引起的局部感染、晒伤、烧伤、接触传染性皮炎、黑色素瘤和癌症。3.权利要求2的组合物，其中由C0X和/或5-L0介导的生理性和病理性病症是炎性疾病。4.权利要求l的组合物，其中用一种或多种选自水、丙酮、或C卜4醇和异丙醇的极性溶剂提取所述提取物。5.权利要求3的组合物，其中所述炎性疾病是骨关节炎或类风湿性关节炎。6.黄芩提取物和茶树提取物制备用于预防或治疗由C0X和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的用途。7.权利要求6的用途，其中所述由C0X和/或5-L0介导的生理性和病理性病症选自炎性疾病、月经痛、动脉硬化、心脏病发作、肥胖症、糖尿病、X综合征、认知功能的疾病、老年痴呆症、呼吸系统变应性反应、慢性静脉功能不全、痔疮、系统性红斑狼疮、牛皮癣、慢性紧张性头痛、偏头痛、炎性肠病、由病毒、细菌和孢子引起的局部感染、晒伤、烧伤、接触传染性皮炎、黑色素瘤和癌症。8.权利要求7的用途，其中所述由C0X和/或5-L0介导的生理性和病理性病症是炎性疾病。9.权利要求6的用途，其中用一种或多种选自水、丙酮、或C卜4醇和异丙醇的极性溶剂提取所述提取物。10.权利要求6的用途，其中黄芩茶树的重量比是o.iio:o.iio。11.权利要求8的用途，其中所述炎性疾病是骨关节炎或类风湿性关节炎。12.制备用于预防或治疗由C0X和/或5-L0介导的生理性和病理性病症的药物的方法，通过将黄吝提取物和茶树提取物以o.iio:o.iio的重量比混合来进行配制。全文摘要本发明涉及用于预防或治疗由环加氧酶(COX)和/或5-脂氧化合酶(5-LO)介导的生理性和病理性病症的、包含钩藤属植物，特别是黑儿茶，或其提取物的组合物，和涉及所述钩藤属植物提取物和黄芩提取物和/或茶树提取物的联合组合物。本发明组合物显示优良的COX和/或5-LO抑制作用，从而可用于预防或治疗由不同的COX途径和/或5-LO途径介导的疾病和病症，包括骨关节炎和类风湿性关节炎。文档编号A61P9/10GK101785803SQ201010115849公开日2010年7月28日申请日期2005年9月1日优先权日2004年9月1日发明者成喜善,李映澈,禹盛植,赵台衡,车智敏,都善吉,金东善,金泰佑,金种汉申请人:株式会社优力竟