专利名称：重组人fshr-57多肽蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程领域，具体涉及一种用于男性避孕的重组人FSHR-57多肽蛋白 及其制备方法和药学应用。
背景技术：
随着世界人口的迅速增长，人口控制的任务更为艰巨，但以往大部分责任由女性 承担，社会的发展更需要男性发挥积极的作用。研发中的男用避孕药分为激素类避孕药和非激素类避孕药(外用杀精子剂、中草 药以及避孕疫苗)。但男性激素避孕药无论是单独使用还是联合使用，都还有许多不尽人 意之处有待完善。各类非激素类避孕药也存在不足杀精子剂易出现过敏反应，且单独使用 效果不理想；中草药类毒副作用大，成分复杂且机理尚不明确，目前仅用于动物实验。男性 避孕方法面临“可靠方法不可逆，可逆方法不可靠”的尴尬局面，至今尚无一种真正可用于 临床的安全、长效、可逆的方法问世。在避孕机制和安全性评价等方面也缺乏深入系统的研 允。至20世纪中叶，随着免疫学与分子生物学的迅速发展以及控制世界人口的需要， 避孕疫苗研究开始了引人注目的进展。经过数十年的动物实验以及少量的临床观察，证明 这种方法具有经济、简便、失败率低、安全可靠、相对长效、可逆、无需使用工具及外源激素 等优点，已成为当今发展中国家乃至发达国家计划生育研究课题中极具吸引力的选择目标 之一。避孕疫苗的基本原理就是应用机体自身的免疫防御机制来产生一个对抗计划外妊娠 的反应，具体地说，就是使用生殖过程中有关的抗原成分制成避孕疫苗，诱导受者产生相应 的体液或细胞免疫应答，从而阻抑受孕。卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)由 669 个氛 基酸组成，存在于人和哺乳动物的睾丸支持细胞和卵泡颗粒细胞，可通过介导FSH的信号 影响雄性青春期生精启动、成年期生精过程和雌性卵细胞各阶段的发育。FSHR基因敲除的 雄性小鼠可引起生精障碍及生育力下降。因其在生殖中的重要作用，FSHR已成为男性避孕 疫苗的候选靶标。本专利申请者在猕猴研究中发现FSHR的特定序列(N端57氨基酸)多肽 蛋白可有效的产生较高滴度的抗体，且未发现其对激素水平有副作用，可望成为一种安全、 有效、可逆的男性避孕疫苗。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种重组人FSHR-57多肽蛋白及其制备方法和该 多肽在男性避孕疫苗上应用。本发明提出的FSHR-57多肽疫苗，利用原核表达系统表达重组人FSHR 1-57位氨 基酸的多肽疫苗，运用切胶回收技术纯化该蛋白，结合透析复性恢复蛋白的活性和结构。技术方案重组人FSHR-57多肽蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所述。重组人FSHR-57多肽蛋白的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所述。
3
上述cDNA的表达载体。上述 cDNA 的表达载体为 pET-28a (+) -FSHR57。制备重组人FSHR-57多肽蛋白的方法，包括用pET_28a (+)-FSHR57转化寄主细胞， 培养转化体，获得重组人FSHR-57。寄主细胞是大肠杆菌。上述所得到的重组人FSHR-57多肽蛋白在制备男性避孕疫苗中的应用。有益效果本发明是一种男性抗生育的多肽疫苗及其制备方法，该多肽疫苗选取 了卵泡刺激素受体(FSHR)N端57位氨基酸，含B细胞表位且有效避免与黄体生成素受体 (LHR)、甲状腺刺激素(TSHR)的交叉反应。运用原核表达、结合切胶纯化及梯度透析复性的 方法,制备出高纯度的FSHR-57蛋白多肽，经Non-reduced PAGE+ffestern blot, HPLC及质 谱氨基酸测序鉴定，确认该方法制备的蛋白多肽准确无误且纯度高于97%。FSHR-57蛋白 多肽安全性好，不干扰睾酮及雌二醇等性激素的水平，具较强的免疫原性，可以成为男性避 孕疫苗的候选。
四
图1，FSHR表位预测图(箭头所指部分为位于膜外氨基端抗原指数最高的一段序 列)，提示N端57氨基酸区域含B细胞表位，适合制备多肽疫苗。图2，重组质粒 pET_28a (+) -FSHR PCR 验证图；图3，重组质粒pET-28a(+)_FSHR测序结果图；图4，FSHR-57蛋白切胶纯化电泳分析图；图5，FSHR-57蛋白的非还原SDS-PAGE结合免疫印记(WB)结果；图 6，FSHR-57 蛋白的 HPLC 结果Signal 1 :DAD1 B, Sig = 214，8 Ref = 500，100Peak RetTime Type Width AreaHeight Area# [min][min] [mAU 女 s] [mAU]%----1 ——|-—-1-------1----------1----------1--------11 24.845 MM T 0. 2844 718. 78131 33.44695 2.64722 26. 102 MM R 2.8547 2.64334e4 154. 32512 97. 3528结合上表，提示其纯度超过97% ;图7，FSHR-57蛋白的二级结构鉴定结果显示该蛋白具有正确的空间折叠；图8，二维电泳结果显示FSHR-57蛋白分子量为7420. 58Da，等电点为8. 3。图9，FSHR-57免疫雄猴后血清抗FSHR滴度变化，提示其具很好的免疫原性；图10，免疫的FSHR-57蛋白后，血清睾酮的水平未受影响(横轴代表采血时间，纵 轴代表激素浓度)；图11，免疫的FSHR-57蛋白后，血清雌二醇的水平未受影响(横轴代表采血时间， 纵轴代表激素浓度)；图12，大鼠颗粒细胞与猴血清抗FSHR抗体的体外结合实验方法建立。如图大鼠颗 粒细胞与猴抗FSHR抗体结合后被荧光标记。图13，猴血清抗FSHR抗体与颗粒细胞天然的FSHR体外结合，免疫组平均荧光强度 值(X轴面积总和)显著增高。
图14，FSHR-57蛋白制备的工艺流程。
五具体实施例方式实施例1 1.确定作为疫苗抗原的FSHR-57蛋白的有效表位通过DNAStar Protein软件预测FSHR的抗原表位(图1)；同时，FSHR-57多肽与 LHR及TSHR氨基端序列的同源性比对，提示该区域与LHR和TSHR同源度低，可避免FSHR与 LHR及TSHR的交叉反应性；创新性的选择了 FSHR N端57个氨基酸(l_57aa)作为目的片 段，核苷酸序列和相应的多肽序列如下所示。FSHR-57蛋白的核苷酸序列如下TGTCATCATCGGATCTGTCACTGCTCTAACAGGGTTTTTCTCTGCCAAGAGAGCAAGGTGACAGAGAT TCCTTCTGACCTCCCGAGGAATGCCATTGAACTGAGGTTTGTCCTCACCAAGCTTCGAGTCATCCAAAAAGGTGCA TTTTCAGGATTTGGGGACCTGGAGAAAFSHR-57蛋白多肽的氨基酸序列如下CHHRICHCSNRVFLCQESKVTEIPSDLPRNAIELRFVLTKLRVIQKGAFSGF⑶LEK2. FSHR-57蛋白的制备(1)构建FSHR-57蛋白的原核表达载体从人睾丸cDNA文库中用PCR技术扩增得到FSHR 5’端171bp的核酸序列(对应 FSHR N端57aa)，克隆到pET-28a(+)质粒中，构建pET_28a (+)-FSHR57的重组蛋白表达质 粒，PCR筛选阳性克隆(图2)并经DNA测序(图3)，证明质粒中插入正确的FSHR57aa的序 列。(2)根据附录工艺流程(图14)表达FSHR-57多肽蛋白。1)将构建好的 pET-28a(+)_FSHR57aa 质粒转化 BL21Star (DE3)菌，37°C，IPTG 诱 导FSHR-57蛋白表达，超声破碎后，经SDS-PAGE电泳分析FSHR-57蛋白表达的粗品(图4，左)。2)经过五次洗涤去除部分杂蛋白(前4次用正常洗涤Buffer洗涤，最后一次用 含4M尿素的洗涤Buffer进行洗涤)，采用切胶纯化，获得FSHR-57蛋白纯化后产物(图4， 右)。具体步骤切取含目的蛋白的胶条，装入约含3. 5mL电泳液的透析袋，150V，4°C水平电 泳2h，然后反电极电泳5min，收集透析袋中的缓冲液，即为目的蛋白；重复1次，得到约7mL 蛋白样品。3)进一步通过透析复性，恢复FSHR-57蛋白多肽的空间结构和生物活性。具体步 骤前5次每隔lh更换一半体积的缓冲液，随后每隔lh更换全部缓冲液，更换2次，最后透 析过夜，第2天继续每隔lh更换全部缓冲液2次，室温平衡2h，收集复性蛋白，0. 22um滤膜 过滤除菌，分装，待SDS-PAGE分析。3.制备的FSHR-57蛋白的质量鉴定1)以上方案制备的FSHR-57蛋白，通过非还原SDS-PAGE胶结合免疫印迹法检测特 异性(图5)、HPLC鉴定蛋白质纯度(图6)，证实FSHR-57蛋白的纯度超过97%。2)以上方案制备的FSHR-57蛋白的理化性质鉴定(N端氨基酸组成分析、二级结 构、分子量和等电点)，证实表达的目的蛋白确实为结构正确的FSHR-57蛋白质谱法测定N段氨基酸序列后，加入铝佐剂制成疫苗。a.氨基酸组成分析结果N 端 15 个氨基酸 NH2-G-C-H-H-R-I-C-H-C-S-N-R-V-F-L 完全符合FSHR-57蛋白的序列，如下表所示。
样品名称AG2批号2009-AG2-0001样品状态液体客户估计分子量约7KD测试仪器型号HITACHI仪器公司HITACHI 公司测试结果氨基酸mg/100g■酸mg/100g天冬Asp3.86酪Tyr0.75谷Glu6.39缬Val2.99丝Ser3.04曱為t Met0.00甘Gly2.54胱Cys0.00组His9.34异亮lie3.47精Arg6.25亮Leu6.09苏Thr1.77苯丙Phe5.46丙Ala1.61赖Lys4.60脯Pro1.65氨nh3(1.63)备注说明样品经过6M HC1 110X水解18小时b. 二级结构鉴定显示FSHR-57蛋白具有正确的空间折叠(图7)。c.分子量测定结果二维电泳结果显示FSHR-57蛋白分子量为7420. 58Da (图8)。d.等电点测定二维电泳的结果显示FSHR-57蛋白的等电点为8. 3 (图8)。4.制备的FSHR-57蛋白的药效学1)制备的FSHR-57蛋白免疫6只雄猴，证实该蛋白具很好的免疫原性。取上述通过鉴定的？5111 -57蛋白，2.5 1体积比配伍铝佐剂，每两周一次免疫6 只雄猴，免疫抗原剂量为200 u g每次每只雄猴，FSHR-57蛋白多肽免疫组血清滴度变化如 图9所示，免疫后滴度上升，6只均阳转，第八次免疫进入平台期。2)免疫的FSHR-57蛋白后，不影响雄猴的性激素。我们对免疫和对照组每只雄猴每隔4周采早晚8点的静脉血用电化学发光的方法 测定血清睾酮(图10)和雌二醇(图11)。结果显示，睾酮和雌二醇水平在整个实验猴群个 体间以及同一个体不同时间点间波动都较大，组间血清睾酮和雌二醇水平未见显著性差异 (横轴代表采血时间，纵轴代表激素浓度)。3)免疫的FSHR-57蛋白后，FSHR-57体外结合实验评价药效学。对照组(0329. 001)和FSHR-57免疫组(0329. 002)猴血清，检测血清中抗FSHR抗 体与原代大鼠颗粒细胞(含FSH天然受体)的结合力(图12)，从而推测FSHR-57的药效 学。结果显示免疫组血清结合的颗粒细胞平均荧光强度(图13，0329. 002)较之对照组颗 粒细胞平均荧光强度值(图13，0329. 001)显著增高，比值> 2，说明实验组猴血清中产生有 效的抗FSHR抗体。
权利要求
重组人FSHR-57多肽蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID No.1所述。
2.重组人FSHR-57多肽蛋白的cDNA，其特征在于它的核苷酸序列如SEQID No. 2所述。
3.权利要求2所述cDNA的表达载体。
4.权利要求2所述cDNA的表达载体pET-28a(+) -FSHR57。
5.制备重组人FSHR-57多肽蛋白的方法，其特征在于包括用pET-28a(+)-FSHR57转化 寄主细胞，培养转化体，获得重组人FSHR-57。
6.根据权利要求5所述的制备重组人FSHR-57多肽蛋白的方法，其特征在于寄主细胞 是大肠杆菌。
7.上述任一权利要求所得到的重组人FSHR-57多肽蛋白在制备男性避孕疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种重组人FSHR-57多肽蛋白及其制备方法和应用，该多肽疫苗选取了卵泡刺激素受体(FSHR)N端57位氨基酸，含B细胞表位且有效避免与黄体生成素受体(LHR)、甲状腺刺激素(TSHR)的交叉反应。运用原核表达、结合切胶纯化及梯度透析复性的方法，制备出高纯度的FSHR-57蛋白多肽，经Non-reduced PAGE+Western blot，HPLC及质谱氨基酸测序鉴定，确认该方法制备的蛋白多肽准确无误且纯度高于97％。FSHR-57蛋白多肽安全性好，不干扰睾酮及雌二醇等性激素的水平，具较强的免疫原性，可以成为男性避孕疫苗的候选。
文档编号A61P15/16GK101863973SQ20101017952
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者夏彦恺, 李迎春, 杨骅, 王守林, 王心如, 顾爱华, 龙燕 申请人:南京医科大学