专利名称：一种肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及核磁共振造影剂，具体涉及一种肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂及其制备方法，尤其是一种多肽修饰的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂及其制备方法。
背景技术：
对肿瘤采用核磁共振造影诊断以及研究高效的造影剂是近年来引人注目的热点。 目前临床上使用的造影剂多为亲水的小分子，不能进入细胞，往往通过血管内皮空隙停留在组织间隙和血管内空腔，清除很快，不能长时间显像；并且由于缺乏特异性的输送，仅靠血管间隙渗透进入组织，导致造影剂蓄积在炎症部位，容易造成对炎症的误诊。目前市场上销售的造影剂钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)，尚存在稳定性问题，常对机体正常器官如肾等造成非常大的损害；此外，钆喷酸葡胺的弛豫率较低，需要提高磁场强度，这也增加了患者诊断时的危险。因此，提供高效的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，有效专一地将造影剂运输到肿瘤部位并进入细胞，长时间高效地对肿瘤组织显像，同时减少全身毒副作用，是目前肿瘤诊断的关键。树枝状高分子材料如聚酰胺一胺树状分枝物(polyamidoamine，简称PAMAM)和聚赖氨酸(dendri-graft polylysines，简称DGL)是近年来出现的一类新型纳米级的合成高分子，高度分枝，呈单分散性，其末端氨基丰富，并易于经过适当的修饰连接靶向头基等生物活性物质。有研究发现这类新型的纳米级的树枝状高分子可与二乙三胺五乙酸(DTPA)连接进而螯合钆离子(Gd3+)，大幅提高造影剂的弛豫率和显像效果。主动靶向是构建靶向递释系统的一个主要策略，利用特定的头基修饰系统，特异性结合特定细胞表面过度表达的受体以达到靶向输送的作用。有研究显示，肿瘤细胞表面过度表达一系列受体，其中转铁蛋白(transferrin，简称为Tf)受体被用作靶点已有较长的研究历史。但是，内源性转铁蛋白浓度很高，约为25 mM，可与以Tf作为靶向头基的给药系统竞争肿瘤细胞表面的Tf受体，从而影响肿瘤靶向效率。近期医学研究使用噬菌体展示技术筛选出一种新型多肽——T7肽，其序列为HAIYPRHJf Tf受体的亲和力和Tf相当；T7 肽与Tf受体的结合位点与Tf不同，不会与Tf竞争抑制且不影响Tf本身的生理功能，相反 Tf与Tf受体的结合会促进T7肽的入胞效率。迄今，尚未见有关多肽修饰的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷和不足，提供一种肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂及其制备方法，具体是提供一种多肽修饰的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂。本发明通过多肽修饰高分子材料，以多肽为靶向头基，树枝状高分子材料为基础高分子载体，表面连接小分子造影剂，制成肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂。该造影剂以内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对造影剂的摄取，并且安全。
具体而言，本发明的一种肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，其由高分子材料、聚乙二醇、多肽、双功能配体和三氯化钆制成。本发明中，所述高分子材料与聚乙二醇的分子比为1:2 1:10 ；高分子材料与多肽的分子比为1:1 1:5 ；高分子材料与双功能配体的分子比为1:236 1:256 ；高分子材料与三氯化钆的分子比为1:236 1:1416。本发明中，高分子材料为树枝状，其内部有空腔；本发明的一个实施例中选用的高分子材料为聚酰胺-胺型树状分枝物和聚赖氨酸。本发明中，所述的载体系统采用多肽修饰高分子材料形成纳米粒；所述的多肽 (T7)其氨基酸序列为HAIYPRH，该多肽通过噬菌体展示技术筛选得到。本发明中，所述的聚乙二醇选自马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺 (MAL-PEG3500-NHS)；
本发明中，所述的双功能配体包括双功能二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-DTPA )、 p-SCN-Bn-DOTA, p-SCN-Bn-NOTA, p-SCN-Bn-oxo-D03A 或 p-SCN-Bn-PCTA ； 本发明中，所述的螯合离子为三氯化钆(GdCl3)。本发明提供了肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，其包括步骤
步骤1 将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干， 称取适量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料比例为1:2 1:10，一定温度下搅拌反应数小时即可；
步骤2:将多肽溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，与高分子材料比例1:1 1:5，一定温度下反应对h，制得肿瘤靶向纳米载体，转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG和 T7肽，pH值9. 0的磷酸盐缓冲液复溶；
步骤3 将上述步骤2制得的多肽溶液与双功能配体按1:2361:256的比例混合，在室温条件下搅拌反应48 h，转移到MWCO 3000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未连接的双功能配体，PH值6. 0的乙酸盐缓冲液复溶；
步骤4 将上述步骤3制得的多肽溶液与螯合离子按1 236^1 1416的比例混合，在4 °C 条件下反应M h，转移到MWCO 3000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未螯合的钆离子，制得肿瘤靶向核磁共振造影剂。
本发明的优点是利用可特异性结合肿瘤细胞表面Tf受体的多肽T7肽修饰高分子材料，连接造影剂制成肿瘤靶向核磁共振造影剂，使造影剂的分布具有了 T7肽的肿瘤靶向特征和细胞摄取特征，提高肿瘤细胞的摄取效率和肿瘤的诊断效率；本肿瘤靶向核磁共振造影剂，具有Tf作为靶向头基的特点，能有效避免内源性Tf的干扰，靶向和诊断效率高，适用于靶向人体来源和动物来源的肿瘤细胞及其它肿瘤细胞。
图1是氢核磁共振表征肿瘤靶向纳米载体PAMAM-PEG-T7。图2是氢核磁共振表征肿瘤靶向造影剂中间体DTPA-PAMAM-PEG-T7。
图3是核磁共振造影剂体外溶血情况比较。图4是核磁共振造影剂体外弛豫率比较，斜率代表弛豫率，斜率越大，弛豫率越大。图5是人肿瘤细胞Bel-7402对造影剂载体的摄取情况，细胞培养于M孔板，待密度达到8(Γ90%时，孵育绿色荧光探针BODIPY标记的载体30 min,吸去药液，缓冲液清洗， OLYMPUS IX 71荧光显微镜观察并拍照
其中，A 和 D 是 PAMAM，B 禾口 E 是 PAMAM-PEG, C 禾口 F 是 PAMAM-PEG-T7，G 禾口 J 是 Tf+PAMAM, H 和 K 是 Tf+PAMAM-PEG, I 和 L 是 Tf+PAMAM_PEG_T7。图6是大鼠胶质瘤细胞C6对造影剂载体的摄取情况，细胞培养于M孔板，待密度达到8(Γ90%时，孵育绿色荧光探针BODIPY标记的载体30 min,吸去药液，缓冲液清洗， OLYMPUS IX 71荧光显微镜观察并拍照
其中，A 和 D 是 PAMAM，B 禾口 E 是 PAMAM-PEG, C 禾口 F 是 PAMAM-PEG-T7，G 禾口 J 是 Tf+PAMAM, H 禾口 K 是 Tf+PAMAM-PEG, I 禾口 L· 是 Tf+PAMAM_PEG_T7。图7是人肿瘤细胞Bel-7402皮下移植裸鼠模型尾静脉给予红色荧光探针BODIPY 标记的载体，不同时间CRI活体成像观察各载体的体内分布情况。 图8是大鼠胶质瘤细胞C6颅内原位裸鼠模型尾静脉给予红色荧光探针BODIPY标记的载体，不同时间CRI活体成像观察各载体的体内分布情况。图9是采用Bruker Biospec 4. 7 T/30 cm Scanner观察核磁共振造影剂尾静脉注射后不同时间对人肿瘤细胞Bel-7402皮下移植瘤(A)和大鼠胶质瘤细胞C6颅内原位瘤 (B)的诊断情况。
具体实施例方式实施例1
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为 1 10， 于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1:5，室温搅拌反应M h，MAL基团与T7肽半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的T7肽，核磁共振氢谱表征靶向载体的合成。实施例2
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为 1 10， 于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 9. 0磷酸盐缓冲液复溶，与13. 4 mg双功能靶向配体二乙三胺五乙酸 (ρ-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1 236，室温搅拌反应48 h， SCN基团与PAMAM表面的氨基发生特异性的反应，得到核磁共振造影剂中间体，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的双功能配体，核磁共振氢谱表征载体上螯合配体的连接效率。实施例3
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为 1 10， 于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 9. 0磷酸盐缓冲液复溶，与13. 4 mg双功能靶向配体二乙三胺五乙酸 (ρ-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1 236，室温搅拌反应48 h， SCN基团与PAMAM表面的氨基发生特异性的反应，得到核磁共振造影剂中间体，MWCO 5000 超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的双功能配体，pH 6. 0乙酸盐缓冲液复溶，与三氯化钆(GdCl3,100 mg/ml pH 6. 0乙酸盐溶液)，摩尔比例为1 236，4 °C反应24 h,MWC0 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的三氯化钆，pH 7. 4生理磷酸盐缓冲液溶解，制成非靶向核磁共振造影剂，采用电感耦合等离子体原子发射光谱表征钆的螯合效率。实施例4
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为 1 10， 于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 9. 0磷酸盐缓冲液复溶，与13. 4 mg双功能靶向配体二乙三胺五乙酸 (p-SCN-Bn-DTPA, 4 mg/ml pH 9. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1 236，室温搅拌反应48 h， SCN基团与PAMAM表面的氨基发生特异性的反应，得到核磁共振造影剂中间体，MWCO 5000 超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的双功能配体，pH 6. 0乙酸盐缓冲液复溶，与三氯化钆(GdCl3,100 mg/ml pH 6. 0乙酸盐溶液)，摩尔比例为1 236，4 °C反应24 h,MWC0 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的三氯化钆，pH 7. 4生理磷酸盐缓冲液溶解，制成非靶向核磁共振造影剂。实施例5
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为 1 10， 于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1:5，室温搅拌反应M h，MAL基团与T7肽半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的T7肽，pH 9. 0磷酸盐缓冲液复溶，与13. 4 mg 双功能靶向配体二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1:236，室温搅拌反应48 h，SCN基团与PAMAM表面的氨基发生特异性的反应，得到核磁共振造影剂中间体，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的双功
6能配体，PH 6.0乙酸盐缓冲液复溶，与三氯化钆(GdCl3,100 mg/ml pH 6.0乙酸盐溶液)，摩尔比例为1:236，4 °C反应M h, MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的三氯化钆，pH 7. 4生理磷酸盐缓冲液溶解，制成靶向核磁共振造影剂。实施例6
制成靶向核磁共振造影剂和非靶向核磁共振造影剂，采用市售的钆喷酸葡胺作为对照，将各组造影剂稀释成 0,2. 52,5. 03、10. 1,25. 2、50. 3、100. 7、503 μ g 6(1/1111，与觊红细胞混悬液37 °C孵育1 h，测定溶血情况。实施例7
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. 35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，加入3. 64 mg聚乙二醇(MAL-PEG;3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为 1 10， 于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGiq)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 7.0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1:5，室温搅拌反应M h，MAL基团与T7肽半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的T7肽，pH 9. 0磷酸盐缓冲液复溶，与13. 4 mg 双功能靶向配体二乙三胺五乙酸(P-SCN-Bn-DTPA，4 mg/ml pH 9. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1:236，室温搅拌反应48 h，SCN基团与PAMAM表面的氨基发生特异性的反应，得到核磁共振造影剂中间体，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的双功能配体，PH 6.0乙酸盐缓冲液复溶，与三氯化钆(GdCl3,100 mg/ml pH 6.0乙酸盐溶液)，摩尔比例为1:236，4 °C反应M h, MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的三氯化钆，PH 7. 4生理磷酸盐缓冲液溶解，制成靶向核磁共振造影剂。将靶向核磁共振造影剂和市售的钆喷酸葡胺稀释分别稀释成一系列浓度，采用Bruker Biospec 4.7 T / 30 cm farmer测定造影剂的弛豫率。实施例8
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，600 μ 1 100 mM 碳酸氢钠溶液溶解，加入绿色荧光探针(B0DIPY，0. 56 mg 600 μ 1 DMSO溶液)，摩尔比例为1:10，4 °C反应12 h，得到绿荧光标记非靶向载体。实施例9
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，600 μ 1 100 mM 碳酸氢钠溶液溶解，加入绿色荧光探针(B0DIPY，0. 56 mg 600 μ 1 DMSO溶液)，摩尔比例 % 1:10,4。C 反应 12 h，加入 3. 64 mg 聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8.0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1:10，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，得到绿荧光标记非靶向载体。实施例10
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，600 μ 1 100 mM 碳酸氢钠溶液溶解，加入绿色荧光探针(B0DIPY，0. 56 mg 600 μ 1 DMSO溶液)，摩尔比例 % 1:10,4。C 反应 12 h，加入 3. 64 mg 聚乙二醇(MAL-PEG3500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH8.0磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1:10，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1 5，室温搅拌反应M h，MAL基团与T7 肽半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成率荧光标记的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG-T7)复合物，丽CO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的T7肽，得到绿荧光标记靶向载体。实施例11
绿荧光标记的非靶向载体和靶向载体分别用缓冲液稀释至适当浓度。人肿瘤Bel-7402 细胞培养于M孔板，待密度达到80、0%时，孵育绿色荧光探针BODIPY标记的载体30 min, 吸去药液，缓冲液清洗，OLYMPUS IX 71荧光显微镜观察并拍照，观察造影剂载体的摄取情况。实施例12
绿荧光标记的非靶向载体和靶向载体分别用缓冲液稀释至适当浓度。大鼠胶质瘤C6 细胞培养于M孔板，待密度达到80、0%时，孵育绿色荧光探针BODIPY标记的载体30 min, 吸去药液，缓冲液清洗，OLYMPUS IX 71荧光显微镜观察并拍照，观察造影剂载体的摄取情况。实施例13
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，300 μ 1 100 mM 碳酸氢钠溶液溶解，加入红色荧光探针(B0DIPY，0.67 mg 67 μ 1 DMSO溶液)，摩尔比例为 1:10，室温反应1 h，得到红荧光标记非靶向载体。实施例14
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，300 μ 1 100 mM 碳酸氢钠溶液溶解，加入红色荧光探针(B0DIPY，0.67 mg 67 μ 1 DMSO溶液)，摩尔比例为 1:10,室温反应 1 h，加入 3.64 mg 聚乙二醇(MAL_PEG;B500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1:10，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，得到红荧光标记非靶向载体。实施例15
取3 mg聚酰胺-胺(PAMAM，77. ；35 mg/ml甲醇溶液)于西林瓶中吹干，300 μ 1 100 mM 碳酸氢钠溶液溶解，加入红色荧光探针(B0DIPY，0.67 mg 67 μ 1 DMSO溶液)，摩尔比例为 1:10,室温反应 1 h，加入 3.64 mg 聚乙二醇(MAL_PEG;B500-NHS，1 mg/ml 0. 035 M pH 8. 0 磷酸盐溶液)，二者摩尔比例为1:10，于室温搅拌反应2 h，NHS基团与PAMAM表面的氨基特异性的反应，制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEGici)复合物溶液，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG，pH 7. 0磷酸盐缓冲液复溶，加入0.52 mg T7肽(2 mg/ml pH 7. 0磷酸盐溶液)，摩尔比例为1 5，室温搅拌反应M h，MAL基团与T7肽半胱氨酸残基上巯基发生特异性的反应，制成率荧光标记的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽 (PAMAM-PEG-T7)复合物，MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的 T7肽，得到红荧光标记靶向载体。
实施例16
人肿瘤细胞Bel-7402皮下移植裸鼠模型尾静脉给予红色荧光探针BODIPY标记的载体，不同时间CRI活体成像观察各载体的体内分布情况。实施例17
大鼠胶质瘤细胞C6颅内原位裸鼠模型尾静脉给予红色荧光探针BODIPY标记的载体， 不同时间CRI活体成像观察各载体的体内分布情况。实施例18
采用Bruker Biospec 4. 7 T / 30 cm scanner观察肿瘤靶向核磁共振造影剂尾静脉注射后不同时间对人肿瘤细胞Bel-7402皮下移植瘤的诊断情况。非靶向核磁共振造影剂和市售核磁共振造影剂钆喷酸葡胺作为对照。实施例19
采用Bruker Biospec 4. 7 T / 30 cm scanner观察肿瘤靶向核磁共振造影剂尾静脉注射后不同时间对大鼠胶质瘤细胞C6颅内原位移植瘤的诊断情况。非靶向核磁共振造影剂和市售核磁共振造影剂钆喷酸葡胺作为对照。
本发明的实验结果显示利用可特异性结合肿瘤细胞表面Tf受体的多肽T7肽修饰高分子材料，连接造影剂制成肿瘤靶向核磁共振造影剂，使造影剂的分布具有肿瘤靶向特征和细胞摄取特征，能提高肿瘤细胞的摄取效率和肿瘤的诊断效率；具有Tf作为靶向头基的特点，能有效避免内源性Tf的干扰，靶向和诊断效率高，适用于靶向人体来源和动物来源的肿瘤细胞及其它肿瘤细胞。
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权利要求
1.一种肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、多肽、双功能配体和三氯化钆制成；所述高分子材料与聚乙二醇的分子比为1:2 1:10 ；高分子材料与多肽的分子比为 1:1 1:5 ；高分子材料与双功能配体的分子比为1:236 1:256 ；高分子材料与三氯化钆的分子比为1:236 1:1416。
2.按权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，所述的载体系统采用多肽修饰树枝状高分子材料形成纳米粒。
3.按权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，所述的高分子材料为聚酰胺-胺型树状分枝物和聚赖氨酸。
4.按权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，所述的高分子材料为树枝状，其内部有空腔。
5.按权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，所述的聚乙二醇选自马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺。
6.按权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，所述的多肽其氨基酸序列为HAIYPRH。
7.按权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，所述的双功能配体选自双功能二乙三胺五乙酸、p-SCN-Bn-DOTA, p-SCN-Bn-NOTA, p-SCN-Bn-oxo-D03A 或 P-SCN-Bn-PCTA0
8.按权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂，其特征在于，所述的多肽特异性结合转铁蛋白受体。
9.权利要求1所述的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂在用于摄取人体来源和动物来源的肿瘤细胞及其它癌细胞中的用途。
10.权利要求1的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，其包括步骤步骤1 将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干， 称取适量的聚乙二醇溶解到PH值7. 8 8. 2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料比例为1:2 1:10，一定温度下搅拌反应数小时即可；步骤2 将多肽溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽溶液，加入到高分子一聚乙二醇溶液中，与高分子材料比例1:1 1:5，一定温度下反应对h，制得肿瘤靶向纳米载体，转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未反应的PEG和 T7肽，pH值9. 0的磷酸盐缓冲液复溶；步骤3 将上述步骤2制得的多肽溶液与双功能配体按1:2361:256的比例混合，在室温条件下搅拌反应48 h，转移到MWCO 3000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未连接的双功能配体，PH值6. 0的乙酸盐缓冲液复溶；步骤4 将上述步骤3制得的多肽溶液与螯合离子按1:2361:1416的比例混合，在4 0C 条件下反应M h，转移到MWCO 3000超滤离心管中以12000 rpm超滤30 min去除未螯合的钆离子，制得肿瘤靶向核磁共振造影剂。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种多肽修饰的肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂及其制备方法。本发明采用高分子材料、聚乙二醇、多肽、双功能配体和三氯化钆，以多肽为靶向头基，树枝状高分子材料为基础高分子载体，表面连接小分子造影剂，制成肿瘤靶向诊断核磁共振造影剂。本发明通过噬菌体展示技术筛选出的多肽修饰高分子材料，以内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对造影剂的摄取，并且具有安全性高的特点。本发明使用的靶向头基多肽具有转铁蛋白的优点，并且可有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和诊断效率高、制备简捷，可进一步应用于其它肿瘤组织的靶向诊断。
文档编号A61K49/12GK102397564SQ201010286508
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者蒋晨, 韩亮, 黄容琴 申请人:复旦大学