专利名称：一种复方扶芳藤制剂的指纹图谱检测方法
技术领域：
本发明涉及一种中药复方扶芳藤制剂的指纹图谱检测方法，属于复方中药制剂的 分析检测领域。
背景技术：
复方扶芳藤制剂是由扶芳藤、黄芪、红参(或人参)三味中药经适宜的加工、提取 而制成的复方制剂，具益气补血、健脾养心的功效，具有补血、抗疲劳、提高机体免疫等作 用，特别适用于气血亏虚，精力不足，失眠多梦，神经衰弱等患者。目前采用的质量控制方 法是按照《中国药典》2005年版一部收载的复方扶芳藤合剂的质量标准进行。现行质量标 准中除有TLC鉴别外，只有一个薄层色谱扫描的含量测定项目，用于测定制剂中黄芪甲苷 的含量；显然现有的质量控制方法未能达到全面控制产品质量的目的。在我们的前期研究 工作中，曾采用标准加入法测定了复方扶芳藤合剂中的人参皂苷Rgl和Rbl的含量；应用 RP-HPLC-UV方法建立了复方扶芳藤合剂的HPLC-UV指纹图谱分析方法及HPLC-UV指纹图 谱共有模式；并有用HPLC-ELSD法测定复方扶芳藤合剂中黄芪甲苷含量的报道。从目前已 经建立的复方扶芳藤制剂的质量控制方法来看，这些方法主要是采用高效液相色谱一紫外 吸收检测(HPLC-UV)的方法进行，而制剂中主要药效成分为皂苷类及糖醇类成分，这些成 分在紫外区并无明显的吸收，因而影响了分析方法的专属性和灵敏度。高效液相色谱一蒸 发光散射检测(HPLC-ELSD)技术是上世纪90年代发展起来一种分析检测技术，该技术在分 离测定无明显紫外吸收的成分方面具有独特的优势。复方扶芳藤制剂具有补益气血、健脾 养心的功效，此功效与该制剂组方中黄芪、红参(或人参)中的皂苷类成分密切相关。现代 药理学研究表明，黄芪皂苷可减轻实验性缺氧复氧对培养的心肌细胞的损伤、保护心肌细 胞膜、减少心肌酶的漏出、减轻脂质过氧化和清除氧自由基的作用，在中等剂量和大剂量时 可使衰竭心脏的心功能各项指标明显改善，具有抗心力衰竭作用。据文献报道，人参及其皂 苷Rgl、Rb1等具有抗心律失常、抗心肌肥大、改善心肌缺血及抗衰老、抗脂质过氧化，促进蛋 白质合成、选择性增强大鼠的免疫功能，加强机体对有害因素的抵抗力等作用。虽然目前已 有一些复方扶芳藤制剂中黄芪甲苷的HPLC-ELSD含量测定方法的报道，但这些方法仅能测 定少量个别成分，无法全面控制复方扶芳藤制剂的质量。近年来，指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效的手段， 在一定程度上可较全面地控制药品的质量。建立中药指纹图谱质量标准，是将现代分析科 学的优秀成果与中医药整体综合观的有机融合，可以更有效地运用全面质量管理的理念， 是一种充分利用现代科学技术手段所能达到的最好表现中药复杂体系特性的方法。虽然曾 有应用高效液相色谱一紫外吸收检测(HPLC-UV)指纹图谱用于复方扶芳藤合剂质量控制 的研究报道，但由于紫外吸收检测器对皂苷类成分吸收很差，所以该法测得的指纹图谱中 如黄芪甲苷、人参皂苷Rb1等主要皂苷类成分的特征峰均未能在图谱中显示出来，因而仍无 法达到较全面控制产品质量的目的。
发明内容
本发明的解决方案是提供一种对皂苷类成分有更好检测效果的复方扶芳藤制剂 中主要皂苷成分的HPLC-ELSD指纹图谱检查方法，该法既具有定性的作用(通过指纹峰 位)，又有一定的定量作用(通过相关峰面积)，并可克服HPLC-UV对皂苷类成分检测灵敏 度不高的缺点，按此方法测定的指纹图谱重复性高，既可作为复方扶芳藤制剂中主要皂苷 成分的检查和鉴定方法，也可用于制剂中黄芪甲苷、人参皂苷Rbl的含量测定。可更全面地 控制复方扶芳藤制剂的质量。本发明复方扶芳藤制剂HPLC-ELSD指纹图谱的测定包括以下步骤1.对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rbl和黄芪甲苷对 照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制成一定浓度的混合对 照品溶液，即得。2.供试品溶液的制备①复方扶芳藤合剂(口服液)供试品溶液的制备精密吸取一定量合剂(口服液) 样品，用水饱和的正丁醇分别振摇萃取数次，合并正丁醇液，再用氨试液洗涤，减压回收正 丁醇，残渣用甲醇溶解并定容，用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液的制备取本品装量差异项下的胶囊 内容物(或片剂)研细，取一定量细粉，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇，密塞，超 声提取，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，置分液漏斗 中，用氨试液洗涤多次，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容，摇勻，用微孔滤膜 (0. 45 μ m)滤过，取续滤液，即得。3.色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，乙腈-水为 流动相，梯度洗脱；柱温25°C -30°C ；流速lml/min ；检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱柱 效以人参皂苷Rb1峰计算不小于70000。4.测定精密吸取混合对照品溶液及上述各供试品溶液适量，按设定的色谱条件 进样测定，即得。经过研究，本发明优选的复方扶芳藤合剂(口服液)HPLC_ELSD指纹图谱的测定通 过以下步骤实施1.复方扶芳藤合剂(口服液)供试品溶液的制备精密吸取相当于原药材体-25 克的合剂(口服液)，用水饱和的正丁醇分别振摇萃取5次，用量分别为30，20，20，20， 20ml，合并正丁醇液，再用氨试液洗涤2次，第1次用100ml，第2次用80ml，弃去氨水层，减 压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到2ml，用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤 液，即得。2.色谱条件色谱柱是 Shim-Pack CLC-ODS, Waters symmetry C18、Shim-Pack VP-ODS或Hypersi 10DS2中的任何一种；最佳色谱柱是Shim-Pack CLC-ODS色谱柱，其规 格是150mmX6.0mm i.d.，5μπι。流动相是乙腈(A)-水(B)体系，其梯度洗脱的体积百分 比条件是0 IOmin 25 % A，10 20min 25 % 33 % A，20 35min 33 % A，35 55min 33%-65% A，55 60min 65%-75% A，60 65min 75% A ；柱温 25_30°C ；流速 lml/min ； 检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱的柱效以人参皂苷Rb1峰计算不小于70000。3.测定精密供试品溶液10-20 μ 1，按上述色谱条件进样测定，即得。在此条件下获取的复方扶芳藤合剂(口服液)对照指纹图谱见附
图1。经过研究，本发明优选的复方扶芳藤胶囊HPLC-ELSD指纹图谱的测定通过以下步 骤实施1.复方扶芳藤胶囊供试品溶液的制备取本品装量差异项下的胶囊内容物研 细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇 50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液和洗 涤液，置分液漏斗中，用氨试液洗涤3-4次，每次用50ml，正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇 溶解并定容至2ml，摇勻，用微孔滤膜(0.45μπι)滤过，取续滤液，即得。2.色谱条件色谱柱是 Shim-Pack CLC-ODS, Waters symmetry C18、Shim-Pack VP-ODS或Hypersi 10DS2中的任何一种；最佳色谱柱是Shim-Pack CLC-ODS色谱柱，其规 格是150mmX6.0mm i.d.，5μπι。流动相是乙腈(A)-水(B)体系，其梯度洗脱的体积百分 比条件是0 IOmin 25 % A，10 20min 25 % 33 % A，20 35min 33 % A，35 55min 33%-65% A，55 60min 65%-75% A，60 65min 75% A ；柱温 25_30°C ；流速 lml/min ； 检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱柱效以人参皂苷Rb1峰计算不小于70000。3.精密吸取供试品溶液10-20 μ 1，按上述色谱条件进样测定，即得。在此条件下 获取的复方扶芳藤胶囊对照指纹图谱见附图2。经过研究，本发明优选的复方扶芳藤片剂HPLC-ELSD指纹图谱的测定通过以下步 骤实施1.复方扶芳藤片供试品溶液的制备取本品20片研细，取相当于原药材15-25克 的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min， 放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，置分液漏斗中，用氨试 液洗涤3-4次，每次用50ml，正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容至2ml，摇勻，用 微孔滤膜(0. 45 μ m)滤过，取续滤液，即得。2.色谱条件色谱柱是 Shim-Pack CLC-ODS, Waters symmetry C18、Shim-Pack VP-ODS或Hypersi 10DS2中的任何一种；优选的色谱柱是Shim-PackCLC-ODS色谱柱，其规 格是150mmX6.0mm i.d.，5μπι。流动相是乙腈(A)-水(B)体系，其梯度洗脱的体积百分 比条件是0 IOmin 25 % A，10 20min 25 % 33 % A，20 35min 33 % A，35 55min 33%-65% A，55 60min 65%-75% A，60 65min 75% A ；柱温 25°C ；流速 lml/min ；检 测器为蒸发光散射检测器；色谱柱柱效以人参皂苷Rb1峰计算不小于70000。3.精密吸取供试品溶液5-10 μ 1，按上述色谱条件进样测定，即得。在此条件下获 取的复方扶芳藤片对照指纹图谱见附图3。经过分析研究，复方扶芳藤制剂(包括合剂、胶囊、片剂)的HPLC-ELSD指纹图谱 均具有19个共有特征峰，其中峰3为人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的叠加峰，峰6为人参皂 苷Rb1的特征峰，峰8为黄芪甲苷的特征峰；峰3、峰7、峰9、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、 峰18、峰19归属于红参(或人参)药材；峰2、峰8、峰10、峰11、峰12归属于黄芪药材；峰 1、峰4、峰5、峰6为黄芪和红参(或人参)的共有特征峰；峰8和峰6的峰面积，可分别用 于测定黄芪甲苷和人参皂苷Rb1的含量。下面对本分析方法的建立作进一步的描述1.供试品溶液的制备方法考察
1. 1复方扶芳藤胶囊(片剂)供试品溶液的制备1. 1. 1提取方法的考察人参皂苷和黄芪甲苷分别是红参(或人参)和黄芪药材中的主要功效成分。在 《中国药典》及大多数文献中，人参皂苷和黄芪甲苷的含量测定方法均是采用水饱和正丁醇 来提取；另有部分测定黄芪甲苷含量的文献系采用甲醇回流提取后用水饱和正丁醇萃取制 备供试品的方法。本研究应用HPLC法，通过比较色谱图并计算人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的 含量来对以上两种提取方法进行考察。由于复方扶芳藤胶囊与片剂均是以淀粉为辅料，故 本研究以复方扶芳藤胶囊为代表对复方扶芳藤胶囊(片剂)供试品溶液的制备方法进行考 察方法一取本品重量差异项下的内容物，取相当于药材15_25g的细粉，精密称定， 置锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，超声提取45min，抽滤，滤渣用水饱和正丁醇洗 涤多次，将正丁醇液完全转移至分液漏斗中，用氨试液洗涤4次，每次50ml，弃去水层，正丁 醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液， 即得。方法二 取本品重量差异项下的内容物，研勻，取相当于药材15_25g的细粉，精 密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇30ml，回流提取两次，每次lh，滤过，滤液蒸干，加水 50ml溶解，将水溶液倒入分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取5次，每次50ml，合并正丁醇溶 液，正丁醇层用氨试液洗涤3次，每次100ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至 2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得。测定结果表明，用方法二提取时得到的色谱图中有一些色谱峰没有体现出来，两 种方法提取出人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的量相差不大，但方法二比较复杂，故以下选择方法 一进行相关提取参数的考察。1. 1.2溶剂用量的考察人参皂苷Rb1和黄芪甲苷分别是人参和黄芪的主要有效成分，故以人参皂苷Rb1* 黄芪甲苷的含量为指标来考察溶剂用量和提取时间。取本品重量差异项下的内容物，研勻，取相当于药材25g的细粉5份，精密称定，置 锥形瓶中，分别精密加入水饱和正丁醇30ml、40ml、50ml、60ml、70ml，超声提取45分钟，抽 滤，滤渣用水饱和正丁醇洗涤多次，将正丁醇液完全转移至分液漏斗中，分别用等体积的氨 试液洗涤4次，弃去水层，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至2ml量瓶中，加甲醇 至刻度，摇勻，用微孔滤膜(0.45μπι)滤过，注入液相色谱仪，检测峰面积，计算含量，结果 见表1。表1溶剂用量考察结果
权利要求
一种复方扶芳藤制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于它是复方扶芳藤制剂中主要皂苷成分的HPLC ELSD指纹图谱检测方法。
2.如权利要求1所述的复方扶芳藤制剂，是由扶芳藤、黄芪、红参(或人参)制备而成 的，可以是合剂(口服液)、胶囊或片剂。
3.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，所述的复方扶芳藤制剂的HPLC-ELSD指纹 图谱测定条件是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，乙腈_水为流动 相，梯度洗脱；柱温25°C -30°C ；流速lml/min ；检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱柱效以 人参皂苷Rb1峰计算不小于70000。
4.如权利要求3所述的测定条件，其中所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱 柱是 Shim-PackCLC-ODS、Waters symmetry C18、Shim-Pack VP-ODS 或 Hypersil 0DS2 中的 任何一种。
5.如权利要求3所述的测定条件，其中所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱 柱是 Shim-PackCLC-ODS 色谱柱，其规格是 150mmX6. Omm i.d.，5μπι。
6.如权利要求3所述的测定条件，其中所述的流动相是乙腈(A)-水⑶体系，其梯度 洗脱的体积百分比条件是0 IOmin 25% Α，10 20min 25% 33% A，20 35min 33% A, 35 55min 33% -65% A, 55 60min65% -75% A, 60 65min 75% A。
7.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其试样溶液的制备及测定方法包括①对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rbl和黄芪甲苷对照品 适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制成一定浓度的混合对照品 溶液。②复方扶芳藤合剂(口服液)供试品溶液的制备精密吸取相当于原药材15-25克的 合剂(口服液)，用水饱和的正丁醇分别振摇萃取5次，用量分别为30，20，20，20，20ml，合 并正丁醇液，再用氨试液洗涤2次，第1次用IOOml，第2次用80ml，弃去氨水层，减压回收正 丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到2ml，用孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。③复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液的制备取本品装量差异项下的胶囊内容物 (或片剂)研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水 饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤， 收集滤液和洗涤液，置分液漏斗中，用氨试液洗涤四次，每次用50ml，正丁醇层水浴蒸干，残 留物加甲醇溶解并定容至2ml，摇勻，用微孔滤膜(0. 45 μ m)滤过，取续滤液，即得。④测定法精密吸取混合对照品溶液10-20μ 1及供试品溶液10-20 μ 1，按权力要求 3-6项的色谱条件进样，测定，即得。
8.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，所述的HPLC-ELSD指纹图谱时间总长度为 60mino
9.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，所述的复方扶芳藤制剂HPLC-ELSD指纹图 谱具有19个特征峰，其中峰3为人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的叠加峰，峰6为人参皂苷Rb1 的特征峰，峰8为黄芪甲苷的特征峰。
10.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，所述的复方扶芳藤制剂HPLC-ELSD指纹图 谱具有19个特征峰,其中的峰3、峰7、峰9、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰18、峰19归 属于红参(或人参)药材。
11.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，所述的复方扶芳藤制剂HPLC-ELSD指纹图 谱具有19个特征峰，其中的峰2、峰8、峰10、峰11、峰12归属于黄芪药材。
12.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，所述的复方扶芳藤制剂HPLC-ELSD指纹图 谱共有19个特征峰，其中的峰1、峰4、峰5、峰6为黄芪和红参(或人参)的共有特征峰。
13.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，所述的复方扶芳藤制剂HPLC-ELSD指纹图 谱共有19个特征峰，其中的峰8和峰6的峰面积，可分别用于测定黄芪甲苷和人参皂苷Rb1 的含量。
全文摘要
本发明提供一种复方扶芳藤制剂(含合剂、胶囊和片剂)中主要皂苷成分的HPLC-ELSD指纹图谱检测方法。本发明的指纹图谱检测方法包括按一定方法制备供试品溶液，然后在一定的色谱条件下测得指纹图谱。科学试验证明，此方法测定的指纹图谱重复性高，既可作为复方扶芳藤制剂中主要皂苷成分的检查和鉴定方法，也可用于制剂中黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量测定。
文档编号A61P7/06GK101966223SQ20101029910
公开日2011年2月9日 申请日期2010年10月8日 优先权日2010年10月8日
发明者冯军, 冯旭, 李耀华, 李芸, 覃洁萍, 邓家刚 申请人:广西中医学院