专利名称：miR-199a-3p在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料技术领域。涉及一种miRNA的用途。
背景技术：
miRNA是约为22个核苷酸的内源性的小RNA，在几乎所有已知的真核细胞中表 达，通过miRNA介导的RNA沉默途径调节基因的表达，调节着细胞增殖、分化和凋亡；同 时miRNA还在调节病毒的复制和病毒基因的表达过程中起着重要作用。miR-122能够提 高丙型肝炎病毒的复制(Jopling CL, et al. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by aliver-specific MicroRNA. Science 2005 ;309，1577-1581.)，而miR-32则 抑制灵长类泡沫病毒 1 型(PFV-I)的翻译(Lecellier CH, . et al. A cellular microRNA mediates antiviraldefense in human cells. Science 2005 ;308,557-560.)。miRNA 也 可以调节HIV与宿主T细胞的相互作用，影响患者的HIV的潜伏或持续感染(Huang J， et al.Cellular microRNAscontribute to HIV-I latency in resting primary CD4+T lymphocytes. Nat Med. 2007 ；13,1241-1247 ；Chable-Bessia C, et al. Suppression of HIV-I replication by microRNAeffectors. Retrovirology 2009;6，26·)。由于 RNA 沉默 (或RNA干扰，RNAi)在植物、真菌和动物中起着天然的抗病毒的作用，所以感染的病毒也 引发细胞miRNA的变化或产生病毒miRNA (vmiRNA)以对抗细胞的抗病毒活性，此外，一些被 细胞miRNA攻击的病毒可以通过合成特异的病毒蛋白或病毒RNA分子影响细胞miRNA的水 平(de Vries W,Berkhout B. RNAisuppressors encoded by pathogenic human viruses. Int J Biochem Cell Biol 2008 ；40, 2007-2012.) HIV-I Tat 蛋白通过抑制 Dicer 活 性来抑制RNAi, HIV-I TAR发夹可以饱和TRBP使RNAi受到抑制(Bennasser Y，Jeang, KT. HIV-I Tat interaction with Dicer-requirement for RNA. Retrovirology 2006 ； 3,95 ；Bennasser Y, et al. HIV-I TAR RNAsubverts RNA interference in transfected cells through sequestration of TARRNA-binding protein TRBP. J Biol Chem 2006 ； 281,27674-27678.)。研究miRNA在病毒增殖和基因表达过程中的作用将有助于理解宿主 与病原间的相互作用，同时为解释病毒的组织嗜性，潜伏感染，和致瘤性提供新的理论依 据，并有助于发展抗病毒药物。HBV为嗜肝性的部分双链的DNA病毒，其基因组包含4个重叠的开放读码框架，编 码乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、DNA多聚酶和X蛋白，慢性HBV感染是肝纤维化 的主要原因，最终导致肝硬化和肝细胞癌。目前HBV持续性感染的机制以及宿主与HBV之 间的作用机制尚未完全阐明。在HBV复制过程中，miRNA作为一种有效的转录后基因表达调控方式，也发挥着调 节病毒蛋白表达及病毒增殖的作用。确定抑制HBV增殖的宿主miRNA可能为今后开发抗 HBV的药物或手段提供新的分子基础或靶位点。
发明内容
本发明的目的是提供miR-199a-3p在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。本发明的技术方案概述如下miR-199a-3p在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，所述miR-199a-3p为序列表 SEQ IDNO :1所述的核苷酸序列。实验结果表明miR-199a-3p能有效地降低HBsAg表达，但不影响H印G2 2. 2. 15 细胞的增殖。实时PCR对HBV DNA定量显示miR-199a-3p抑制病毒的复制。生物信息 学分析表明在HBsAg编码区有miR-199a-3p的结合位点，通过荧光报告载体实验验证了 miR-199a-3p对HBV转录产物的影响，同时用实时PCR和Western blot检测进一步证实 miR-199a-3p对HBsAg的表达有抑制作用。这些结果提示，miR-199a_3p在调节和控制HBV 的复制发挥重要作用，并能制备成抗HBV的药物。
图1为miR-199a_3p有效抑制HBsAg的表达和HBV的复制(图中“*”表示P < 0. 05)。(A)转染miRNA ASOs或对照ASO的!fepG22. 2. 15细胞，实时定量RT-PCR测定的 miR-199a-3p表达水平，以小核RNA U6的水平进行标准化；(B)miR-199a-3p 的 ASO 增加 HBsAg 的表达转染 miRNA ASO 或对照 ASO 的!fepG2 2. 2. 15细胞培养上清液用ELISA测定HBsAg和HBeAg，MTS方法测定细胞活性；(C)miR-199a-3p的ASO增加HBsAg的复制，用实时定量PCR分析HBV DNA,将对照 组的HBVDNA水平设为1 ；(D)HepG2 2. 2. 15细胞转染miRNA前体或载体对照，用实时定量PCR测定 miR-199a-3p表达水平，以小核RNA U6的水平进行标准化；(E，F)过表达miR-199a-3p 降低 HBsAg 的复制及 HBsAg 的表达，!fepG2 2. 2. 15 细胞 分别转染miRNA前体或载体对照，转染72小时后收获上清，用ELISA (E)和实时定量PCR(F) 分析，将对照组的HBsAg表达水平和HBV DNA水平设为1。图2为用EGFP荧光报告载体实验证明HBsAg是miR-199a-3p的靶(图中“*”表 示 P < 0. 05，“#”P > 0. 05)。(A,B)miR-199a-3p候选靶的“种子序列”㈧或突变形式⑶的互补序列，突变的 核苷酸用下划线标明，HBV基因组与miR-199a-3p互补序列由公共数据库获得；(C) HepG2 2. 2. 15 细胞共转染 EGFP 报告质粒(pcDNA3/EGFP_HBsAg，pcDNA3/ EGFP-HBsAg-mut,)和 RFP 表达质粒 pDsRedl_Nl 同时转染 miRNA ASO 或对照 AS0，在 H印G2 2. 2. 15细胞中携带靶基因序列的报告质粒的EGFP表达受到内源性miRNA的抑制，miRNA ASO可以降低这种抑制作用；而携带靶基因序列的突变形式的miRNA ASO实验组与对照组 没有差别。将实验组的荧光值设为1，直方图显示的是3次独立实验的标准化的平均荧光值 (士SD) (D)HepG2 2. 2. 15细胞共转染EGFP报告质粒和pDsRedl_Nl质粒，同时转染miRNA表 达载体或载体对照，在H印G2 2. 2. 15细胞中，由mR-199a-3p表达载体引起mR-199a_3p过 表达抑制了携带HBsAg编码序列的EGFP表达，但对携带HBsAg编码序列突变形式的EGFP 表达没有影响，将实验组的荧光值设为1，直方图显示的是3次独立实验的标准化的平均荧
4光值(士 SD)图3为过表达miR-199a-3p降低HBsAg基因的mRNA和蛋白的表达(图中“*”表 示P < 0. 05)。(A) HepG2 2. 2. 15细胞分别转染miRNA的ASO或miRNA前体，转染后48小 时用实时定量PCR测定HBsAg的mRNA水平，用β -actin表达水平做标准化，数据代表平均 值(士SD)，将实验组的表达水平设为1。(B)Western blot测定转染后的IfepG2 2. 2. 15细胞的HBsAg蛋白水平上部的图显示Western blot定量的结果，所显示的数据为3次独立实验的平均值 (士 SD)
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例11.细胞培养H印G2 2. 2. 15和HEK293细胞株分别在DMEM和MEM- α (GIBCO, USA)基础培养基 中培养，两种培养基均添加10%的胎牛血清，20mM HEPES, 2mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉 素和100μ g/ml链霉素，所有细胞均置含5% CO2的37°C培养箱内，2-3天传代一次。2.细胞转染与人成熟miRNA完全互补的2’甲氧基(2’ -OMe)修饰的反义寡核苷酸(ASO)由 IDT公司合成，细胞以IO4/孔接种于96孔板，次日以50nM miRNA的2，-0Me_AS0或以5ng/ μ L miRNA表达载体的剂量用Lipofectamine 2000转染细胞，每组实验做3个复孔，按本实 验室常规方法并参照说明书进行。48小时后换新的培养基，24小时后，收集细胞上清液用 来检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA。每组实验至少重复3次。3.实时定量PCRmiRNAs 的定量用 SYBR Green-based real-time RT-PCR 检测取 IOng 总 RNA 为模板，与逆转录引物混合进行逆转录；逆转录之后，取Ιμ cDNA用SYBR Premix Ex Taq (TakaRa, Japan)进行 PCR 反应，其过程为 94°C 3min,以后进行 94°C 30 秒，50°C 30 秒 和72°C 40秒的40个循环，反应在ABI 7500 Real-time PCR系统进行。进行数据处理分 析，将所得数据标准化后比较各组之间目的基因的变化，用TO做内参。HBV DNA拷贝数的检测取转染后H印G2 2. 2. 15细胞上清液50 μ 1，按照 Diagnostic Kitfor Quantification of Hepatitis B virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)试剂盒的说明书进行操作，数据的收集由ABI 7500定量PCR仪自带软件完成 Real-time PCR，然后进行数据处理分析。4. MTS 实验HepG2 2. 2. 15细胞以10，000/孔的密度接种于96孔细胞板内，次日转染寡核苷酸 或miRNA前体，转染72小时后，每孔加入20 μ 1 MTS/PMS混合液(MTS和PMS的最终浓度分 别为 333 μ g/ml 和 25 μ M)，CO2 培养箱 37°C孵育 4 小时，用 μ Quant Universal Microplate 分光光度计(Bio-tek，Germany)在490nm下测定吸光度。5. ELISA 检测 HBsAg 和 HBeAg转染后72小时，！fepG2 2. 2. 15培养上清，用PBS 1 5稀释，用ELISA检测试剂盒按照说明书方法测定HBsAg和HbeAg。6.质粒构建将包含预测的miR-199a-3p结合位点的HBV转录物的片段用PCR法扩增，所用的 引物HBsAg sense5’ CGGAATTCTTCCTCTTCATCCTGCTGCT 3’HBsAg antisense 5’ CAGTCCTCGAGACATAGAGGTTCCTTGAGCAG 3’ ；扩增的片段克隆到pcDNA3. 1 (+) /EGFP上的EGFP CDS下游的EcoR I和XhoI酶切 位点上，构建的质粒命名为pcDNA3/EGFP-HbsAg，类似的，将含有突变的miR-199a-3p结合 位点的片段克隆到pcDNA3. 1 (+)/EGFP的相同位点，命名为pcDNA3/EGFP-HBsAg-mut。为构建表达miRNA前体的质粒，用PCR扩增HEK293基因组中带有miRNA前体的 DNA片段，其引物为pri-miR-199a-3p sense 5’ GGAGATCTTGAGCCCAGAAGCCACGATC 3’pri-miR-199a-3p antisense 5’ CGGAATTCGCCACCCTCTTAGATGCC 3’将扩增的pri-miR-199a_3p片段克隆到pcDNA3B的Bgl II与EcoR I酶切位点上7.荧光报告载体实验HepG2 2. 2. 15和HEK293细胞分别接种到48孔板，次日分别先转染寡 核苷酸或miRNA前体，然后再转染已构建的不同的荧光报告载体，RFP表达载体 PDsRed2-Nl (Clontech, USA)用于数值的标准化，40小时收获蛋白，用荧光分光光度计 F-4500 (HITACHI, Japan)检测 EGFP 和 RFP 的荧光强度。8. Western blotting24孔板培养转染寡核苷酸或质粒的H印G2 2. 2. 15细胞，细胞成片后每孔加入 ΙΟΟμ 1RIPA，置于4°C裂解25min ；收集裂解液反复吹打，4°C 12000rpm，离心lOmin，收集上 清；马司亮蓝G-250法测定蛋白含量，各样品均取出50μ g进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳； 至目的蛋白有效分离后停止电泳，取出聚丙烯酰胺凝胶进行硝酸纤维素膜电转移；4°C， 100mA，转移过夜；出硝酸纤维素膜，置于Blotto封闭液中，室温下封闭3h ；加入兔抗HBsAg 抗体，室温下孵育2h ；TBST清洗4次，每次5min ；加入二抗(羊抗兔IgG抗体)，室温下孵育 Ih ；TBST清洗4次，每次5min ；按照使用说明加入增强化学发光试剂，作用3min，曝光，然后 进行显影、定影处理；观察结果，以β -actin作为参照，胶片用LabWorks 凝胶成像及分析 系统进行摄像，分析蛋白条带的亮度值。本发明用H印G2 2. 2. 15细胞(稳定转染完整HBV基因组的H印G2细胞，它可组成 性地表达乙型肝炎病毒的表面抗原、核心抗原和e抗原，并可进行整个HBV的复制)来研 究miRNA对HBV复制的调节作用中发现，向！fepG2 2. 2. 15细胞2，甲氧基miR-199a_3p和 miR-210的反义链(miR-199a-3p AS0)可促进HBsAg表达和HBV增殖(图IB和图1C)，推 测这是由于抑制H印G22. 2. 15细胞内源性miR-199a-3p的结果(图1A)，故miR-199a_3p 可能具有抑制HBsAg表达和HBV增殖的作用。为了证实上述推测，将表达miR-199a-3p 的质粒(pcDNA3/pri-199a-3p)转染到H印G2 2. 2. 15细胞使miR-199a_3p的表达提高 了 3倍(Fig. ID), ELISA和实时定量PCR检测显示=HBsAg表达量和HBV的复制水平均 降低30-40%，但对H印G2 2. 2. 15细胞的本身增殖没有影响(Fig. IE and IF)。提示 miR-199a-3p在抑制HBV增殖中起者重要作用。
为了探讨miR- 199a-3p抑制HBV复制的机制，通过靶位点预测数据库预测了 miR-199a-3p可能的靶基因，预测显示在HBsAg的编码区含有miR-199a-3p的结合位点； miR-199a-3p与HBsAg结合及碱基互补如图2A所示。由于miR-199a_3p在HBV HBsAg区 域都只有一个结合位点，本发明从HBV基因组的HBsAg编码区扩增了 306bp的片段，含有 miR-199a-3p 一个推测的结合位点，克隆到pcDNA3. 1 (+)/EGFP上的增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)编码序列的下游区域作为报告载体，与此同时构建了含有在种子序列中带有3个突 变的载体(图2B)。HepG2 2. 2. 15细胞转染报告载体和miRNA ASO或对照AS0，转染红色荧 光蛋白(RFP)表达载体pDsRed2-Nl的H印G22. 2. 15细胞用于标准化。转染后48小时测定 EGFP和RFP活性，数值结果代表EGFP与RFP的标准化的比值。如图2C所示，miRNA抑制组 的EGFP荧光强度显著高于对照组，而转染miRNA表达载体使miR-199a-3p过表达的H印G2 2.2. 15细胞，EGFP的水平显著下降(图2D)；当miRNA种子序列的结合位点突变时，报告载 体的表达与miR-199a-3p水平无关。为了进一步证实这miR-199a-3p对候选靶基因的直接 作用，将HEK293细胞共转染EGFP报告质粒和相应miRNAASOs或相应miRNAs的前体，获得 了果与在H印G2 2.2. 15细胞相同的结果。综合这些观察结果可以说明miR-199a-3p直接 靶定HBV基因的转录产物抑制HBsAg的表达。MiRNAs是通过转录后或降解靶基因的mRNA的方式来抑制靶基因的表达的，本发 明采用实时定量PCR来确定HBsAg mRNA是否受miR-199a-3p调控，结果表明与对照相比， 过表达miR-199a-3p的!fepG2 2. 2. 15细胞HBsAg mRNA水平显著下降，而通过相应miRNA 的ASO敲低miR-199a-3p,则HBsAg mRNA水平显著升高(图3A)。同时Western blot实验 表明miR-199a-3p也抑制HBsAg蛋白的翻译(图3B)；这些结果提示miR-199a_3p通过翻 译抑制和mRNA降解两种方式降低HBsAg的表达。
权利要求
miR 199a 3p在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，所述miR 199a 3p为序列表SEQID NO1所述的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了miR-199a-3p在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，miR-199a-3p为序列表SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。实验结果表明miR-199a-3p能有效地降低HBsAg表达，但不影响HepG2 2.2.15细胞的增殖。实时PCR对HBV DNA定量显示miR-199a-3p抑制病毒的复制。生物信息学分析表明在HBsAg编码区有miR-199a-3p的结合位点，通过荧光报告载体实验验证了miR-199a-3p对HBV转录产物的影响，同时用实时PCR和Westernblot检测进一步证实miR-199a-3p对HBsAg的表达有抑制作用。这些结果提示，miR-199a-3p在调节和控制HBV的复制发挥重要作用，并能制备成抗HBV的药物。
文档编号A61K48/00GK101954094SQ201010502949
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月11日 优先权日2010年10月11日
发明者万海英, 刘民, 刘涛, 李怡璇, 李欣, 汤华, 王芳, 章广玲 申请人:天津医科大学