专利名称：纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料及其制备方法
技术领域：
本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料 及其制备方法。
背景技术：
皮肤是维持内环境稳定和阻止微生物入侵的屏障。重建或恢复皮肤屏障是烧伤 治疗的最终目标，在达到这个目标之前，一个性能优良的创面覆盖物可暂时起到皮肤屏 障功能的作用，提供一个有利于创面愈合的环境。一种理想的创面覆盖物应具有① 良好的黏附性、通透性，又能控制水分蒸发，具有类似正常皮肤的水分蒸发率；②减少 营养物质经创面丢失，阻止细菌入侵和限制细菌在创面上定殖；③减轻疼痛；④良好的 顺应性，具有良好的弹性和柔韧性，可随体形覆盖创面，适合于人体不同解剖部位；⑤ 有效防止仅用自体薄皮片移植后引起的瘢痕形成和创面收缩；⑥引导细胞的新生，促使 自体成纤维细胞在异种真皮支架中生长；促进创面愈合，以达外观平整、功能良好的目 的；储存、应用方便；⑦对组织无刺激性、无毒性、无抗原性、无致癌性；⑧能耐受高 压或其他常用消毒方法处理，能在室温内长期保存，并能大量生产。近年来猪脱细胞真皮基质(PADM)去除了可诱发免疫排斥反应的细胞成分，而 广泛应用于创面修复。猪皮结构与人皮肤结构相似，皮肤解剖生理特点也基本相同，且 来源广、成本低，传统的生物性敷料如异体皮肤、异种猪皮对于II度烧伤创面的治疗起 到了很好的作用，但也存在如创面易感染、换药次数频繁，又具有交叉感染的危险性等 缺点。而各种合成敷料本身不具有杀菌的能力。这使其在临床上广泛应用受到一定限 制。也有对纳米银生物仿生敷料的研究(CN 1775300A)，但其对作为基质的壳聚糖 膜的处理较为复杂，在处理过程中要得到均勻的膜体也较为困难，同时其为膜结构，不 利于成纤维细胞及血管内皮细胞按照应有的组织学方式长入真皮层。
发明内容
本发明的目的是为了解决猪脱细胞真皮基质作为生物敷料时易感染的缺陷。为了达到上述目的，本发明提供了一种纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料， 包括猪脱细胞真皮基质和组装在猪脱细胞真皮基质上的纳米银粒子，其中纳米银粒子的 含量为435.66-447.66 μ g/g，纳米银粒子的粒径大小为55_75nm。本发明还提供了一种纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，该方法 包括以下步骤(1)纳米银粒子的制备配置浓度为0.5X10-3-1.5Xl(T3mol/LAgN03溶液，搅 拌并加热，沸腾后，滴加5-15mg/mL Na3C6H5O7 · 2H20溶液，反应20-40分钟后，自然 冷却，过滤，得到纳米银胶体溶液；所述AgNO3溶液与Na3C6H5O7 ·2Η20溶液的体积比 为 48-52 1 ；
(2)猪脱细胞真皮基质的处理将猪脱细胞真皮用75-95%的酒精浸泡脱水6-18 小时，进行超声2-6分钟后，无菌操作下从浸泡液中取出，紫外灯照射下晾干；(3)纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的制备将步骤(2)中处理后的猪脱细 胞真皮基质完全浸泡于步骤(1)中得到的纳米银胶体溶液中，超声2-4分钟，并在2-6°C 下低温保存0.5-4天，其中保存温度优选4°C;取出浸泡后的猪脱细胞真皮基质，用生理 盐水冲洗即得到无菌的纳米银_猪脱细胞真皮基质。其中，步骤(1)中配置的AgNO3溶液优选浓度为lX10_3mol/L， Na3C6H5O7 · 2H20 溶液优选浓度为 10mg/mL，AgNO3 溶液与 Na3C6H5O7 · 2H20 溶液的 优选体积比为50 1。步骤(2)所述的猪脱细胞真皮基质的处理过程优选为将猪脱细胞真皮基质置 于75%酒精中6小时，取出后再置于85%酒精中6小时，取出最后置于95%酒精中6小 时进行脱水处理，然后将带有猪脱细胞真皮基质的95%酒精超声2分钟，间隔两分钟后 再进行超声2分钟；或者将猪脱细胞真皮基质置于75%酒精中6小时后，超声2分钟， 取出，再将猪脱细胞真皮基质置于85%酒精中6小时后，超声2分钟，取出，最后将猪脱 细胞真皮基质置于95%酒精中6小时后，超声2分钟。取出猪脱细胞真皮基质后，紫外 灯照射时间优选为3-5小时。将步骤(3)中得到的纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料，浸泡在生理盐水中进 行超声2-4分钟，超声完成后用生理盐水进行冲洗；冲洗后，再次浸泡在步骤(1)中得 到的纳米银溶液中并超声2-4分钟后，在2-6°C下低温保存0.5-4天，其中保存温度优选 4°C ；浸泡后取出，用生理盐水冲洗即得到纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料。最终得到的纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料置于无菌生理盐水中进行低温 (2-60C )保存，优选保存温度4°C。本发明纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料具有如下优点1、猪的皮肤结构与人的皮肤相似，因此作为基质的PADM完整地保留了细胞的 形态结构和组成成分，具有抗原性低的特点；同时可诱导具有再生能力的成纤细胞及血 管内皮细胞按照应有的组织学方式长入真皮层；2、组装在PADM上的纳米银粒子能不断地作用于再生细菌，具有持续、高效的 杀菌特点，能够减少该敷料的换药次数，降低了交叉感染的危险性，同时减少了换药时 的痛苦；3、纳米银生物敷料不会产生耐药性，无过敏现象发生，具有持久抗感染能力和 良好的生物相容性及稳定性；且纳米银粒子作为纳米级颗粒体积小，具有极大的接触面 积，在能有效地控制创面细菌的前提下，极大减少了贵金属银的用量；4、对猪脱细胞真皮基质同时进行脱水及超声处理，能有效地去除原有细胞等成 份，从而降低排异反应，并能使得猪脱细胞真皮基质结构疏松，将纳米银粒子较均勻地 分散自组装在猪脱细胞真皮基质上；采用酒精梯度浸泡，能够使得脱水更加充分；多次 超声处理，使得猪脱细胞真皮基质的结构疏松，更加容易结合纳米银粒子；5、在纳米银粒子自组装在猪脱细胞真皮基质上的过程中，采用物理吸附和化 学结合两种方式共同结合，使纳米银粒子更加均勻牢固地组装在猪脱细胞真皮基质上 猪脱细胞真皮基质直接浸泡在纳米银溶液中，进行物理吸附；物理吸附后，进行超声处理，使得纳米银粒子能够通过银-氮键的相互作用，通过键合作用更加牢固地组装在猪 脱细胞真皮基质上；采用多次浸泡和超声处理，使得纳米银粒子的吸附更加紧密。
图1为本发明纳米银粒子透射电子显微镜图；图2为本发明纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的横切面HE染色图；图3为纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料和猪脱细胞真皮基质对大肠杆菌(A) 的抑菌试验结果对比图；图4为纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料和猪脱细胞真皮基质对金黄色葡萄球 菌(B)的抑菌性试验结果对比图；图5为纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料和猪脱细胞真皮基质对大肠杆菌(a) 的稳定性试验结果对比图；图6为纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料和猪脱细胞真皮基质对金黄色葡萄球 菌(b)的稳定性试验结果对比图；图7为采用不同浓度纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料浸提液对小鼠成纤维细 胞(L-929细胞)培养2天的生长状态图；图8为采用不同浓度纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料浸提液对小鼠成纤维细 胞(L-929细胞)培养4天的生长状态图；图9为采用不同浓度纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料浸提液对小鼠成纤维细 胞(L-929细胞)培养7天的生长状态图；图3至图6中，1、2、3为纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料的抑菌环；4为 猪脱细胞真皮基质的抑菌环；图7中，al为100%浸提液培养2天， 照组培养2天；图8中，bl为100%浸提液培养4天，
照组培养4天；图9中，cl为100%浸提液培养7天，
照组培养7天。
具体实施例方式实施例11、纳米银粒子的制备(1) 1 X l(T3mol/LAgN03溶液准确称取0.085gAgN03置于烧杯中，用亚沸水溶 解，转移至500mL容量瓶中，定容。过滤除去杂质后加到用亚沸水润洗过的容器中；(2) IOmgAnLNa3C6H5O7 · 2H20 溶液准确称取(XlgNa3C6H5O7 · 2H20 置于烧 杯中并用亚沸水溶解，转移至IOmL容量瓶中，定容。过滤除去杂质；(3)加热并搅拌盛有AgNO3溶液的容器，沸腾后，滴加Na3C6H5O7 · 2H20溶 液，反应30分钟左右，脱离热源，自然冷却，即得到平均粒径为70nm左右的纳米银粒 子溶液。
a2为50%浸提液培养2天，a3为阴性对 b2为50%浸提液培养4天，b3为阴性对 C2为50%浸提液培养7天，c3为阴性对
2、猪脱细胞真皮基质(PADM)的处理(1)将购买的PADM置于75%酒精6小时；(2)取出，再将PADM置于85%酒精6小时；(3)取出，再将PADM置于95%酒精6小时；(4)将带有PADM的95%酒精液超声2分钟，间隔2分钟，再超声2分钟；(5)在超净工作台中将PADM取出，置于无菌的容器中，紫外灯照射3小时即得 到无菌的猪皮基质。3、纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的制备(1)在超净工作台中过滤纳米银粒子溶液；(2)在超净工作台中将预处理过的PADM完全浸泡在过滤的纳米银粒子溶液中， 超声2分钟后，4°C冰箱保存0.5天；(3)在超净工作台中将处理好的脱细胞猪皮基质取出，用生理盐水冲洗并浸泡， 超声2分钟；(4)将步骤(3)得到的PADM完全浸泡在纳米银溶液中，超声2分钟，4°C保存 0.5 天；(5)将PADM取出，用生理盐水冲洗数次，即得到无菌的纳米银_猪脱细胞真皮 基质生物敷料；(6)将得到的纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料浸泡于无菌生理盐水中，4°C 低温保存。实施例21、纳米银粒子的制备(1) 0.5 X l(T3mol/LAgNO3溶液准确称取0.042gAgN03置于烧杯中，用亚沸水 溶解，转移至500mL容量瓶中，定容。过滤除去杂质后加到用亚沸水润洗过的容器中；(2) 5mg/mLNa3C6H507 · 2H20 溶液准确称取 0.05gNa3C6H507 · 2H20 置于烧 杯中并用亚沸水溶解，转移至IOmL容量瓶中，定容。过滤除去杂质；(3)加热并搅拌盛有AgNO3溶液的容器，沸腾后，滴加Na3C6H5O7 · 2H20溶 液，反应20分钟左右后，脱离热源，自然冷却，即得到平均粒径为55-75nm的纳米银粒 子溶液。2、猪脱细胞真皮基质的预处理(1)将购买的PADM置于75%酒精6小时后，超声2分钟(2)取出，再将PADM置于85%酒精6小时后，超声2分钟；(3)取出，再将PADM置于95%酒精6小时后，超声2分钟；(4)在超净工作台中将PADM取出，置于无菌的容器中，紫外灯照射4小时即得 到无菌的PADM。3、纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的制备(1)在超净工作台中过滤纳米银粒子溶液；(2)在超净工作台中将预处理过的PADM完全浸泡在过滤的纳米银粒子溶液中， 超声4分钟后，4°C冰箱保存1天；(3)在超净工作台中将脱细胞猪皮基质取出，用生理盐水冲洗并浸泡，即得到无菌的纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料。实施例31、纳米银粒子的制备(1) 1.5 X 10"3mol/LAgNO3溶液准确称取0.085gAgN03置于烧杯中，用亚沸水 溶解，转移至500mL容量瓶中，定容。过滤除去杂质后加到用亚沸水润洗过的容器中；(2) 15mg/mL Na3C6H5O7 · 2H20 溶液:准确称取 0.15gNa3C6H507 · 2H20 置于 烧杯中并用亚沸水溶解，转移至IOmL容量瓶中，定容。过滤除去杂质；(3)加热并搅拌盛有AgNO3溶液的容器，沸腾后，滴加Na3C6H5O7 · 2H20溶 液，反应40分钟左右，脱离热源，自然冷却，即得到平均粒径为55-75nm的纳米银粒子 溶液。2、猪脱细胞真皮基质的预处理(1)将购买的PADM置于75%酒精6小时后，超声2分钟；(2)取出，再将PADM置于85%酒精6小时后，超声2分钟；(3)取出，再将PADM置于95%酒精6小时；(4)将带有PADM的95%酒精液超声2分钟，间隔2分钟，再超声2分钟；(5)在超净工作台中将PADM取出，置于无菌的容器中，紫外灯照射5小时即得 到无菌的PADM。3、纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的制备(1)在超净工作台中过滤纳米银粒子溶液；(2)在超净工作台中预处理过的PADM完全浸泡在纳米银粒子溶液中，超声4分 钟，4°C冰箱保存2天；(3)在超净工作台中将脱细胞猪皮基质取出，用生理盐水冲洗并浸泡，即得到无 菌的纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料。效果实施例将实施例1中得到的纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料进行如下效果检测1、电子显微结构图1所示为实施例1得到的纳米银的投射电子显微镜图，从图中观察到纳米银粒 子直径约为55-75nm ；图2为实施例1得到的纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的横切 面HE染色图。2、银含量通过火焰原子吸收法测定银含量用亚沸水逐级稀释银标准溶液为0、0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 μ g/mL的银标准溶液，在选定的条件下进行测定，并绘制 工作曲线，得到的回归方程为A = 0.0555C+0.0007，R2 = 0.9997，通过回归方程得到实 施例1制备的纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料中银含量为441.66士6.00 μ g/g。3、抑菌效果采用金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(8099)对生物敷料进行抑菌试验 的测定，通过测量抑菌试验的抑菌环来衡量纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的抑菌 效果，结合图3和图4，通过游标卡尺测量得到纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料抑菌 试验的抑菌环直径大于12mm，如表1所示，说明该生物敷料具有抑菌效果，而猪脱细胞
权利要求
1.一种纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料，其特征在于包括猪脱细胞真皮基质 和组装在其上的纳米银粒子，所述纳米银粒子的含量为435.66-447.66 μ g/g，所述纳米银 粒子的粒径大小为55-75nm。
2.—种纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，其特征在于该制备方法 包括以下步骤(1)纳米银粒子的制备配置浓度为0.5X10_3-1.5X10_3mol/LAgN03溶液，搅拌并 加热，沸腾后，滴加5-15mg/mLNa3C6H507 · 2H20溶液，反应20-40分钟后，自然冷 却，过滤，得到纳米银胶体溶液；所述AgNO3溶液与Na3C6H5O7 ·2Η20溶液的体积比为 48-52 1 ；(2)猪脱细胞真皮基质的处理将猪脱细胞真皮用75-95%的酒精浸泡脱水6-18小 时，进行超声2-6分钟后，无菌操作下从浸泡液中取出，紫外灯照射下晾干；(3)纳米银_猪脱细胞真皮基质生物敷料的制备将步骤(2)中处理后的猪脱细胞真 皮基质完全浸泡于步骤(1)中得到的纳米银胶体溶液中，超声2-4分钟，并在2-6°C下低 温保存0.5-4天；取出浸泡后的猪脱细胞真皮基质，用生理盐水冲洗即得到纳米银-猪脱 细胞真皮基质生物敷料。
3.根据权利要求2所述生物敷料的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的猪脱细 胞真皮基质的处理过程为将猪脱细胞真皮基质置于75%酒精中6小时；取出后再置于 85%酒精中6小时；取出最后置于95%酒精中6小时进行处理，然后将浸泡有猪脱细胞 真皮基质的95%酒精超声2分钟，间隔两分钟后再进行超声2分钟。
4.根据权利要求2所述生物敷料的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的猪脱细胞 真皮基质的处理过程为将猪脱细胞真皮基质置于75%酒精中6小时后，超声2分钟； 取出，再将猪脱细胞真皮基质置于85%酒精中6小时后，超声2分钟；取出，最后将猪 脱细胞真皮基质置于95%酒精中6小时后，超声2分钟。
5.根据权利要求2至4任一所述生物敷料的制备方法，其特征在于步骤(1)中配置 的 AgNO3 溶液浓度为 1 X 10_3mol/L，Na3C6H5O7 · 2H20 溶液浓度为 10mg/mL，AgNO3 溶液与Na3C6H5O7 · 2H20溶液的体积比为50 1。
6.根据权利要求2至4任一所述生物敷料的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述 的紫外灯照射时间为3-5小时。
7.根据权利要求2至4任一所述生物敷料的制备方法，其特征在于将步骤(3)中得 到的纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料，浸泡在生理盐水中进行超声2-4分钟，超声完 成后用生理盐水进行冲洗；冲洗后，再次浸泡在步骤(1)中得到的纳米银溶液中并超声 2-4分钟后在2-6°C下低温保存0.5-4天；取出，用生理盐水冲洗即得到纳米银-猪脱细 胞真皮基质生物敷料。
8.根据权利要求2至4任一所述生物敷料的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述 的猪脱细胞真皮基质于纳米银溶液中的保存温度为4°C。
全文摘要
本发明公开了一种纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料及其制备方法，该生物敷料包括猪脱细胞真皮基质和组装在其上的纳米银粒子，其中纳米银粒子的含量为435.66-447.66μg/g，纳米银粒子的粒径大小为55-75nm。该生物敷料通过下述步骤制备(1)通过柠檬酸三钠还原硝酸银制备纳米银溶液；(2)对猪脱细胞真皮基质进行酒精梯度脱水，超声；(3)将步骤(2)处理得到的猪脱细胞真皮基质置于纳米银溶液中进行自组装，即得到纳米银-猪脱细胞真皮基质生物敷料。本发明得到的生物敷料抗菌性能强，且生物安全性高，组织相容性好，同时工艺简单，使用方便。
文档编号A61L15/40GK102018991SQ201010569979
公开日2011年4月20日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者何红, 夏栋林, 张逸, 景红霞, 王雨飞, 顾海鹰, 鲁双云, 黄桂娟 申请人:南通大学, 南通通大化学物安全性评价中心有限公司