一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法

专利名称：一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法
技术领域：
本发明属于动物模型构建技术领域，涉及一种阿尔茨海默病动物模型的制备方 法，具体涉及一种铝诱导APP/PS1双转基因小鼠阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法。
背景技术：
随着人类寿命的增加，很多国家已经或即将进入老龄社会，老年性疾病已成为社 会关注和相关学科研究的热点。老年性痴呆(Alzheimer' s disease, AD)是中枢神经系 统的一种慢性、进行性变性疾病，在老龄人口中与恶性肿瘤、心脑血管疾病并列为导致老年 人死亡的三大疾病，其发病率随着人均寿命的延长而逐年上升。流行病学调查发现，我国65 岁以上老年人中AD的发病率高达3. 5%。自1906年德国神经病理学家AloisAlzheimer发现AD以来，科学工作者进行了近 一个世纪的潜心探究，从形态学、神经生物学和临床研究等方面着手，在AD的病理改变、发 病机制及治疗等方面都做了大量研究工作。目前，关于AD的病因主要有下述几种学说1.遗传学说。AD和遗传易感性有关，目前已知4个与AD相关的基因是位于21号 染色体的APP基因、14号染色体的早老素I(PSl)基因、1号染色体的早老素2 (PS2)基因和 位于19号染色体的ApoE ε 4(apolipoprotein E ε 4)等位基因。APP基因、早老素1、早老 素2基因突变被认为是早发型家族性AD的遗传因子；ApoE ε 4等位基因被认为是散发型AD 的发病危险因素。2.铝中毒学说。大量研究支持铝是AD的病因，概括为以下五方面1)铝是人体 的非必需金属元素，在很低浓度下就可以有神经毒性作用，可以引起类似AD的三个典型病 理改变铝在脑内的蓄积可以诱导β-淀粉样蛋白沉积，是老年斑(senile plaque, SP)的 组成成分；AD患者脑部存在大量的神经原纤维缠结(neuronfibrillary tangles, NFTs), 动物脑室内注射铝也可以引起脑组织广泛的神经纤维细丝聚集；细胞凋亡是AD细胞死亡 的主要形式之一，铝诱导的神经细胞凋亡与AD的神经细胞凋亡相似，都是导致抑凋亡基因 bcl-2和促凋亡基因bax比值改变，诱发凋亡而致细胞死亡。2)AD患者脑中的铝含量与铝 染毒动物的脑铝含量均有升高，并主要发生在皮质和海马等与学习记忆有关的区域；在正 常人脑组织海马区铝的摩尔百分比是1. 6%，轻度AD患者为8. 1 %，重度AD患者为48. 4%。 人体的脑铝含量有随着年龄而增高的趋势，并伴有脑铝清除力的下降。动物实验证明，年老 动物对铝的吸收率较高，对铝的神经毒性作用也更易感。3)虽然存在多种AD动物模型，但 铝致AD模型较好地模拟了 AD的某些行为和病理特征；无论经何种方式给以铝化物，均可见 到动物认知功能损伤，行为学及病理学上出现类似于AD的改变。4)在铝暴露高的地区，AD 的发病率也较高。5)氧化损伤是AD发病的关键机制，铝在老年动物促进氧化损伤，体内、体 外试验都证实铝是氧化应激的肯定促发因素。3.神经递质学说。AD患者神经递质活动改变主要在海马、基底前脑核及大脑新皮 质区。多数学者认为主要与乙酰胆碱能系统改变有关，其次为5-羟色氨能系统等。4.免疫反应学说。可能是独立因素，也可能是与感染、遗传和环境中毒相关的继发因素，并提出与白细胞介素-1 (IL-I)、白细胞介素-6 (IL-6)等有关。5.慢病毒学说。6.雌激素水平下降。临床上AD患者主要表现为大脑认知功能障碍，如健忘、记忆力和空间辨别能力减 退以及反应迟钝等。关于AD的病理特征，目前较为明确的是1)基底前脑核群内乙酰胆碱 (Ach)能神经元的变性和丢失；2)患者脑内形成神经原纤维缠结；3)新皮质和海马结构内 出现大量的淀粉样沉积，其数量多寡与AD严重程度呈正相关。近年已从淀粉样沉积核心中 分离和鉴别出一种肽类物质，称为淀粉样肽(β-ΑΡ或β/Α4蛋白)。β-ΑΡ是β-淀 粉样前体蛋白(β-ΑΡΡ)的病理性裂解产物，正常情况下不表达，在正常老年人有极少量的 表达。4)脑内形成淀粉样斑块。这一病理改变是Trojanowski等人的最新发现，其与神经 原纤维缠结、淀粉样沉积一起为AD病人的三大特征性病理改变。由于AD疾病严重危害老年人的健康，同时也给家庭和社会带来巨大的财政负担， 因而关于AD疾病的研究日益受到国内外学者的高度重视。近年来，各国学者均在探讨制作 能较完全模拟人类AD临床表现和病理生理特征的动物模型，并通过这些模型研究有效的 干预方法。目前复制AD模型有多种方法，但每种建立AD模型的方法各有其优缺点。1.老年动物模型。可出现学习记忆减退，脑组织出现淀粉样斑块和NFT的病理改 变，这与AD病人是一致的。但存在以下缺点1)老年动物神经系统的发病与AD的发病过 程和机制不完全一致，因此神经化学方面的改变也是不同的；幻体质差，易死亡，故不宜用 于周期长的实验；3)对药物的吸收代谢不佳；4)价格昂贵。2.用物理方法——断开穹窿海马伞通路法建立的AD毁损模型。可以诱导实验动 物行为及神经化学方面的缺损，造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失，而 且制备周期短(约两周)，但手术定位难以控制，很难避免手术区邻近组织的受损。3.用神经毒氨基酸损毁基底大细胞核(nucleus basalis magnocellularis,NBM) 法制备乙酰胆碱(Ach)损毁AD模型。可导致NBM的胆碱能神经元变性和减少，继而引进相 应大脑新皮质区的胆碱能纤维减少，细胞变性与死亡，胆碱能的标志酶ChAT和AChE含量下 降，学习记忆行为减退。但有以下几个缺陷1)无神经炎斑及神经纤维缠结的组织病理学 改变；幻神经毒氨基酸对非胆碱能神经元也有影响；幻ChAT的活性在海马末受影响；4)据 报道神经毒氨基酸对乙酰胆碱系统的损伤可逆转力)业已证明AD病的基底核胆碱能神经 元的丧失是逆行性引起的，即继发于大脑皮层的病理变化。4.用 AF64A (Ethylcholine mustard aziridiniumion)制做的乙酰胆碱损毁 AD模 型。表现为胆碱能系统和记忆功能损害，但不影响非胆碱能神经元，这点优于兴奋性神经毒 氨基酸。然而用此方法也不出现老年斑和神经原纤维缠结形成的组织病理学改变。5.用192IgG-Sap0rin行大鼠侧脑室有前脑基底区注射制备免疫损毁AD模型。可 选择性损害与基底前脑核有关的乙酰胆碱系统，如内侧隔区、斜角带，同时出现记忆减退的 表现，但仍然不能出现AD所特有的其它组织病理学改变。6.喹啉酸在海马CAI区直接注射制备乙酰胆碱损毁AD模型。可引起大鼠空间辨 别能力和学习记忆障碍。但是它能否导致其它组织病理学改变未见文献报道。7.东莨菪碱注入小鼠、大鼠、猴等哺乳动物的侧脑室建立的乙酰胆碱损毁AD模型。主要是出现与AD—致的记忆、认知功能障碍，有关AD特有的组织病理学改变是否发生 未见文献报道。8.Αβ注射模型。将Αβ不同的片段Αβ 1-42或Αβ 1_40注入脑室或海马等部位， 大鼠、小鼠出现学习和记忆功能减退、胶质细胞炎性反应、SP等病理学特征。该模型基本模 拟了 AD学习记忆能力损害，海马神经元坏死或缺失，凋亡相关基因表达增加。缺点是注射 Αβ本身对脑组织产生局灶损伤，而且存在Aβ局部聚集的问题。9.铝中毒模型。对大鼠、小鼠用口服、脑室注射、灌胃、腹腔注射等方法均可以建 立铝中毒AD模型。铝对中枢神经系统有毒性损害，使神经元变性或死亡，产生NFT病理性 改变，继而表现为大脑皮质萎缩，脑重减轻；出现记忆、认知功能障碍。铝还能促进淀粉样蛋 白的形成和积累，在AD发病过程中发挥重要作用。用铝诱导建立的AD模型能较好模拟出 与AD有关的记忆损害和形态变化，但缺点是此种AD模型出现的NFT与AD病人略有差异， 再就是用铝造模周期比较长(口服约三个月)。10.转墓因动物模型。目前发现，与AD相关的基因有4个，即APP、ApoE ε 4、早老 素I(PSl)和早老素2 (PS2)，它们在AD的病因病理中起着重要作用。AD转基因动物模型目 前主要有APP转基因模型、PSl转基因模型、ApoE ε 4转基因模型、Tau蛋白转基因模型、双 重和三重转基因模型等。每种AD转基因动物模型都有自己独特的病理特征，同时通过对动 物模型的研究也可以给AD发病机制及神经病理特征及治疗的展望提供重要的理论依据。1)ΑΡΡ转基因模型Dewachterder等PDAPP转基因小鼠模型的建立以血小板源性生长因子(PDGF) 为引物，与人类APP小基因片段(含717位上的突变位点缬氨酸-苯丙氨酸)结合成PDAPP 基因，将此段基因以显微注射法导入小鼠受精卵中，植入假孕小鼠体内，产生的小鼠携带突 变基因，较好地模拟了老年斑的病理学改变。Αβ沉积部位以海马和皮层为主，其中以大片 段A β 1 42 (43)为多，星形胶质细胞反应性增生，营养不良性神经元增多，突触缺失，且老 年斑的密度随鼠龄的增加而增多。Games等用Val 717Phe突变构建了一个包含人类APP基 因全cDNA的杂交转基因，该基因的APP表达水平比标准cDNA高的多。Deng等以血小板源 性生长因子为引物，与人类带有Val 717Phe突变的APP基因片断结合成PDAPP基因，以显 微注射法导入小鼠受精卵中，移植到假孕雌鼠输卵管内，产生携带此突变基因的幼鼠即为 转基因鼠，能够高水平表达APP。运用弥散张量成像DTT技术观测到PDAPP鼠大脑灰质和 白质均有损害，且Αβ沉积量随年龄增长而逐渐增多。Moran等报道，APP 751转基因小鼠 (表达ΑΡΡ751)尤其在海马可显示早期AD样Αβ沉积和神经炎斑，且学习记忆能力明显减 退。Hsiao等构建的APP 695sw和APP 670/671转基因小鼠APP表达水平升高3 5倍，并 表现为与年龄相关的脑内Αβ沉积(主要分布在杏仁核、海马和皮层)，同时学习记忆减退。 这些转基因小鼠的培育成功，对研究调节Αβ产生和沉积的因素有非常重要的作用。Jeong 等建APPV717I-CT100转基因鼠模型并给与慢性免疫抑制处理，发现A β沉积增强，且加速 了学习和记忆功能的损伤。APPsw转基因小鼠模型的建立应用朊病毒启动子，含有2个突变基因的人类APP 基因(670位上赖氨酸-天冬氨酸；671位上蛋氨酸-亮氨酸)，将此片段基因以显微注射 法导入小鼠受精卵中，植入假孕小鼠体内，产生的小鼠即携带突变基因，在此种小鼠模型中 A β的生成量提高了 8 10倍，小胶质细胞在A β沉积部位活性明显增加。Frackowiak等在thy-Ι增强子调控下，将大量表达Swedish序列突变的β-APP基因(API^sw)按上述方法 转录到小鼠体内产生Tg 2576小鼠。此种小鼠脑血管平滑肌细胞所表达的β-APP大约是 生理水平的4倍，并包含了大量的Aβ 1 40和Αβ 1 42，形成细胞内Aβ免疫反应阳性 颗粒。这种大量表达APP基因的转基因鼠模型(PDAPP鼠)表现为神经细胞外硫黄素S阳 性的A β沉积，突触减少，胶质细胞增生，胆碱能神经末梢变异和大脑皮质神经元退行性改 变。2) PS转基因模型Masliah等将PDGF和人类PSl突变基因采用上述方法导入小鼠受精卵中，在新生 小鼠体内可见Αβ生成增多(主要是Αβ 42)，但并无Αβ沉积。此种模型仅适用于抑 制Αβ产生方面的研究。Cataldo等利用血小板源性生长因子β 2启动子促进神经元的表 达，构建了几种过度表达PSl的转基因鼠，发现表达突变型PSl可选择性地增加A β 42。制 作出伴有M146L或M146V的PSl基因突变转基因模型(制作方法同前)。这种模型通过选 择性增加Αβ 42/43的神经毒性和破坏细胞内Ca2+稳定性，促进神经元变性，从而导致AD发 病。并发现PS1、PS2复合突变基因模型较其他转基因模型加速了神经元溶酶体系统的病 变。Flood等将人类PSl突变基因导入小鼠受精卵中，制作了 FAD(familial early-onset AD)转基因动物模型，发现表达突变型PSl可选择性地增加A β 42表达和A β沉积，不伴有 APP增加。3) ApoE ε 4转基因模型已知ApoE ε 4能够与神经细胞外可溶性A β高亲和力结合，促进淀粉样斑块形成， 调节Tau蛋白磷酸化过程，促进细胞骨架瓦解和NFT形成。一些研究者采用人类基因组 ApoE ε 4的不同等位基因，通过动物自身启动子和3'增强子，将突变的ApoE ε 4基因通过 上述方法转录到小鼠体内构建完成ApoE ε 4转基因鼠模型。子代小鼠中存在大量老年斑， 胆碱乙酰转移酶活性明显降低。4)Tau蛋白转基因小鼠模型用人类Thy-I作为启动子，将带有表达人类Tau蛋白的基因注射到受精卵中，植入 假孕的母鼠体内，生产的小鼠带有此基因段。转基因小鼠Tau蛋白mRNA表达水平是内源性 的5倍，且发现与AD相似部位存在有过度磷酸化Tau蛋白。尽管未发现NFT，但此种模型 仍适合AD治疗药物的筛选，并为有NFT形成的转基因模型奠定基础。Schindowski等用人 类Thy-L 2作为启动子，在其G272V、P301S两个位置制成Tau蛋白突变基因，制成了新的 THY-Tau22转基因小鼠。THY_Tau22转基因小鼠不仅显示了 AD相关Tau蛋白抗原决定族 (AT8、AT100、AT180、AT270、12E8、tau_pSer396、AP422)的 Tau 蛋白过度磷酸化、神经纤维 缠结，还伴有明显星形胶质细胞的增多。THY-Tau22转基因小鼠也表现海马区的突触转运功 能的缺失和行为、记忆的改变。该模型成功的展示了 Tau蛋白引起的病理特征和神经纤维 缠结变性过程中的病理生理紊乱。5)双重、多重转基因模型与前述转基因模型相比，双重、多重转基因鼠能更全面的表达出AD的病理特征和 临床特征。为了探讨APP与PS间的相互作用，Samura等用APP和PSl两种突变基因制作 淀粉样蛋白沉积的转基因模型，发现突变型PSl对突变型APP转基因鼠的淀粉样蛋白β斑 块引起的和Tau蛋白的聚集形成有增强作用，并且加速了 Tau蛋白引起的神经纤维缠结。Gordon等构建了携带突变型APP、PSl转基因的双重转基因鼠，发现突变型PSl对突变型 APP转基因鼠的淀粉样蛋白β斑块形成有增强作用。Sadowski等也构建了携带突变型ΑΡΡ、 PSl转基因的双重转基因鼠，发现该模型能够很好的模拟AD的早期记忆功能损伤临床特征 和海马糖代谢的减低、神经元数目的减少病理生理机制的一致性。Dickey等用APP和PSl 两种突变基因制作淀粉样蛋白沉积的转基因模型，可模拟AD早期记忆功能障碍，且在A β 沉积区记忆形成相关基因的mRNA表达减少，但缺乏NFT的形成。Wirths等用APP和PSl两 种突变基因转基因鼠模型发现胞内不断升高的Αβ可以触发轴突病理改变——轴突肿胀和 髓鞘球样变结构形成，这种病理改变可以与Tau蛋白引起的病理改变无相关性。这一发现 也对典型的AD病理学，A β作为AD的首发触发剂，提出了质疑。Costa等通过使用APP和 PSl两种突变基因转基因鼠模型发现ApoE ε 4促进淀粉样蛋白β沉积的作用是促使了细丝 折叠样Αβ的形成，不是无形的Αβ形成，所以阻止ApoE ε 4对Αβ沉积作用也可能是对AD 的一项有效的治疗手段。Ribe等通过构建了携带突变型APP/Tau转基因的双重转基因鼠， 该模型发现边缘区有选择性的A β蛋白沉积、神经纤维缠结和大量神经元的丢失。Lewis等 通过构建了携带突变型APP/Tau转基因的双重转基因鼠，该模型发现边缘系统和嗅皮质区 明显出现NFT的病理改变。推测Αβ蛋白和Tau蛋白在转基因鼠病理过程中具有相互促进 的作用。总之，转基因AD鼠的脑病理变化与人类相似，可模拟AD的年龄依赖性老年斑的 形成、胶质细胞增生和突触减少等部分神经病理特征，并表现出与AD临床相似的行为学障 碍。转基因模型可以为淀粉样蛋白变性疾病和认知功能障碍的AD病提供动物模型，用于研 究AD的病因病理及抗AD药筛选有不可替代的作用。携带h-APP基因不同片段的转基因鼠 病变表现有很大差异，通过对比分析可阐明h-APP基因不同片段的生物学效应和h-APP过 度表达与β /Α4沉积的关系，为AD的早期预防寻找有效途径。培育转基因鼠是一项艰苦而细致的工程，对资金、实验室条件、研究者理论水平、 实践经验有较高的要求，实验前慎重考虑，周密设计，而且制作复杂，费用昂贵，一般实验室 不具备制作该模型的条件。AD是一种多基因疾病，尽管转基因模型是AD动物模型中的较理 想者，但转基因模型大部分只模拟了 AD的某一方面病理特征，而不能全面模拟AD发病。因 此，转基因动物模型尚有待进一步全面深入研究和发展。11.复合式动物模型。AD模型虽多，但只是模拟了该病的某些方面和特征。每种 建立AD模型的方法各有优缺点，迄今为止，尚无一客观、准确全面地再现、模拟、复制出AD 主要病理、生化及行为等方面全部特征的理想AD模型。制约了治疗AD的有效药物的开发 和应用，也影响了 AD基础研究的深化，这种矛盾已显得十分尖锐，现今已成为AD进一步研 究的障碍。因此，有必要开展多学科、多层次综合研究，继续深入探索，寻找一种公认的合理 的AD综合复制模型或AD全面复制模型，复合式动物模型较单一式动物模型更能反映AD的 特征，有利于促进AD病因学、病理学和治疗学研究的快速发展。腹腔注射D-半乳糖是我国学者最先报道的，用D-半乳糖120mg/kg和亚硝酸钠 90mg/kg腹腔联合注射，1次/d，连续60d，模型组小鼠的逃避潜伏期明显增加，出现触须脱 落及大脑皮层Αβ病理改变。有学者依据正交试验原理、联用ΙΒΑ、Αβ及D-半乳糖，发 现其可致大鼠记忆障碍，海马皮层锥体细胞数量明显减少，Alzheimer细胞增多及出现卫 星现象。有报道给鼠长期高胆固醇饮食，其大脑皮层Αβ注射点胆碱能纤维比对照组减少49.62%。但最新报道表明，血浆胆固醇水平与表达APP/PS1基因的小鼠Αβ 42水平并不成 正相关。在其他动物模型的基础上再予胆固醇饮食，也有可能成为一种比较理想的动物模 型。采用脑立体定位注射技术向海马注射缓激肽(BK)，海马区特定位点磷酸化的Tau蛋白 显色增强。还有学者以一种衰老模型为背景，添加各种干扰因素建立复合式动物模型。另 外，用高龄大鼠加左侧侧脑室一次性注射聚集态的A β 25-35建立AD大鼠模型，通过行为学 试验和脑组织病理检查等方法来研究这种复合式AD动物模型与人类AD也有一定的相似 度。综上所述，尽管目前已建立的AD动物模型多种多样，但均不能全面准确地反映AD 的特征。

发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中还没有最适宜的具有AD行为学和典型病理 学全部特征的AD动物模型的问题，提供一种AD复合动物模型的制备方法AD是一种多因素损伤引起的疾病，其致病因素无外乎遗传因素和环境因素两大 类。APP基因、早老素I(PSl)、早老素2 (PS2)是占AD 85%家族性痴呆的易感基因；铝是AD 病最重要的环境因素。基于此，本发明在仔细分析经典的单因素铝中毒模型和转基因动物 模型的基础上，综合两种模型的优点，并加以改进，将AD发病相关的已知环境因素铝与遗 传因素APP/PS1基因的作用相结合，期望制作出一种更贴近人类AD复杂病因，同时具有人 类AD特征的新的、理想的多因素AD动物模型。基于上述构思，本发明的AD复合动物模型制备方法是采用如下技术方案实现的取健康雄性APP/PS1双转基因小鼠，新鲜配制lmol/L AlCl3 ·6Η20溶液，高压灭菌 后通过腹腔注射染毒，染毒30次，每次0. 05mL。进一步地，本发明对APP/PS1双转基因小鼠的染毒期为60天，隔天注射 AlCl3 · 6H20溶液，并在间歇天肌内注射青链霉素以抗感染。优选地，本发明选用四月龄健康雄性APP/PS1双转基因小鼠。本发明采用铝中毒方法，对转入了 AD致病基因APP和PSl的小鼠腹腔注射 AlCl3 · 6H20，经神经行为学检测及形态学检测，可以较好地模拟AD的神经行为表现和具备 AD的全部典型形态学改变。复合模型动物较对照组动物学习记忆能力显著下降，具备老年 斑、神经原纤维缠结、淀粉样蛋白沉积和颗粒空泡变性等典型的形态学特征，从而在神经行 为学和病理组织学上较好地模拟了 AD的特征性改变。本发明所提供的AD复合模型动物不但可以用于药物筛选，也可以用于机制研究。


图1为C57BL/6J野生小鼠对照组HE染色(X 400)的光镜照片；图2为C57BL/6J野生小鼠染铝组HE染色(X 400)的光镜照片；图3为APP/PS1双转基因小鼠对照组HE染色(X 400)的光镜照片；图4为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组HE染色(X 400)的光镜照片；
图5为C57BL/6J野生小鼠对照组NFT染色(X 400)的光镜照片； 图6为C57BL/6J野生小鼠染铝组NFT染色(X 400)的光镜照片；
图7为APP/PS1双转基因小鼠对照组NFT染色(X 400)的光镜照片；图8为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组NFT染色(X 400)的光镜照片；图9为C57BL/6J野生小鼠对照组β -APP蛋白免疫组化染色(Χ400)的光镜照 片；图10为C57BL/6J野生小鼠染铝组β -APP蛋白免疫组化染色(Χ400)的光镜照 片；图11为APP/PS1双转基因小鼠对照组β _ΑΡΡ蛋白免疫组化染色(Χ400)的光镜 照片；图12为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组β -APP蛋白免疫组化染色(Χ400) 的光镜照片；图13为C57BL/6J野生小鼠对照组A β蛋白免疫组化染色(Χ400)的光镜照片；图14为C57BL/6J野生小鼠染铝组A β蛋白免疫组化染色(Χ400)的光镜照片；图15为APP/PS1双转基因小鼠对照组A β蛋白免疫组化染色(Χ400)的光镜照 片；图16为4 / 51双转基因小鼠40复合模型组4 0蛋白免疫组化染色(Χ400)的 光镜照片；图17为C57BL/6J野生小鼠对照组刚果红染色(X 400)的光镜照片；图18为C57BL/6J野生小鼠染铝组刚果红染色(X 400)的光镜照片；图19为APP/PS1双转基因小鼠对照组刚果红染色(Χ400)的光镜照片；图20为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组刚果红染色(Χ400)的光镜照片；图21为APP/PS1双转基因小鼠对照组DAPI染色(Χ400)的荧光照片；图22为APP/PS1双转基因小鼠染铝组TUNEL染色(Χ400)的荧光照片；图23为APP/PS1双转基因小鼠对照组两种染色Merge (X 400)的荧光照片；图M为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组DAPI染色(X400)的荧光照片；图25为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组TUNEL染色(X400)的荧光照片；图沈为APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组两种染色Merge (X 400)的荧光照 片。
具体实施例方式实施例1铝中毒APP/PS1双转基因小鼠动物复合模型的建立取健康雄性C57BL/6J小鼠和健康雄性APP/PS1双转基因小鼠(中科院动物所) 各16只，体重20 22g，活动能力相近。随机分为4组野生小鼠对照组、野生小鼠染铝组、 APP/PS1双转基因小鼠对照组、APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组，每组8只。新鲜配制lmol/L AlCl3 ·6Η20溶液，高压灭菌后通过腹腔注射染毒，染毒期60天， 0.05mL/d，隔天注射，60天内共计注射30次。在间歇天肌内注射青链霉素以抗感染。对照 组腹腔注射同等体积灭菌后的生理盐水，注射时间、次数及抗感染处理相同。整个染毒期间，动物室以自然节律采光，温度18 23 °C，湿度40 60 %，清洁、安 静。所有动物饲以普通饲料，自由饮水和进食。笼具、饮水瓶等所有用具均不使用含铝制品。实验操作在每天上午8 30 11 00完成。实施例2Morris水迷宫试验染毒结束后进行Morris水迷宫实验(Morris water maze, MWM)。Morris水迷宫 由一白色圆柱形水池和一可移动位置和调节高度的透明有机玻璃站台组成。圆形水池直径 100cm,高75cm，平台高度50cm，直径10cm，池壁由白色金属板组成。池内水深30cm，平台低 于水面1cm，水温22士2°C。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并 记录游泳轨迹。实验期间迷宫外参照物保持不变。定位航行实验(place navigation)小鼠连续接受4天训练，每天4次，每次间隔 20min，记录小鼠分别从四个不同象限入水点入水找到平台所需的时间，即逃避到平台上的 潜伏期(escaping latency)。4次潜伏期成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计。 如果小鼠在60s内未找到平台，其潜伏期按60s计算。空间搜索实验(spatial probe test)实验第5天撤除平台，从任一入水点将小 鼠面向池壁放入水中，记录60s内小鼠的游泳轨迹，观察分析小鼠停留目标象限的时间。结果表明，APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型组找到平台的潜伏期较对照组显著 增加(P < 0.01)，见表1。表1铝染毒APP/PS1双转基因小鼠AD复合模型神经行为学结果(〒士^ )
组别逃避潜伏期(S)原平台象限停留时间(S)野生小鼠对照组27.408 ± 6.09718.874 ± 1.895野生小鼠染铝组38.721 ± 5.408*9.613 + 2.011*双转基因小鼠对照组34.651 ±7.124*10.915 ± 1.474*双转基因小鼠AD复合模型组49.212 + 4.957*6.192 + 1.715** 与对照组相比，P < 0. Ol0实施例3组织切片的制备和常规HE染色染铝期结束后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，灌注固定，断头取脑，迅速将取出 的大脑皮质及海马组织固定于10%中性福尔马林缓冲液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石 蜡包埋，RM-2245型石蜡切片机切片，厚度5ym，60°C烤片12h后取片，常温保存，以进行常 规、特殊组织学染色备用。1)组织切片经二甲苯脱蜡2X IOmin ；2)无水乙醇去二甲苯2X 1 ^iiin ；3)95%, 80%、70%乙醇各&^11，自来水洗Imin ；4)苏木素染色:3min，自来水洗Imin ；5)1%盐酸酒 精分化20s，自来水洗Imin ；6) 1 %氨水返蓝30s，自来水洗Imin ；7)伊红染色15min，自来水 洗 Imin ；8)70%、80% 乙醇各 20s ；9) 95% 乙醇 2 X Imin ； 10)无水乙醇 2X2min ；11)中性树 胶封片；12)AX70 OLYMPUS光学显微镜观察、摄片。病理切片HEOfematoxylin-Eosin，苏木精-伊红)染色，光学显微镜下观察C57BL/6J野生小鼠大脑皮质神经元数量较多，神经元体积较大；核圆，核仁明显，细胞轮廓清晰(图1) ；C57BL/6J野生小鼠染铝、APP/PS1双转基因小鼠大脑皮质内神经元 体积变小，出现零散的严重损伤细胞，主要表现为细胞核呈固缩状，核周及胞浆空泡变性细 胞结构破坏以及细胞轮廓模糊(图2、图3)；染铝的APP/PS1双转基因小鼠神经细胞结构破 坏以及细胞轮廓模糊等病理改变更加明显(图4)。皮质神经元细胞颗粒空泡样变计数结果 显示两种模型内实验组与对照组相比差异有统计学意义(P < 0. 05)(见表2) ,C57BL/6J野 生小鼠与APP/PS1双转基因小鼠组间比较差异有统计学意义(P < 0. 05)(见表3)。表2脑组织皮质神经细胞颗粒空泡样变计数(J 士 S，η = 8)
权利要求
1.一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，其特征是取健康雄性APP/PS1双转基 因小鼠，新鲜配制lmol/L AlCl3 · 6H20溶液，高压灭菌后通过腹腔注射染毒，染毒30次，每 次 0. 05mLo
2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，其特征是对APP/ PSl双转基因小鼠的染毒期为60天，隔天注射AlCl3 · 6H20溶液，并在间歇天肌内注射青链 霉素以抗感染。
3.根据权利要求1或2所述的阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，其特征是选用 四月龄健康雄性APP/PS1双转基因小鼠。
全文摘要
本发明涉及一种阿尔茨海默病复合动物模型的制备方法，是取健康雄性APP/PS1双转基因小鼠，将1mol/LAlCl3·6H2O溶液腹腔注射染毒，染毒30次，每次0.05mL。采用本发明方法得到的阿尔茨海默病复合动物模型经神经行为学及形态学检测，较对照组动物学习记忆能力显著下降，具备老年斑、神经原纤维缠结、淀粉样蛋白沉积和颗粒空泡变性等典型的形态学特征，可以较好地模拟阿尔茨海默病的神经行为表现和具备阿尔茨海默病的全部典型形态学改变。本发明所提供的阿尔茨海默病复合动物模型可以用于药物筛选和阿尔茨海默病的机制研究。
文档编号A61K33/06GK102058619SQ20101058389
公开日2011年5月18日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者张勤丽, 教霞, 牛侨, 贾丽, 郭卫力 申请人:山西医科大学